תרביות פרוסות אורגנוטיפיות כמודלים פרה-קליניים של מיקרו-סביבה גידולית בסרטן לבלב ראשוני וגרורות

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הכנת תרביות פרוסות אורגנוטיפיות (OTSCs). טכניקה זו מאפשרת טיפוח ex vivo של רקמה רב-תאית שלמה. ניתן להשתמש ב-OTSCs באופן מיידי כדי לבדוק את התגובה המתאימה שלהם לתרופות בסביבה רב-תאית.

Abstract

מודלים פרה-קליניים מציאותיים של סרטן לבלב ראשוני וגרורות נחוצים בדחיפות כדי לבחון את תגובת הטיפול ex vivo ולהקל על טיפול מותאם אישית בחולה. עם זאת, היעדר מיקרו-סביבה ספציפית לגידול במודלים הנמצאים בשימוש כיום, כגון קווי תאים שמקורם במטופל וקסנוגרפטים, מאפשר רק תובנות ניבוי מוגבלות. תרביות פרוסות אורגנוטיפיות (OTSCs) מורכבות מרקמה רב-תאית שלמה, שניתן להשתמש בה במהירות לבדיקת תגובת תרופות מפוענחת מרחבית.

פרוטוקול זה מתאר את היצירה והטיפוח של פרוסות גידול בנות קיימא של סרטן הלבלב וגרורותיו. בקצרה, רקמה יצוקה באגרוז נמס נמוך ומאוחסן בחיץ איזוטוני קר. לאחר מכן, פרוסות רקמות בעובי 300 מיקרומטר נוצרות עם ויברטום. לאחר ההכנה, הפרוסות מתורבתות בממשק אוויר-נוזל באמצעות תוספות תרבית תאים ואמצעי גידול מתאים. במהלך הטיפוח ניתן לעקוב אחר שינויים בהתמיינות התאים ובכדאיות. בנוסף, טכניקה זו מאפשרת יישום של טיפול ברקמת גידול אנושית בת קיימא ex vivo וניתוחים במורד הזרם, כגון פרופיל שעתוק ופרופיל.

OTSCs מספקים הזדמנות ייחודית לבחון את תגובת הטיפול האישית ex vivo ולזהות פרופילים שעתוק ופרוטאומיים בודדים הקשורים לתגובה בהתאמה של פרוסות גידול נפרדות. ניתן להמשיך לחקור OTSCs כדי לזהות אסטרטגיות טיפוליות להתאמה אישית של הטיפול בסרטן לבלב ראשוני וגרורות.

Introduction

מודלים פרה-קליניים קיימים של אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC) וגרורות בהתאמה הם מנבאים גרועים של תגובה לטיפול בחולים, דבר המהווה חסרון משמעותי בפיתוח תרופות ובזיהוי סמנים ביולוגיים מנבאים¹. למרות שמודלים כגון אורגנואידים שמקורם במטופל וקסנוגרפטים שמקורם במטופל מבטיחים, השימוש בהם נותר מוגבל². המגבלות העיקריות של מודלים אלה במבחנה הן היעדר מיקרו-סביבה של הגידול וקסנוגרפטינג במינים מדוכאי חיסון שאינם אנושיים. במיוחד ב- PDAC והגרורות שלו, המיקרו-סביבה של הגידול זכתה להתעניינות רבה בשנים האחרונות בגלל תפקידיה המכריעים בביולוגיה של הגידול. הוא מורכב מרכיבים תאיים ואצלולריים, כגון (מיו-)פיברובלסטים, תאי סטלט הלבלב, תאי חיסון, כלי דם, מטריצה חוץ-תאית, ציטוקינים וגורמי גדילה³. מיקרו-סביבה זו אינה מרכיב גידולי שאינו מתפקד, אלא גורמת להתקדמות הגידול ולגרורות ונראה כי היא תורמת באופן משמעותי לעמידות לקרינה ולכימותרפיה⁴. המיקרו-סביבה PDAC לא רק פוגעת מכנית באספקת תרופות, אלא גם בעלת פעילות חיסונית ופעילות נבלות תרופות ^5,6,7. לפיכך, מודלים פרה-קליניים המשקפים את האינטראקציה המורכבת של תאי הגידול והמיקרו-סביבה של הגידול נדרשים בדחיפות כדי לבחון כראוי את תגובת הטיפול של החולים ex vivo ולהנחות טיפול קליני אינדיבידואלי.

