Primer Pankreas Kanseri ve Metastazında Tümör Mikroçevresinin Preklinik Modelleri Olarak Organotipik Dilim Kültürleri

Özet

Bu protokol, organotipik dilim kültürlerinin (OTSC'ler) hazırlanmasını tanımlar. Bu teknik, sağlam çok hücreli dokunun ex vivo olarak yetiştirilmesini kolaylaştırır. OTSC'ler, çok hücreli bir ortamda ilaçlara karşı ilgili yanıtlarını test etmek için hemen kullanılabilir.

Özet

Primer pankreas kanseri ve metastazın gerçekçi preklinik modellerine, tedavi yanıtını ex vivo olarak test etmek ve kişiselleştirilmiş hasta tedavisini kolaylaştırmak için acilen ihtiyaç duyulmaktadır. Bununla birlikte, şu anda kullanılan modellerde, örneğin hastadan türetilen hücre dizileri ve ksenogreftlerde tümöre özgü mikro ortamın olmaması, yalnızca sınırlı öngörücü içgörülere izin verir. Organotipik dilim kültürleri (OTSC'ler), uzamsal olarak çözülmüş ilaç yanıt testi için hızlı bir şekilde kullanılabilen sağlam çok hücreli doku içerir.

Bu protokol, pankreas kanserinin canlı tümör dilimlerinin oluşturulmasını ve yetiştirilmesini ve metastazını tanımlar. Kısaca doku, düşük eriyik agaroz içinde dökülür ve soğuk izotonik tamponda saklanır. Daha sonra, bir vibratom ile 300 μm kalınlığında doku dilimleri oluşturulur. Hazırlandıktan sonra dilimler, hücre kültürü ekleri ve uygun bir yetiştirme ortamı kullanılarak bir hava-sıvı arayüzünde kültürlenir. Yetiştirme sırasında, hücre farklılaşması ve canlılığındaki değişiklikler izlenebilir. Ek olarak, bu teknik, tedavinin canlı insan tümör dokusuna ex vivo olarak uygulanmasını ve ardından transkriptom ve proteom profili oluşturma gibi aşağı akış analizlerini mümkün kılar.

OTSC'ler, bireysel tedavi yanıtını ex vivo test etmek ve bir tümörün farklı dilimlerinin ilgili yanıtı ile ilişkili bireysel transkriptomik ve proteomik profilleri tanımlamak için eşsiz bir fırsat sağlar. Primer pankreas kanseri ve metastaz tedavisini kişiselleştirmek için terapötik stratejileri belirlemek için OTSC'ler daha fazla araştırılabilir.

Giriş

Pankreatik duktal adenokarsinom (PDAC) ve ilgili metastazların mevcut preklinik modelleri, hastalarda tedaviye yanıtın zayıf belirleyicileridir, bu da ilaç geliştirmede ve prediktif biyobelirteçlerin tanımlanmasında önemli bir eksikliktir¹. Hasta kaynaklı organoidler ve hasta kaynaklı ksenogreftler gibi modeller umut verici olsa da, kullanımları sınırlı kalmaktadır². Bu in vitro modellerin başlıca sınırlamaları, insan bağışıklığı baskılanmış olmayan türlerde tümör mikroçevresinin ve ksenogreftlemenin olmamasıdır. Özellikle PDAC ve metastazlarında, tümör mikroçevresi, tümör biyolojisindeki önemli işlevleri nedeniyle son yıllarda önemli ölçüde ilgi görmüştür. (miyo-) fibroblastlar, pankreas yıldız hücreleri, bağışıklık hücreleri, kan damarları, hücre dışı matriks, sitokinler ve büyüme faktörleri gibi hücresel ve hücresel olmayan bileşenleri içerir³. Bu mikroçevre, fonksiyonel olmayan bir tümör bileşeni değildir, ancak tümör ilerlemesini ve metastazı indükler ve radyo ve kemoterapi direncine önemli ölçüde katkıda bulunuyor gibi görünmektedir⁴. PDAC mikro çevresi sadece ilaç dağıtımını mekanik olarak tehlikeye atmakla kalmaz, aynı zamanda bağışıklık ve ilaç süpürücü aktiviteye^{de sahiptir 5,6,7}. Bu nedenle, hastaların tedavi yanıtını ex vivo olarak yeterince test etmek ve bireyselleştirilmiş klinik tedaviye rehberlik etmek için tümör hücrelerinin ve tümör mikroçevresinin karmaşık etkileşimini yansıtan preklinik modellere acilen ihtiyaç duyulmaktadır.

