Primer Pankreas Kanseri ve Metastazında Tümör Mikroçevresinin Preklinik Modelleri Olarak Organotipik Dilim Kültürleri

Özet

Bu protokol, organotipik dilim kültürlerinin (OTSC'ler) hazırlanmasını tanımlar. Bu teknik, sağlam çok hücreli dokunun ex vivo olarak yetiştirilmesini kolaylaştırır. OTSC'ler, çok hücreli bir ortamda ilaçlara karşı ilgili yanıtlarını test etmek için hemen kullanılabilir.

Özet

Primer pankreas kanseri ve metastazın gerçekçi preklinik modellerine, tedavi yanıtını ex vivo olarak test etmek ve kişiselleştirilmiş hasta tedavisini kolaylaştırmak için acilen ihtiyaç duyulmaktadır. Bununla birlikte, şu anda kullanılan modellerde, örneğin hastadan türetilen hücre dizileri ve ksenogreftlerde tümöre özgü mikro ortamın olmaması, yalnızca sınırlı öngörücü içgörülere izin verir. Organotipik dilim kültürleri (OTSC'ler), uzamsal olarak çözülmüş ilaç yanıt testi için hızlı bir şekilde kullanılabilen sağlam çok hücreli doku içerir.

Bu protokol, pankreas kanserinin canlı tümör dilimlerinin oluşturulmasını ve yetiştirilmesini ve metastazını tanımlar. Kısaca doku, düşük eriyik agaroz içinde dökülür ve soğuk izotonik tamponda saklanır. Daha sonra, bir vibratom ile 300 μm kalınlığında doku dilimleri oluşturulur. Hazırlandıktan sonra dilimler, hücre kültürü ekleri ve uygun bir yetiştirme ortamı kullanılarak bir hava-sıvı arayüzünde kültürlenir. Yetiştirme sırasında, hücre farklılaşması ve canlılığındaki değişiklikler izlenebilir. Ek olarak, bu teknik, tedavinin canlı insan tümör dokusuna ex vivo olarak uygulanmasını ve ardından transkriptom ve proteom profili oluşturma gibi aşağı akış analizlerini mümkün kılar.

OTSC'ler, bireysel tedavi yanıtını ex vivo test etmek ve bir tümörün farklı dilimlerinin ilgili yanıtı ile ilişkili bireysel transkriptomik ve proteomik profilleri tanımlamak için eşsiz bir fırsat sağlar. Primer pankreas kanseri ve metastaz tedavisini kişiselleştirmek için terapötik stratejileri belirlemek için OTSC'ler daha fazla araştırılabilir.

Giriş

Pankreatik duktal adenokarsinom (PDAC) ve ilgili metastazların mevcut preklinik modelleri, hastalarda tedaviye yanıtın zayıf belirleyicileridir, bu da ilaç geliştirmede ve prediktif biyobelirteçlerin tanımlanmasında önemli bir eksikliktir¹. Hasta kaynaklı organoidler ve hasta kaynaklı ksenogreftler gibi modeller umut verici olsa da, kullanımları sınırlı kalmaktadır². Bu in vitro modellerin başlıca sınırlamaları, insan bağışıklığı baskılanmış olmayan türlerde tümör mikroçevresinin ve ksenogreftlemenin olmamasıdır. Özellikle PDAC ve metastazlarında, tümör mikroçevresi, tümör biyolojisindeki önemli işlevleri nedeni....

Protokol

Doku örnekleri, Lübeck Üniversitesi'nin yerel etik komitesi tarafından onaylandıktan sonra toplandı ve işlendi (# 16-281).

1. Taze doku toplama ve taşıma

NOT: Kan yoluyla bulaşan patojenlerden kaynaklanan enfeksiyon riskini önlemek için sabitlenmemiş her insan dokusu örneği dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Doku işlemeden önce tüm hastalar HIV, HBV ve HCV için negatif olarak test edilmelidir. Koruyucu bir ceket giyin ve insan dokusu örneklerini eldivenlerle tutun.

1. Ameliyattan hemen sonra minimum 0,4 x 0,4 cm boyutunda taze, sabitlenmemiş ve dondurulmamış PDAC doku örneğini toplayın ve örneği bir dok....