תרביות Ex vivo של דגימות גידול טריות מייצגות קירוב קרוב של הגידול באתרו. תרביות פרוסות אורגנוטיפיות (OTSCs) פותחו ונחקרו לאחרונה עבור מספר גידולים, כגון סרטן הראש, הצוואר, השד, הערמונית, הריאות, המעי הגס והלבלב 8,9,10,11,12. הוכח כי OTSCs שומרים על המורפולוגיה הבסיסית שלהם, פעילות ההתרבות והמיקרו-סביבה שלהם במהלך הטיפוח לתקופה מוגדרת ותלויית רקמות 11,12,13. OTSCs של PDACs שמרו על הכדאיות שלהם, מורפולוגיה, ואת רוב המרכיבים של מיקרו-סביבה הגידול שלהם במשך 4-9 ימים במספר מחקרים במבחנה ^5,12,14. מבחינה פרספקטיבית, טכניקה זו מאפשרת יישום מיידי של הטיפול ברקמת גידול אנושית בת קיימא ex vivo וניתוחים במורד הזרם, כגון פרופיל של התמליל והפרוטאום.

הקמת OTSCs מספקת הזדמנות ייחודית לבחון את תגובת הטיפול ex vivo מיד לאחר הניתוח. לפיכך, OTSCs יאפשר באופן פרוספקטיבי לזהות אסטרטגיות טיפוליות כדי להתאים אישית את הטיפול במחלה גרורתית. פרוטוקול זה מתאר את הייצור והטיפוח של OTSCs קיימא של סרטן הלבלב.

Protocol

דגימות רקמות נאספו ועובדו לאחר אישור ועדת האתיקה המקומית של אוניברסיטת ליבק (# 16-281).

1. איסוף וטיפול ברקמות טריות

הערה: יש לטפל בזהירות בכל דגימת רקמה אנושית לא קבועה כדי למנוע את הסיכון לזיהום מפתוגנים הנישאים בדם. כל החולים צריכים להיבדק כדי להיות שליליים עבור HIV, HBV, ו- HCV לפני עיבוד רקמות. לבשו מעיל מגן וטפלו בדגימות רקמות אנושיות עם כפפות.

1. יש לאסוף דגימת רקמת PDAC טרייה, לא קבועה ולא קפואה בגודל מינימלי של 0.4 x 0.4 ס"מ מיד לאחר הניתוח ולהעביר את הדגימה למעבדה בתמיסת אחסון רקמות.
2. במידת האפשר, יש לעבד את הרקמה הטרייה באופן מיידי.
3. לחלופין, אחסנו רקמות בתמיסת אחסון רקמות על קרח רטוב בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה. עם זאת, אחסון רקמות עלול לגרום לפגיעה בכדאיות ובדרך כלל יש להימנע ממנו.