Taze tümör örneklerinin ex vivo kültürleri, in situ tümörün yakın bir yaklaşımını temsil eder. Organotipik dilim kültürleri (OTSC'ler) yakın zamanda baş, boyun, meme, prostat, akciğer, kolon ve pankreas kanserleri gibi çeşitli tümörler için geliştirilmiş ve incelenmiştir 8,9,10,11,12. OTSC'lerin, tanımlanmış, dokuya bağlı bir süre boyunca yetiştirme sırasında temel morfolojilerini, proliferatif aktivitelerini ve mikro çevrelerini korudukları gösterilmiştir 11,12,13. PDAC'lerin OTSC'leri, çeşitli in vitro çalışmalarda^4-9 gün boyunca canlılıklarını, morfolojilerini ve tümör mikroçevrelerinin çoğu bileşenini korumuştur ^5,12,14. Perspektif olarak, bu teknik, tedavinin ex vivo olarak canlı insan tümör dokusuna anında uygulanmasını ve ardından transkriptom ve proteomun profillenmesi gibi aşağı akış analizlerini mümkün kılar.

OTSC'lerin kurulması, ameliyattan hemen sonra tedavi yanıtını ex vivo olarak test etmek için eşsiz bir fırsat sağlar. Bu nedenle, OTSC'ler prospektif olarak metastatik hastalığın tedavisini kişiselleştirmek için terapötik stratejilerin belirlenmesine izin verecektir. Bu protokol, pankreas kanserinin canlı OTSC'lerinin üretilmesini ve yetiştirilmesini tanımlar.

Protokol

Doku örnekleri, Lübeck Üniversitesi'nin yerel etik komitesi tarafından onaylandıktan sonra toplandı ve işlendi (# 16-281).

1. Taze doku toplama ve taşıma

NOT: Kan yoluyla bulaşan patojenlerden kaynaklanan enfeksiyon riskini önlemek için sabitlenmemiş her insan dokusu örneği dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Doku işlemeden önce tüm hastalar HIV, HBV ve HCV için negatif olarak test edilmelidir. Koruyucu bir ceket giyin ve insan dokusu örneklerini eldivenlerle tutun.

1. Ameliyattan hemen sonra minimum 0,4 x 0,4 cm boyutunda taze, sabitlenmemiş ve dondurulmamış PDAC doku örneğini toplayın ve örneği bir doku saklama solüsyonunda laboratuvara taşıyın.
2. Mümkün olduğunda, taze dokuyu hemen işleyin.
3. Alternatif olarak, dokuları gece boyunca 4 ° C'de ıslak buz üzerinde doku saklama solüsyonunda saklayın. Bununla birlikte, doku depolaması canlılığın bozulmasına neden olabilir ve genellikle bundan kaçınılmalıdır.