Sonuçlar

Şekil 1, taze, dondurulmamış tümör dokusundan OTSC'leri kültürlemek için iş akışına genel bir bakış sağlar. Primer PDAC ve metastaz örnekleri cerrahi rezeksiyondan hemen sonra toplandı ve doku saklama solüsyonunda 4 ° C'de ıslak buz üzerinde gece boyunca saklandı. Örnekler işlendi ve dilimler protokolde tarif edildiği gibi kültürlendi. Her OTSC'nin makroskopik morfolojisi, yetiştirme sırasında büyük ölçüde değişmedi. Bununla birlikte, OTSC'lerin yüzey al.......

Tartışmalar

Taze tümör örneklerinin OTSC'leri, in situ tümörün yakın bir yaklaşımıdır. Tanımlanmış, dokuya bağlı bir süre boyunca yetiştirme sırasında temel morfolojilerini, proliferatif aktivitelerini ve mikro çevrelerini korurlar 11,12,13. Bu teknik, tedavinin ex vivo olarak canlı insan tümör dokusuna hemen uygulanmasını ve ardından transkriptom ve proteomun profillenmesi gibi aşağı akış a.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F-12 Medium	Gibco	12634028
Agarose Low Melt	Roth	6351.2	8% in Ringer solution
Antibody Diluent, Background Reducing	Dako	S3022
AquaTex	Merck	108562
Bioethanol (99%, denatured)	CHEMSolute	2,21,19,010
Citric Acid monohydrate	Sigma Aldrich	C7129
Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb	Cell Signalling Technology	9664	1:400 dilution
Derby Extra Double Edge Safety Razor Blades	Derby Tokai
Embedding cassettes	Roth	H579.1
Eosin Y-solution 0,5% aqueous	Merck	10,98,44,100
Eukitt Quick hardening mounting medium	Sigma-Aldrich	3989
Fetal bovine serum	Gibco	10270106
Formaldehyde solution 4,5%, buffered	Büfa Chemikalien	B211101000
Hem alum solution acid acc. to Mayer	Roth	T865
Human EGF	Milteniy Biotec	130-097-794
Hydrocortisone	Sigma Aldrich (Merck)	H0888
Hydrogen peroxide 30%	Merck	1,08,59,71,000
Insulin human	Sigma Aldrich (Merck)	12643
Liquid DAB+ Substrate Chromogen System	Dako	K3468
MACS Tissue Storage Solution	Milteniy Biotech	130-100-008
Methanol	Merck	############
Microscope Slides Superfrost Plus	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm	Millipore (Merck)	PICM0RG50
Monoclonal mouse anti-human  Cytokeratin 7 (Clone OV-TL 12/30)	Dako	M7018	1:200 dilution
Monoclonal mouse anti-human Ki67 Clone MIB-1	Dako	M7240	1:200 dilution
Monoclonal mouse Anti-vimentin (Clone V9)	Dako	M0725	1:200 dilution
Negative control Mouse IgG2a	Dako	X0943	1:200 dilution
Negative control Mouse IgG1	Dako	X093101-2	1:200 dilution
Paraffin (melting temperature 56°- 58°)	Merck	10,73,37,100
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Gibco	15140122
PBS pH 7,4 (1x) Flow Cytometry Grade	Gibco	A12860301
Resazurin sodium salt; 10 mg/ml in PBS	Sigma Aldrich	R7017	1:250 dilution
Ringer's solution	Fresenius Kabi	2610813
RPMI-1640 Medium	Sigma Aldrich (Merck)	R8758
Tissue culture testplate 6	TPP	92006
Triton X-100	Sigma Aldrich	9002-93-1
VECTASTAIN Elite ABC-Peroxidase Kit	Vector Laboratories	PK-6200
Xylene (extra pure)	J.T.Baker	8,11,85,000
Equipment
ClarioStar Microplate Reader	BMG Labtech
Paraffin Embedding Center E61110	Leica
Rotary Microtome Microm HM355S	Thermo Scientific
Section Transfer System Microm STS	Thermo Scientific
VT 1200S Vibratom	Leica