2. הכנה

1. הכנת אגרוז נמס נמוך
   1. הכינו 100 מ"ל של אגרוז בהתכה נמוכה (8%) על ידי המסת 8 גרם אגרוז ב-100 מ"ל של תמיסת רינגר שחוממה מראש ואחסנו אותה ב-4 מעלות צלזיוס עד לצורך.
   2. עם ההודעה על כריתת הגידול, ממיסים את האגרוז במיקרוגל.
   3. הכניסו את האגרוז לאמבט מים שחומם מראש (37°C) ואפשרו לו להתקרר לטמפרטורות פיזיולוגיות לפני ההכנה.
2. הגדרת Vibratome
   1. הכניסו סכין גילוח למחזיק הוויברטום ובצעו כוונון זווית אוטומטי בהתאם להוראות היצרן, אם רלוונטי.
   2. מצננים את המעיל של תא החיתוך באמצעות יחידת קירור או קרח רטוב.
   3. מלאו את תא החיתוך בכ-100 מ"ל של תמיסת חיתוך פיזיולוגית (למשל, תמיסת רינגר).
   4. הכניסו את סכין הגילוח המותקן לתמיסת החיתוך המצוננת מראש, ואפשרו לסכין הגילוח להתקרר.

3. שיבוץ רקמות באגרוז נמס נמוך

1. שטפו את דגימת הרקמה עם PBS מקורר (4 °C) והניחו את הרקמה ב- PBS על צלחת פטרי גדולה (~ 14 ס"מ) על קרח.
2. הסר רקמת חיבור עודפת נראית מקרוסקופית על קרח באמצעות אזמל מכיוון שהוא עלול לעכב את יעילות החיתוך.
3. מניחים את הרקמה לתוך צלחת פטרי קטנה (~ 3 ס"מ).
4. התאימו את כיוון הרקמה כך שלרקמת החיבור הנותרת הנראית לעין יש את אותו כיוון כמו המישור של תחתית צלחת הפטרי. החלק התחתון של צלחת פטרי יש את אותו כיוון כמו מטוס החיתוך.
5. יוצקים את האגרוז המוכן בהמסה נמוכה לתוך צלחת פטרי קטנה.
6. התאם מחדש את כיוון הרקמה, במידת הצורך, באמצעות מלקחיים.
7. הניחו את צלחת הפטרי על קרח רטוב להתקשות מהירה יותר של האגרוז.
8. בזהירות לחתוך את הרקמה באמצעות אזמל, משאיר לפחות 5 מ"מ סביב agarose בכל צד של הרקמה.
9. בזהירות להעביר את הרקמה המשובצת ולהדביק אותו על מחזיק הדגימה באמצעות דבק סופר.
10. לאחר מספר שניות, הכניסו את מחזיק הדגימה לתא החיתוך.
11. התאימו את כיוון הרקמה לכיוון סכין הגילוח, במידת הצורך.

4. חיתוך הרקמה המשובצת באגרוז באמצעות ויברטומה

1. הגדר את הגבולות החיצוניים של טווח החיתוך (ציר y) בהתאם לגודל דגימת הרקמה.
2. כוונן את הלהב לכיוון החלק העליון של בלוק הרקמה.
3. הגדר את מהירות החיתוך ל- 0.04 מ"מ לשנייה, משרעת חיתוך ל- 1 מ"מ ועובי פרוסה ל- 300 מיקרומטר.
4. חותכים בזהירות את הפרוסות הראשונות ומעבירים את הפרוסות למיכל נפרד עם תמיסת חיתוך מצוננת (4 מעלות צלזיוס) על קרח רטוב.