2. Hazırlık

1. Düşük erime noktalı agaroz hazırlama
   1. 8 g agarozu 100 mL önceden ısıtılmış Ringer solüsyonunda çözerek 100 mL düşük erime noktalı agaroz (%8) hazırlayın ve ihtiyaç duyulana kadar 4 °C'de saklayın.
   2. Tümör rezeksiyonu duyurulduktan sonra, agarozu bir mikrodalgada eritin.
   3. Agarozu önceden ısıtılmış bir su banyosuna (37 °C) yerleştirin ve hazırlamadan önce fizyolojik sıcaklıklara soğumasını bekleyin.
2. Vibratom kurulumu
   1. Vibratom tutucusuna bir tıraş bıçağı yerleştirin ve varsa üreticinin talimatlarına göre otomatik bir açı ayarı yapın.
   2. Bir soğutma ünitesi veya ıslak buz kullanarak kesme odasının ceketini soğutun.
   3. Kesme haznesini yaklaşık 100 mL fizyolojik bir kesme solüsyonu (örn. Ringer solüsyonu) ile doldurun.
   4. Monte edilmiş tıraş bıçağını önceden soğutulmuş kesme solüsyonuna yerleştirin ve tıraş bıçağının soğumasını bekleyin.

3. Düşük erime noktalı agarozda doku gömülmesi

1. Doku örneğini soğutulmuş (4 ° C) PBS ile yıkayın ve dokuyu PBS'ye buz üzerinde büyük (~ 14 cm) bir Petri kabına yerleştirin.
2. Kesme verimliliğini engelleyebileceğinden, makroskopik olarak görülebilen fazla bağ dokusunu bir neşter kullanarak buz üzerinde çıkarın.
3. Dokuyu küçük bir Petri kabına (~ 3 cm) yerleştirin.
4. Doku yönünü, makroskopik olarak görünür kalan bağ dokusu, Petri kabının alt düzlemi ile aynı yönelime sahip olacak şekilde ayarlayın. Petri kabının alt kısmı, kesme düzlemi ile aynı yöne sahiptir.
5. Hazırlanan düşük erime noktalı agarozu küçük Petri kabına dökün.
6. Gerekirse, forseps kullanarak dokunun yönünü yeniden ayarlayın.
7. Agarozun daha hızlı sertleşmesi için Petri kabını ıslak buzun üzerine yerleştirin.
8. Dokuyu bir neşter kullanarak dikkatlice kesin ve dokunun her iki tarafında en az 5 mm çevreleyen agaroz bırakın.
9. Gömülü dokuyu dikkatlice aktarın ve süper yapıştırıcı kullanarak numune tutucuya yapıştırın.
10. Birkaç saniye sonra numune tutucuyu kesme haznesine yerleştirin.
11. Gerekirse, dokunun yönünü tıraş bıçağına doğru ayarlayın.

4. Agaroz gömülü dokunun vibratom kullanılarak dilimlenmesi

1. Doku örneğinin boyutuna göre kesme aralığının (y ekseni) dış sınırlarını tanımlayın.
2. Bıçağı doku bloğunun üst kısmına doğru ayarlayın.
3. Kesme hızını 0,04 mm/sn'ye, kesme genliğini 1 mm'ye ve dilim kalınlığını 300 μm'ye ayarlayın.
4. İlk dilimleri dikkatlice kesin ve dilimleri ıslak buz üzerinde önceden soğutulmuş (4 °C) kesme solüsyonu ile ayrı bir kaba aktarın.

