器官型切片培养作为原发性胰腺癌和转移瘤肿瘤微环境的临床前模型

摘要

该协议描述了器官型切片培养物（OTSC）的制备。该技术有助于完整多细胞组织的 离体 培养。OTSCs可以立即用于测试它们在多细胞环境中对药物的各自反应。

摘要

迫切需要原发性胰腺癌和转移瘤的现实临床前模型来测试体 外 治疗反应并促进个性化患者治疗。然而，在目前使用的模型中，例如，患者来源的细胞系和异种移植物中缺乏肿瘤特异性微环境，只能提供有限的预测见解。器官型切片培养物 （OTSC） 由完整的多细胞组织组成，可快速用于空间分辨的药物反应测试。

该方案描述了胰腺癌的活肿瘤切片的产生和培养及其转移。简而言之，将组织移植在低熔点琼脂糖中并储存在冷等渗缓冲液中。接下来，用振动切片机生成 300 μm 厚的组织切片。制备后，使用细胞培养插入物和适当的培养基在气液界面上培养切片。在培养过程中，可以监测细胞分化和活力的变化。此外，该技术还能够将治疗应用于 体 外活的人类肿瘤组织和随后的下游分析，例如转录组和蛋白质组分析。

OTSC 提供了一个独特的机会来测试个体体外 治疗反应， 并识别与肿瘤不同切片的各自反应相关的个体转录组学和蛋白质组学特征。可以进一步探索 OTSC 以确定治疗策略，以个性化治疗原发性胰腺癌和转移瘤。

引言

现有的胰腺导管腺癌 （PDAC） 和相应转移瘤的临床前模型是患者治疗反应的不良预测因子，这是药物开发和预测生物标志物识别的一个主要缺点¹.尽管患者来源的类器官和患者来源的异种移植物等模型很有希望，但它们的使用仍然有限².这些体外模型的主要局限性是缺乏肿瘤微环境和非人类免疫功能低下物种的异种移植。特别是在PDAC及其转移瘤中，肿瘤微环境因其在肿瘤生物学中的关键功能而在过去几年中引起了人们的广泛关注。它包括细胞和非细胞成分，如（肌）成纤维细胞、胰腺星状细胞、免疫细胞、血管、细胞外基质、细胞因子和生长因子³。这种微环境不是非功能性的肿瘤成分，但会诱导肿瘤进展和转移，并且似乎对放疗和化疗耐药性有很大贡献⁴。PDAC微环境不仅机械地损害药物递送，而且还具有免疫和药物清除活性^5,6,7。因此，迫切需要能够反映肿瘤细胞与肿瘤微环境复杂相互作用的临床前模型，以充分检验患者的体外治疗反应，并指导个体化临床治疗。

新鲜肿瘤样本的离体培养代表了肿瘤原位的近似值。最近已经开发和研究了几种肿瘤的器官型切片培养 （OTSC），例如头、颈、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌和胰腺癌 8,9,10,11,12。研究表明，OTSC 在培养过程中保持其基线形态、增殖活性和微环境，持续时间长达 11,12,13。在几项体外^研究中，PDACs的OTSCs保持其活力，形态和肿瘤微环境的大部分成分4-9天5,12,14。从角度来看，该技术可以立即将治疗应用于体外可行的人类肿瘤组织和随后的下游分析，例如转录组和蛋白质组的分析。

OTSC 的建立提供了一个独特的机会，可以在手术后立即 在体外 测试治疗反应。因此，OTSC 将前瞻性地允许确定治疗策略，以个性化转移性疾病的治疗。该方案描述了胰腺癌的活OTSC的产生和培养。

研究方案

组织标本是在吕贝克大学当地伦理委员会 （# 16-281） 批准后收集和处理的。

1. 新鲜纸巾的收集和处理

注意:每个未固定的人体组织标本都应小心处理，以防止血源性病原体感染的风险。在组织处理之前，应对所有患者进行 HIV、HBV 和 HCV 阴性检测。穿上防护服，戴手套处理人体组织标本。

1. 手术后立即收集新鲜、未固定和未冷冻的 PDAC 组织标本，最小尺寸为 0.4 x 0.4 cm，并将标本在组织储存溶液中运输到实验室。
2. 如果可能，请立即处理新鲜组织。
3. 或者，将组织储存在组织储存溶液中的湿冰上，在4°C过夜。然而，组织储存可能会导致活力受损，通常应避免。