5. תרבות של תרביות פרוסות אורגנוטיפיות

1. הכינו צלחת 6 בארות עם 1 מ"ל של מדיום הטיפוח המתאים לכל באר.
   1. בינוני A: DMEM/F12 מתקדם, 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
   2. בינוני B: RPMI 1640, 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 4 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין, 8 נ"ג/מ"ל EGF, 0.3 מיקרוגרם/מ"ל הידרוקורטיזון.
      הערה: המדיום לתנאי תרבית אופטימליים עשוי להשתנות בהתאם לרקמה ולמטופל. הושוו שני אמצעי תרבית רקמה שונים, האחד מבוסס על DMEM/F12 (מדיום A), והשני מבוסס על RPMI (בינוני B). לא נמצאו הבדלים מהותיים בין אמצעי התקשורת הללו. עבור כל הניסויים המוצגים בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בתווך A.
2. הכניסו את צלחת 6 הקידוחים עם המדיום לאינקובטור, מה שמאפשר לטמפרטורה ול-pH להתאים את עצמם לפני הגידול.
3. הניחו פרוסות על תוספות תרבית תאים (לדוגמה, תוספות PTFE הידרופיליות בגודל נקבוביות של 0.4 מיקרומטר) באמצעות מסנן מבט.
4. הסר כל תמיסת חיתוך עודפת על ידי הנחת הפילטר הטעון על מטלית סטרילית.
5. מניחים את הפילטר הטעון בצלחת מוכנה בת 6 בארות. אל תוסיף אמצעי נוסף להוספה.
6. מניחים את צלחת 6 בארות באינקובטור (37 ° C, 5% CO₂).
7. שנה את המדיום כל יומיים על ידי חזרה על שלבים 5.1, 5.2 ו- 5.5 עם צלחת חדשה בעלת 6 בארות.
   הערה: תרביות פרוסות אורגנוטיפיות יכולות להיות מתורבתות לתקופות שונות בהתאם לשאלת המחקר הבודדת.

6. בדיקת כדאיות Resazurin

הערה: בדיקת הכדאיות של רזזורין מודדת פעילות מטבולית כללית של תרביות פרוסות אורגנוטיפיות בהתבסס על הפחתת רזזורין כחול שאינו פלואורסצנטי לרסורופין פלואורסצנטי אדום בתאים חיים¹⁵. לבדיקה אין השפעות רעילות על תאים וניתן ליישם אותה על התרביות שוב ושוב בהתאם לשאלת המחקר הבודדת. הכדאיות נמדדה באמצעות בדיקת רסזורין כל 2-3 ימים.

1. הכנת פתרון מלאי resazurin
   1. כבה את האור של מכסה המנוע הסטרילי, מכיוון שתמיסת מלאי רסזורין רגישה לאור.
   2. הכינו תמיסת ציר עם 10 מ"ג/מ"ל מלח נתרן רזזורין ב-1x PBS.
   3. אחסנו את תמיסת המלאי ב-aliquots מוגנים באור בטמפרטורה של 4°C במקרר עד לשימוש.
2. הערכת הכדאיות הכוללת של הפרוסה
   1. כבה את האור של מכסה המנוע הסטרילי, מכיוון שתמיסת מלאי רסזורין רגישה לאור.
   2. לדלל את פתרון מלאי resazurin 1:250 עם מדיום מתאים.
      הערה: המדיום המשמש לדילול צריך להיות זהה לזה המשמש לטיפוח (מדיום A או מדיום B).
   3. הכן 1 מ"ל של תמיסת resazurin הסופית לכל פרוסה ולהוסיף 1 מ"ל נוסף עבור הבקרה הריקה, למשל, עבור 6 פרוסות לדלל 28 μL של תמיסת מלאי resazurin ב 7 מ"ל של בינוני.
   4. מוציאים את תמיסת הרזזורין בצלחות 6 בארות, עם 1 מ"ל של תמיסת רזזורין מדוללת לכל באר.
   5. מעבירים את מסנני הטיפוח עם הפרוסות לבארות עם תמיסת רסזורין. באר אחת עם תמיסת resazurin נשמרת ריקה כמו שליטה ריקה.
      הערה: כדי לפשט את הליך הניסוי, ניתן לשלב שלב זה עם שינוי המדיום (שלב 5.7). עם זאת, במקרה שיש צורך במדידות כדאיות נוספות, ניתן לבצע את הבדיקה בכל עת במהלך טיפוח תרביות הפרוסות.
   6. מניחים את פרוסות הרקמה באינקובטור למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂.
   7. הכינו צלחות חדשות בנות 6 בארות עם מדיום התרבית אם ממשיכים בתרבית הפרוסות (ראו שלבים 5.1 ו-5.2).
   8. הסר את מסנני הטיפוח עם הפרוסות מתמיסת הרזזורין והסר את התמיסה העודפת על ידי הנחת הפילטר הטעון על מטלית סטרילית.
   9. מעבירים את מסנני הטיפוח עם הפרוסות לצלחת התרבית שהוכנה מראש.
   10. מכל 6-באר, לקחת 100 μL של פתרון resazurin ולהעביר אותו על צלחת 96 באר. מבקרה ריקה, מקם שלוש דגימות (3 x 100 μL) בבארות נפרדות של צלחת 96 בארות.
   11. כמת את ההכחדה באמצעות פוטומטר צלחת בהתאם להוראות היצרן. אורך גל עירור מוגדר ל- 545 ננומטר ואורך גל הפליטה מוגדר ל- 600 ננומטר.