5. Organotipik dilim kültürlerin kültürü

1. Kuyu başına 1 mL uygun yetiştirme ortamı içeren 6 oyuklu bir plaka hazırlayın.
   1. Orta A: İleri DMEM/F12, %10 FBS, %1 Penisilin/Streptomisin.
   2. Orta B: RPMI 1640, %10 FBS, %1 Penisilin/Streptomisin, 4 μg/mL İnsülin, 8 ng/mL EGF, 0.3 μg/mL hidrokortizon.
      NOT: Optimal kültür koşulları için ortam, dokuya ve hastaya bağlı olarak değişebilir. Biri DMEM/F12'ye (orta A), ikincisi RPMI'ye (orta B) dayalı olmak üzere iki farklı doku kültürü ortamı karşılaştırıldı. Bu ortamlar arasında önemli bir fark tespit edilmedi. Bu protokolde gösterilen tüm deneyler için ortam A kullanılmıştır.
2. 6 oyuklu plakayı ortamla birlikte bir inkübatöre yerleştirin ve ekimden önce sıcaklık ve pH'ın ayarlanmasına izin verin.
3. Dilimleri, bir bakış filtresi kullanarak hücre kültürü eklerine (örneğin, 0,4 μm gözenek boyutuna sahip hidrofilik PTFE ekler) yerleştirin.
4. Yüklenen filtreyi steril bir beze yerleştirerek fazla kesme solüsyonunu çıkarın.
5. Yüklenen filtreyi hazırlanan 6 oyuklu plakaya yerleştirin. Ek parçaya herhangi bir ek ortam eklemeyin.
6. 6 oyuklu plakayı bir inkübatöre yerleştirin (37 °C,% 5 CO₂).
7. 5.1, 5.2 ve 5.5 adımlarını yeni bir 6 oyuklu plaka ile tekrarlayarak ortamı her 2 günde bir değiştirin.
   NOT: Organotipik dilim kültürleri, bireysel araştırma sorusuna bağlı olarak çeşitli süreler boyunca kültürlenebilir.

6. Resazurin canlılık testi

NOT: Resazorin canlılık testi, canlı hücrelerde floresan olmayan mavi resazurinin kırmızı floresan resorufin'e indirgenmesine dayalı olarak organotipik dilim kültürlerinin genel metabolik aktivitesini ölçer¹⁵. Testin hücreler üzerinde toksik etkisi yoktur ve bireysel araştırma sorusuna bağlı olarak kültürlere tekrar tekrar uygulanabilir. Canlılık, her 2-3 günde bir resazurin testi kullanılarak ölçüldü.

1. Resazorin stok çözeltisinin hazırlanması
   1. Steril davlumbazın ışığını kapatın, çünkü resazurin stok çözeltisi ışığa duyarlıdır.
   2. 1x PBS'de 10 mg / mL resazurin sodyum tuzu içeren bir stok çözeltisi hazırlayın.
   3. Stok solüsyonunu kullanılana kadar buzdolabında 4 °C'de ışık korumalı alikotlarda saklayın.
2. Genel dilim canlılığının değerlendirilmesi
   1. Steril davlumbazın ışığını kapatın, çünkü resazurin stok çözeltisi ışığa duyarlıdır.
   2. Resazorin stok çözeltisini 1:250 uygun bir ortamla seyreltin.
      NOT: Seyreltme için kullanılan ortam, yetiştirme için kullanılanla aynı olmalıdır (orta A veya orta B).
   3. Dilim başına 1 mL nihai resazurin çözeltisi hazırlayın ve boş kontrol için 1 mL daha ekleyin, ör. 6 dilim için 28 μL resazurin stok çözeltisini 7 mL ortamda seyreltin.
   4. Resazorin çözeltisini, oyuk başına 1 mL seyreltilmiş resazurin çözeltisi ile 6 oyuklu plakalara dağıtın.
   5. Yetiştirme filtrelerini dilimlerle birlikte resazurin çözeltisi ile kuyulara aktarın. Resazorin çözeltisi ile bir kuyu boş kontrol olarak boş tutulur.
      NOT: Deneysel prosedürü basitleştirmek için, bu adım ortamın değiştirilmesiyle birleştirilebilir (adım 5.7). Bununla birlikte, ek canlılık ölçümlerine ihtiyaç duyulması durumunda, tahlil, dilim kültürlerinin yetiştirilmesi sırasında herhangi bir zamanda yapılabilir.
   6. Doku dilimlerini 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de 1 saat boyunca bir inkübatöre yerleştirin.
   7. Dilim kültürüne devam edilirse, kültür ortamı ile yeni 6 oyuklu plakalar hazırlayın (bkz. adım 5.1 ve 5.2).
   8. Yetiştirme filtrelerini dilimlerle birlikte resazurin solüsyonundan çıkarın ve yüklü filtreyi steril bir beze yerleştirerek fazla solüsyonu çıkarın.
   9. Yetiştirme filtrelerini dilimlerle birlikte önceden hazırlanmış kültür plakasına aktarın.
   10. Her 6 oyuktan 100 μL resazurin çözeltisi alın ve 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Boş kontrolden, 96 oyuklu plakanın ayrı kuyucuklarına üç numune (3 x 100 μL) yerleştirin.
   11. Üreticinin talimatlarına göre bir plaka fotometre ile sönmeyi ölçün. Uyarma dalga boyu 545 nm'ye ve emisyon dalga boyu 600 nm'ye ayarlanmıştır.