2. 准备工作

1. 低熔点琼脂糖制备
   1. 通过将8g琼脂糖溶解在100mL预热的林格氏溶液中来制备100mL低熔点琼脂糖（8%），并将其储存在4°C直至需要。
   2. 在宣布肿瘤切除后，将琼脂糖在微波炉中融化。
   3. 将琼脂糖置于预热的水浴（37°C）中，使其在制备前冷却至生理温度。
2. 振动切片机设置
   1. 将剃须刀片放入振动切片机的支架中，并根据制造商的说明（如果适用）执行自动角度调整。
   2. 使用冷却装置或湿冰冷却切割室的夹套。
   3. 用大约 100 mL 的生理切割溶液（例如，林格氏溶液）填充切割室。
   4. 将安装的剃须刀片放入预冷的切割溶液中，让剃须刀片冷却。

3. 组织包埋在低熔点琼脂糖中

1. 用冷却的（4°C）PBS洗涤组织标本，并将PBS中的组织置于冰上的大（~14cm）培养皿上。
2. 使用手术刀去除冰上宏观可见的多余结缔组织，因为它可能会妨碍切割效率。
3. 将组织放入一个小培养皿（~3cm）中。
4. 调整组织方向，使剩余的宏观可见结缔组织与培养皿底部平面具有相同的方向。培养皿的底部与切割平面具有相同的方向。
5. 将准备好的低熔点琼脂糖倒入小培养皿中。
6. 如果需要，使用镊子重新调整组织的方向。
7. 将培养皿放在湿冰上，以更快地硬化琼脂糖。
8. 使用手术刀小心地切割组织，在组织的每一侧留下至少5毫米的琼脂糖周围。
9. 小心地转移嵌入的组织，并使用强力胶将其粘在样品架上。
10. 几秒钟后，将样品架放入切割室。
11. 如果需要，调整组织朝向剃须刀片的方向。

4. 使用振动切片机对琼脂糖包埋的组织进行切片

1. 根据组织标本的大小定义切割范围（y 轴）的外部极限。
2. 将刀片调整到组织块的顶部。
3. 将切割速度设置为 0.04 mm/s，切割振幅为 1 mm，切片厚度为 300 μm。
4. 小心地切开第一片，并将切片转移到一个单独的容器中，用预冷（4°C）切割溶液在湿冰上。

5. 器官型切片培养物的培养

1. 制备一个 6 孔板，每孔含有 1 mL 适当的培养基。
   1. 培养基 A:高级 DMEM/F12、10% FBS、1% 青霉素/链霉素。
   2. 培养基 B:RPMI 1640、10% FBS、1% 青霉素/链霉素、4 μg/mL 胰岛素、8 ng/mL EGF、0.3 μg/mL 氢化可的松。
      注:最佳培养条件的培养基可能因组织和患者而异。比较了两种不同的组织培养基，一种基于 DMEM/F12（培养基 A），另一种基于 RPMI（培养基 B）。这些培养基之间没有发现实质性差异。对于该协议中显示的所有实验，使用培养基A。
2. 将装有培养基的 6 孔板放入培养箱中，在培养前调节温度和 pH 值。
3. 使用凝视滤光片将切片放在细胞培养插入物（例如，孔径为 0.4 μm 的亲水性 PTFE 插入物）上。
4. 通过将加载的过滤器放在无菌布上来去除任何多余的切割溶液。
5. 将加载的过滤器放入准备好的 6 孔板中。请勿向插件中添加任何其他介质。
6. 将6孔板置于培养箱（37°C，5%CO₂）中。
7. 使用新的 6 孔板重复步骤 5.1、5.2 和 5.5，每 2 天更换一次培养基。
   注:器官型切片培养物可以培养不同的时期，具体取决于个体研究问题。

6. 刃天青活力测定

注:刃天青活力测定基于活细胞中非荧光蓝色刃天青还原为红色荧光试卤灵的有机型切片培养物的一般代谢活性¹⁵。该测定对细胞没有毒性作用，并且可以根据个别研究问题反复应用于培养物。每 2-3 天使用刃天青测定法测量活力。