7. קיבוע פורמלין והטמעת פרפין של OTSCs

1. מעבירים בזהירות את פרוסות הרקמה המתורבתות לקסטת הטבעה מפלסטיק. לשם כך, בצע את השלבים הבאים.
   1. מניחים את מסנן הטיפוח עם הפרוסה המותקנת על צלחת פטרי.
   2. בעזרת אזמל, חותכים בזהירות את קרום המסנן עם פרוסת הרקמה המותקנת.
   3. מעבירים בזהירות את קרום המסנן עם הפרוסה המותקנת לשקית ניילון ביופסיה ומניחים אותה בקלטת הטבעה.
   4. לאחר מכן מעבירים קלטות הטבעה מפלסטיק במיכל עם פורמלין 4.5% מקורר מראש (4°C). ניתן לשמור את הפרוסות בתמיסת פורמלין בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף, אך יש לדגור עליהן למשך 24 שעות לפחות.
      הערה: OTSCs צריכים להיות מועברים בזהירות רבה כפי שהם נקרעים בקלות.
2. שטפו בזהירות את תרבית הפרוסה הקבועה בפורמלין במי ברז זורמים במשך שעה וחצי.
3. יש לייבש את פרוסת הרקמה הקבועה בפורמלין על ידי דגירה באתנול 70% (2x למשך 3 שעות), 95% אתנול (1x ללילה, 1x למשך 3 שעות), ולאחר מכן אתנול מוחלט (1x למשך 3 שעות, 1x ללילה).
4. מנקים את פרוסת הרקמה הקבועה בפורמלין בדגירה של 3 שעות בקסילן פעמיים.
5. לטבול את הרקמה עם פרפין ב 60 ° C (1x ללילה, 1x במשך 2 שעות). הטמיעו את הרקמה בגוש פרפין בתבנית הטבעה של רקמות.
6. חתכו את גוש הרקמה המשובצת בפרפין בעובי 4 מיקרומטר עם מיקרוטום וצפים באמבט מים של 40 מעלות צלזיוס המכיל מים מזוקקים. העבירו את המקטעים לשקופיות זכוכית.
7. לדגור על חלקי פרפין במשך שעה אחת ב 60 ° C כדי לקשור את הרקמה לזכוכית. לדגור את המגלשות לילה ב 37 °C (77 °F).

8. צביעת המטוקסילין ואוזין (H&E)

1. פירוק מקטעים משלב 7.7 על ידי דגירה בקסילן (3x למשך 5 דקות).
2. יש להחזיר את ההידרציה על ידי דגירה באלכוהול מוחלט (2x למשך 5 דקות), 95% אלכוהול (2x למשך 5 דקות) ו-70% אלכוהול (1x למשך 5 דקות). יש לשטוף לזמן קצר במים מזוקקים.
3. מכתימים בתמיסת המטוקסילין של מאייר למשך 5 דקות. יש לשטוף במי ברז זורמים במשך 10 דקות.
4. כתם נגדי בתמיסת אאוסין 0.5% למשך 40 שניות. יש לשטוף במים מזוקקים.
5. יש לייבש על ידי דגירה ב-70% אלכוהול (מקסימום דקה), 95% אתנול (2x למשך 3 דקות) ואלכוהול מוחלט (2x למשך 3 דקות), בהתאמה.
6. נקה בשלושה שינויים של קסילן (כמה שניות כל אחד). הניחו טיפה של אמצעי הרכבה וכסו את המגלשות בכיסוי.