7. OTSC'lerin formalin fiksasyonu ve parafin gömülmesi

1. Ekili doku dilimlerini dikkatli bir şekilde plastik bir gömme kasetine aktarın. Bunu yapmak için aşağıdaki adımları izleyin.
   1. Yetiştirme filtresini monte edilmiş dilimle birlikte bir Petri kabına yerleştirin.
   2. Bir neşter ile, filtre zarını monte edilmiş doku dilimi ile dikkatlice kesin.
   3. Filtre membranını monte edilmiş dilimle birlikte dikkatlice bir biyopsi naylon torbasına aktarın ve bir gömme kasetine yerleştirin.
   4. Daha sonra, plastik gömme kasetlerini önceden soğutulmuş (4 ° C)% 4.5 formalin içeren bir kaba aktarın. Dilimler, daha fazla kullanılana kadar 4 ° C'de formalin çözeltisi içinde tutulabilir, ancak en az 24 saat inkübe edilmelidir.
      NOT: OTSC'lerin kolayca parçalandıkları için çok dikkatli bir şekilde aktarılması gerekir.
2. Formalinle sabitlenmiş dilim kültürünü 1,5 saat boyunca akan musluk suyuyla dikkatlice durulayın.
3. Formalinle sabitlenmiş doku dilimini %70 etanol (3 saat için 2x), %95 etanol (gece boyunca 1x, 3 saat için 1x) ve ardından mutlak etanol (3 saat için 1x, gece boyunca 1x) içinde inkübe ederek dehidre edin.
4. Formalinle sabitlenmiş doku dilimini iki kez ksilen içinde 3 saat inkübasyon ile temizleyin.
5. Dokuyu 60 ° C'de parafin ile daldırın (gece boyunca 1 kez, 2 saat boyunca 1 kez). Dokuyu bir parafin bloğuna, bir doku gömme kalıbına gömün.
6. Parafine gömülü doku bloğunu 4 μm kalınlığında bir mikrotom ile bölümlere ayırın ve damıtılmış su içeren 40 ° C'lik bir su banyosunda yüzdürün. Bölümleri cam slaytlara aktarın.
7. Dokuyu cama bağlamak için parafin bölümlerini 60 ° C'de 1 saat inkübe edin. Slaytları gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.

8. Hematoksilen ve Eozin (H & E) boyama

1. Ksilen içinde inkübasyon yoluyla (5 dakika boyunca 3 kez) adım 7.7'deki bölümleri deparafinize edin.
2. Mutlak alkol (5 dakika için 2x), %95 alkol (5 dakika için 2x) ve %70 alkol (5 dakika için 1x) içinde inkübe ederek yeniden hidratlayın. Damıtılmış su ile kısa bir süre durulayın.
3. Mayer hematoksilen solüsyonunda 5 dakika boyayın. Akan musluk suyu ile 10 dakika durulayın.
4. 40 s boyunca% 0.5 Eozin çözeltisinde karşı leke. Damıtılmış su ile durulayın.
5. Sırasıyla% 70 alkol (maksimum 1 dakika),% 95 etanol (3 dakika boyunca 2x) ve mutlak alkol (3 dakika boyunca 2x) içinde inkübasyon ile dehidrat.
6. Üç ksilen değişiminde temizleyin (her biri birkaç saniye). Bir damla montaj ortamı yerleştirin ve slaytları bir lamel ile örtün.