1. 刃天青储备溶液的制备
   1. 关闭无菌罩的灯，因为刃天青储备溶液对光敏感。
   2. 用10mg / mL刃天青钠盐在1x PBS中制备储备溶液。
   3. 将储备溶液在4°C的光保护等分试样中储存在冰箱中直至使用。
2. 评估整体切片活力
   1. 关闭无菌罩的灯，因为刃天青储备溶液对光敏感。
   2. 用适当的培养基按 1:250 稀释刃天青储备溶液。
      注意:用于稀释的培养基应与用于培养的培养基相同（培养基A或培养基B）。
   3. 每层制备 1 mL 最终刃天青溶液，并添加另外 1 mL 用于空白对照，例如，对于 6 层，在 7 mL 培养基中稀释 28 μL 刃天青储备溶液。
   4. 将刃天青溶液分配到 6 孔板中，每孔加入 1 mL 稀释的刃天青溶液。
   5. 将带有切片的培养过滤器转移到装有刃天青溶液的孔中。将一个装有刃天青溶液的孔留空作为空白对照。
      注意:为了简化实验程序，此步骤可以与更换培养基（步骤5.7）结合使用。但是，如果需要进行额外的活力测量，则可以在切片培养物培养过程中的任何时间进行测定。
   6. 将组织切片在37°C和5%CO₂的培养箱中放置1小时。
   7. 如果继续切片培养，则用培养基制备新的 6 孔板（参见步骤 5.1 和 5.2）。
   8. 从刃天青溶液中取出带有切片的培养过滤器，并通过将加载的过滤器放在无菌布上去除多余的溶液。
   9. 将带有切片的培养过滤器转移到先前准备好的培养板上。
   10. 从每个 6 孔中，取出 100 μL 刃天青溶液并将其转移到 96 孔板上。从空白对照中，将三个样品 （3 x 100 μL） 放入 96 孔板的单独孔中。
   11. 根据制造商的说明，使用板式光度计量化消光。激发波长设置为 545 nm，发射波长设置为 600 nm。

7. OTSCs的福尔马林固定和石蜡包埋

1. 小心地将培养的组织切片转移到塑料包埋盒中。为此，请按照以下步骤操作。
   1. 将带有已安装切片的培养过滤器放在培养皿上。
   2. 用手术刀，小心地切开带有安装的组织切片的滤膜。
   3. 小心地将带有安装切片的滤膜转移到活检尼龙袋中，然后将其放入包埋盒中。
   4. 随后将塑料包埋盒转移到装有预冷（4°C）4.5%福尔马林的容器中。切片可以在4°C的福尔马林溶液中保存，直到进一步使用，但应孵育至少24小时。
      注意:OTSC 需要非常小心地转移，因为它们很容易撕裂。
2. 小心地用流动的自来水冲洗福尔马林固定切片培养物1.5小时。
3. 通过在70%乙醇（2x，3小时），95%乙醇（1x过夜，1x，3小时）中孵育，然后用无水乙醇（1x，3小时，1x过夜）孵育，使福尔马林固定的组织切片脱水。
4. 通过在二甲苯中孵育3小时来清除福尔马林固定的组织切片两次。
5. 将组织与石蜡浸入60°C（1x过夜，1x2小时）。将组织包埋在组织包埋模具中的石蜡块中。
6. 用切片机切片4μm厚的石蜡包埋组织块，并漂浮在含有蒸馏水的40°C水浴中。将切片转移到载玻片上。
7. 将石蜡切片在60°C下孵育1小时，以将组织粘合到玻璃上。将载玻片在37°C孵育过夜。

8.苏木精和伊红（H&E）染色

1. 通过在二甲苯中孵育（3x，5分钟）使步骤7.7的切片脱蜡。
2. 通过在无水酒精（2x 5 分钟）、95% 酒精（2x 5 分钟）和 70% 酒精（1x 5 分钟）中孵育重新水合。用蒸馏水短暂冲洗。
3. 在Mayer苏木精溶液中染色5分钟。用流动的自来水冲洗 10 分钟。
4. 在0.5%曙红溶液中复染40秒。用蒸馏水冲洗。
5. 分别通过在70%酒精（最多1分钟），95%乙醇（2x，3分钟）和无水酒精（2x，3分钟）中孵育脱水。
6. 分三次二甲苯变化（每次几秒钟）清除。放置一滴安装介质，并用盖玻片盖住载玻片。