9. אימונוהיסטוכימיה של OTSCs

1. יש לנטרל מקטעים על ידי דגירה בקסילן 2x למשך 10 דקות, ולאחר מכן 1:1 אתנול/קסילול למשך 10 דקות.
2. העבר שקופיות ל-100% אתנול (2x למשך 3 דקות), 96% אתנול (2x למשך 3 דקות), 70% אתנול (1x למשך 3 דקות) ולאחר מכן ל-50% אתנול (1x למשך 3 דקות).
3. בצע אחזור אנטיגן כדי לחשוף את האפיטופ האנטיגני. חממו את המגלשות במיקרוגל במאגר ציטראט במשך 5 דקות ב-900 ואט, ולאחר מכן פעמיים במשך 8 דקות ב-600 ואט. תנו למגלשות להתקרר לטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
4. יש לשטוף ב-PBS 3 פעמים במשך 3 דקות על שייקר.
5. בצע חדירה של קרום התא על ידי דגירה ב 0.1% Triton X-100 ב PBS (200 μL לכל שקופיות) בתא לח בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
6. יש לשטוף ב-PBS לשלושה שינויים, 3 דקות כל אחד על השייקר.
7. יש לדגור על מקטעים עם תמיסת 3% H₂O₂ במתנול (200 מיקרוליטר למגלשה) בתא לח בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי לחסום פעילות פרוקסידאז אנדוגני.
8. יש לשטוף ב-PBS 3 פעמים במשך 3 דקות על שייקר.
9. הוסף 200 μL של חיץ חוסם (1:50 נסיוב סוס ב- PBS) ודגור בתא לח בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות.
10. נקז את מאגר החסימה מהשקופיות על-ידי הטיית השקופית על ממחטת נייר.
11. יש למרוח 200 μL של נוגדן ראשוני מדולל כראוי בנוגדן מדלל על המגלשות ולדגור בתא לח ב 4 ° C למשך הלילה. כבקרה שלילית, השתמש באיזופורם מתאים של אימונוגלובולינים של עכברים באותו דילול כמו הנוגדן הראשי.
12. יש לכבס 3 פעמים במשך 3 דקות ב-PBS על שייקר.
13. יש למרוח 200 μL של נוגדן משני ביוטינילציה (תמיסה 1:50 ב-PBS) על המגלשות ולדגור בתא לח בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
14. יש לכבס 3 פעמים במשך 3 דקות ב-PBS על שייקר.
15. הכינו את קומפלקס הפרוקסידז על בסיס אבידין/ביוטין בהתאם להוראות היצרן לפני היישום. יש למרוח 200 μL של קומפלקס אבידין-ביוטין-פרוקסידאז על המגלשות ולדגור בתא לח בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
16. יש לכבס 3 פעמים במשך 3 דקות ב-PBS על שייקר.
17. יש למרוח 200 μL של תמיסת מצע DAB (מיוצרת ישירות לפני השימוש: טיפה אחת של DAB ב-1 מ"ל של מצע), 200 μL לכל שקופית. אפשר את התפתחות הצבע 1-3 דקות עד שתגיע לעוצמת הצבע הרצויה.
18. יש לשטוף במי ברז זורמים במשך 10 דקות.
19. מכתימים את המגלשות על ידי טבילת הצדדים בהמטוקסילין למשך 5 דקות.
20. יש לשטוף במי ברז זורמים במשך 10 דקות.
21. כסו את השקופיות באמצעות אמצעי הרכבה מימיים וכיסויים. ניתן לאחסן את המגלשות המותקנות בטמפרטורת החדר לצמיתות.