9. OTSC'lerin İmmünohistokimyası

1. Bölümleri ksilen 2x içinde 10 dakika inkübasyon yoluyla deparafinize edin, ardından 10 dakika boyunca 1: 1 etanol / ksilol uygulayın.
2. Slaytları %100 etanole (3 dakika için 2x), %96 etanole (3 dakika için 2x), %70 etanole (3 dakika için 1x) ve ardından %50 etanole (3 dakika için 1x) aktarın.
3. Antijenik epitopun maskesini çıkarmak için antijen alımı yapın. Slaytları bir mikrodalgada sitrat tamponunda 900 W'ta 5 dakika, ardından 600 W'ta 8 dakika 2 kez ısıtın. Slaytların 20 dakika oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
4. PBS 3x'te bir çalkalayıcıda 3 dakika yıkayın.
5. Nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 0.1 Triton X-100'de (slayt başına 200 μL) inkübasyon yoluyla hücre zarlarının geçirgenliğini gerçekleştirin.
6. Çalkalayıcıda her biri 3 dakika olmak üzere üç değişiklik için PBS'de yıkayın.
7. Endojen peroksidaz aktivitesini bloke etmek için bölümleri metanol (slayt başına 200 μL) içinde nemlendirilmiş bir odada 10 dakika boyunca metanol içinde% 3 H₂O₂ çözeltisi ile inkübe edin.
8. PBS 3x'te bir çalkalayıcıda 3 dakika yıkayın.
9. 200 μL bloke edici tampon (PBS'de 1:50 at serumu) ekleyin ve oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada 25 dakika inkübe edin.
10. Slaytı bir kağıt mendil üzerinde eğerek slaytlardaki engelleme tamponunu boşaltın.
11. Slaytlar üzerine antikor seyrelticide 200 μL uygun şekilde seyreltilmiş primer antikor uygulayın ve gece boyunca 4 ° C'de nemlendirilmiş bir odada inkübe edin. Negatif bir kontrol olarak, birincil antikor ile aynı seyreltmede fare immünoglobulinlerinin uygun izoformunu kullanın.
12. Bir çalkalayıcıda PBS'de 3 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
13. Slaytlara 200 μL biyotinile edilmiş ikincil antikor (PBS'de 1:50 çözelti) uygulayın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada inkübe edin.
14. Bir çalkalayıcıda PBS'de 3 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
15. Uygulamadan önce avidin/biotin bazlı peroksidaz kompleksini üreticinin talimatlarına göre hazırlayın. Slaytlara 200 μL avidin-biotin-peroksidaz kompleksi uygulayın ve nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
16. Bir çalkalayıcıda PBS'de 3 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
17. 200 μL DAB substrat solüsyonu uygulayın (kullanımdan hemen önce taze yapılmış: 1 mL substratta 1 damla DAB), slayt başına 200 μL. İstenilen renk yoğunluğuna ulaşılana kadar renk gelişimine 1-3 dakika izin verin.
18. Akan musluk suyu ile 10 dakika durulayın.
19. Kenarları 5 dakika boyunca Hematoxylin'e batırarak slaytları lekeleyin.
20. Akan musluk suyu ile 10 dakika durulayın.
21. Sulu montaj ortamı ve lameller kullanarak slaytları örtün. Monte edilen slaytlar oda sıcaklığında kalıcı olarak saklanabilir.

Sonuçlar

Şekil 1, taze, dondurulmamış tümör dokusundan OTSC'leri kültürlemek için iş akışına genel bir bakış sağlar. Primer PDAC ve metastaz örnekleri cerrahi rezeksiyondan hemen sonra toplandı ve doku saklama solüsyonunda 4 ° C'de ıslak buz üzerinde gece boyunca saklandı. Örnekler işlendi ve dilimler protokolde tarif edildiği gibi kültürlendi. Her OTSC'nin makroskopik morfolojisi, yetiştirme sırasında büyük ölçüde değişmedi. Bununla birlikte, OTSC'lerin yüzey al...

Tartışmalar

Taze tümör örneklerinin OTSC'leri, in situ tümörün yakın bir yaklaşımıdır. Tanımlanmış, dokuya bağlı bir süre boyunca yetiştirme sırasında temel morfolojilerini, proliferatif aktivitelerini ve mikro çevrelerini korurlar 11,12,13. Bu teknik, tedavinin ex vivo olarak canlı insan tümör dokusuna hemen uygulanmasını ve ardından transkriptom ve proteomun profillenmesi gibi aşağı akış a...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F-12 Medium	Gibco	12634028
Agarose Low Melt	Roth	6351.2	8% in Ringer solution
Antibody Diluent, Background Reducing	Dako	S3022
AquaTex	Merck	108562
Bioethanol (99%, denatured)	CHEMSolute	2,21,19,010
Citric Acid monohydrate	Sigma Aldrich	C7129
Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb	Cell Signalling Technology	9664	1:400 dilution
Derby Extra Double Edge Safety Razor Blades	Derby Tokai
Embedding cassettes	Roth	H579.1
Eosin Y-solution 0,5% aqueous	Merck	10,98,44,100
Eukitt Quick hardening mounting medium	Sigma-Aldrich	3989
Fetal bovine serum	Gibco	10270106
Formaldehyde solution 4,5%, buffered	Büfa Chemikalien	B211101000
Hem alum solution acid acc. to Mayer	Roth	T865
Human EGF	Milteniy Biotec	130-097-794
Hydrocortisone	Sigma Aldrich (Merck)	H0888
Hydrogen peroxide 30%	Merck	1,08,59,71,000
Insulin human	Sigma Aldrich (Merck)	12643
Liquid DAB+ Substrate Chromogen System	Dako	K3468
MACS Tissue Storage Solution	Milteniy Biotech	130-100-008
Methanol	Merck	10.600.092.500
Microscope Slides Superfrost Plus	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm	Millipore (Merck)	PICM0RG50
Monoclonal mouse anti-human  Cytokeratin 7 (Clone OV-TL 12/30)	Dako	M7018	1:200 dilution
Monoclonal mouse anti-human Ki67 Clone MIB-1	Dako	M7240	1:200 dilution
Monoclonal mouse Anti-vimentin (Clone V9)	Dako	M0725	1:200 dilution
Negative control Mouse IgG2a	Dako	X0943	1:200 dilution
Negative control Mouse IgG1	Dako	X093101-2	1:200 dilution
Paraffin (melting temperature 56°- 58°)	Merck	10,73,37,100
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Gibco	15140122
PBS pH 7,4 (1x) Flow Cytometry Grade	Gibco	A12860301
Resazurin sodium salt; 10 mg/ml in PBS	Sigma Aldrich	R7017	1:250 dilution
Ringer's solution	Fresenius Kabi	2610813
RPMI-1640 Medium	Sigma Aldrich (Merck)	R8758
Tissue culture testplate 6	TPP	92006
Triton X-100	Sigma Aldrich	9002-93-1
VECTASTAIN Elite ABC-Peroxidase Kit	Vector Laboratories	PK-6200
Xylene (extra pure)	J.T.Baker	8,11,85,000
Equipment
ClarioStar Microplate Reader	BMG Labtech
Paraffin Embedding Center E61110	Leica
Rotary Microtome Microm HM355S	Thermo Scientific
Section Transfer System Microm STS	Thermo Scientific
VT 1200S Vibratom	Leica