תוצאות

איור 1 מספק סקירה כללית של זרימת העבודה לתרבית OTSCs מרקמת גידול טרייה ולא קפואה. דגימות של PDAC ראשוני וגרורות נאספו מיד לאחר כריתה כירורגית ואוחסנו במשך הלילה על קרח רטוב ב -4 מעלות צלזיוס בתמיסת אחסון הרקמות. הדגימות עובדו, והפרוסות תורבתו כמתואר בפרוטוקול. המורפולוגיה המקרו?...

Discussion

OTSCs של דגימות גידול טרי הם קירוב קרוב של הגידול באתרו. הם שומרים על המורפולוגיה הבסיסית שלהם, פעילות ההתרבות והמיקרו-סביבה שלהם במהלך הטיפוח לתקופה מוגדרת ותלויית רקמות 11,12,13. טכניקה זו מאפשרת יישום מיידי של הטיפול ברקמת גידול אנושית ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F-12 Medium	Gibco	12634028
Agarose Low Melt	Roth	6351.2	8% in Ringer solution
Antibody Diluent, Background Reducing	Dako	S3022
AquaTex	Merck	108562
Bioethanol (99%, denatured)	CHEMSolute	2,21,19,010
Citric Acid monohydrate	Sigma Aldrich	C7129
Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb	Cell Signalling Technology	9664	1:400 dilution
Derby Extra Double Edge Safety Razor Blades	Derby Tokai
Embedding cassettes	Roth	H579.1
Eosin Y-solution 0,5% aqueous	Merck	10,98,44,100
Eukitt Quick hardening mounting medium	Sigma-Aldrich	3989
Fetal bovine serum	Gibco	10270106
Formaldehyde solution 4,5%, buffered	Büfa Chemikalien	B211101000
Hem alum solution acid acc. to Mayer	Roth	T865
Human EGF	Milteniy Biotec	130-097-794
Hydrocortisone	Sigma Aldrich (Merck)	H0888
Hydrogen peroxide 30%	Merck	1,08,59,71,000
Insulin human	Sigma Aldrich (Merck)	12643
Liquid DAB+ Substrate Chromogen System	Dako	K3468
MACS Tissue Storage Solution	Milteniy Biotech	130-100-008
Methanol	Merck	10.600.092.500
Microscope Slides Superfrost Plus	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm	Millipore (Merck)	PICM0RG50
Monoclonal mouse anti-human  Cytokeratin 7 (Clone OV-TL 12/30)	Dako	M7018	1:200 dilution
Monoclonal mouse anti-human Ki67 Clone MIB-1	Dako	M7240	1:200 dilution
Monoclonal mouse Anti-vimentin (Clone V9)	Dako	M0725	1:200 dilution
Negative control Mouse IgG2a	Dako	X0943	1:200 dilution
Negative control Mouse IgG1	Dako	X093101-2	1:200 dilution
Paraffin (melting temperature 56°- 58°)	Merck	10,73,37,100
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Gibco	15140122
PBS pH 7,4 (1x) Flow Cytometry Grade	Gibco	A12860301
Resazurin sodium salt; 10 mg/ml in PBS	Sigma Aldrich	R7017	1:250 dilution
Ringer's solution	Fresenius Kabi	2610813
RPMI-1640 Medium	Sigma Aldrich (Merck)	R8758
Tissue culture testplate 6	TPP	92006
Triton X-100	Sigma Aldrich	9002-93-1
VECTASTAIN Elite ABC-Peroxidase Kit	Vector Laboratories	PK-6200
Xylene (extra pure)	J.T.Baker	8,11,85,000
Equipment
ClarioStar Microplate Reader	BMG Labtech
Paraffin Embedding Center E61110	Leica
Rotary Microtome Microm HM355S	Thermo Scientific
Section Transfer System Microm STS	Thermo Scientific
VT 1200S Vibratom	Leica