9. OTSCs的免疫组化

1. 通过在二甲苯中孵育 2x 孵育 10 分钟，然后用 1:1 乙醇/木酚孵育 10 分钟来脱蜡切片。
2. 将载玻片转移到100%乙醇（2x，3分钟），96%乙醇（2x，3分钟），70%乙醇（1x，3分钟），然后转移到50%乙醇（1x，3分钟）。
3. 进行抗原修复以揭示抗原表位。在柠檬酸盐缓冲液中的微波炉中以 900 W 加热载玻片 5 分钟，然后在 600 W 下 2x 加热 8 分钟，让载玻片冷却至室温 20 分钟。
4. 在振荡器上用 PBS 洗涤 3 次 3 分钟。
5. 通过在室温下在加湿室中在 PBS（每载玻片 200 μL）中孵育 0.1% Triton X-100 进行细胞膜的透化 10 分钟。
6. 在PBS中洗涤三次，每次在振荡器上3分钟。
7. 在室温下，在加湿室中用 3% H₂O₂ 溶液在甲醇溶液（每载玻片 200 μL）孵育切片 10 分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。
8. 在振荡器上用 PBS 洗涤 3 次 3 分钟。
9. 加入 200 μL 封闭缓冲液（PBS 中 1:50 马血清）并在室温下在加湿室中孵育 25 分钟。
10. 通过在纸纸上倾斜载玻片，从载玻片中排出阻滞缓冲液。
11. 在载玻片上的抗体稀释剂中应用200μL适当稀释的一抗，并在4°C的加湿室中孵育过夜。作为阴性对照，使用与一抗相同稀释度的小鼠免疫球蛋白的适当亚型。
12. 在振荡器上用 PBS 洗涤 3 次 3 分钟。
13. 在载玻片上应用 200 μL 生物素化的二抗（PBS 中的 1:50 溶液），并在室温下在加湿室中孵育 30 分钟。
14. 在振荡器上用 PBS 洗涤 3 次 3 分钟。
15. 在应用之前，根据制造商的说明制备基于亲和素/生物素的过氧化物酶复合物。在载玻片上应用 200 μL 亲和素 - 生物素 - 过氧化物酶复合物，并在室温下在加湿室中孵育 30 分钟。
16. 在振荡器上用 PBS 洗涤 3 次 3 分钟。
17. 应用 200 μL DAB 底物溶液（使用前直接新鲜制备:在 1 mL 底物中滴 1 滴 DAB），每张载玻片 200 μL。让显色 1-3 分钟，直到达到所需的颜色强度。
18. 用流动的自来水冲洗 10 分钟。
19. 通过将侧面浸入苏木精中 5 分钟来对载玻片进行复染。
20. 用流动的自来水冲洗 10 分钟。
21. 使用水性安装介质和盖玻片覆盖载玻片。安装的载玻片可以在室温下永久存放。

结果

图 1 概述了从新鲜、未冷冻的肿瘤组织中培养 OTSC 的工作流程。手术切除后直接收集原发性PDACs和转移瘤的标本，并在组织储存溶液中在4°C的湿冰上储存过夜。对标本进行处理，并按照方案中的描述培养切片。各OTSC的宏观形态在培养过程中没有明显变化。然而，OTSC 的表面积大小随着时间的推移而减小，如图 2A 所示，在培养 6 天期间。在第 0、2/3 和 6 ...

讨论

新鲜肿瘤样本的OTSCs与肿瘤原位的近似值非常接近。它们在培养过程中保持其基线形态、增殖活性和微环境，保持一定的组织依赖期 11,12,13。该技术可以立即将治疗应用于体外活的人类肿瘤组织，并进行随后的下游分析，例如转录组和蛋白质组的分析。OTSCs的一个具体优点是，空间分辨的下游分析（如MALDI成像）可...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F-12 Medium	Gibco	12634028
Agarose Low Melt	Roth	6351.2	8% in Ringer solution
Antibody Diluent, Background Reducing	Dako	S3022
AquaTex	Merck	108562
Bioethanol (99%, denatured)	CHEMSolute	2,21,19,010
Citric Acid monohydrate	Sigma Aldrich	C7129
Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb	Cell Signalling Technology	9664	1:400 dilution
Derby Extra Double Edge Safety Razor Blades	Derby Tokai
Embedding cassettes	Roth	H579.1
Eosin Y-solution 0,5% aqueous	Merck	10,98,44,100
Eukitt Quick hardening mounting medium	Sigma-Aldrich	3989
Fetal bovine serum	Gibco	10270106
Formaldehyde solution 4,5%, buffered	Büfa Chemikalien	B211101000
Hem alum solution acid acc. to Mayer	Roth	T865
Human EGF	Milteniy Biotec	130-097-794
Hydrocortisone	Sigma Aldrich (Merck)	H0888
Hydrogen peroxide 30%	Merck	1,08,59,71,000
Insulin human	Sigma Aldrich (Merck)	12643
Liquid DAB+ Substrate Chromogen System	Dako	K3468
MACS Tissue Storage Solution	Milteniy Biotech	130-100-008
Methanol	Merck	10.600.092.500
Microscope Slides Superfrost Plus	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm	Millipore (Merck)	PICM0RG50
Monoclonal mouse anti-human  Cytokeratin 7 (Clone OV-TL 12/30)	Dako	M7018	1:200 dilution
Monoclonal mouse anti-human Ki67 Clone MIB-1	Dako	M7240	1:200 dilution
Monoclonal mouse Anti-vimentin (Clone V9)	Dako	M0725	1:200 dilution
Negative control Mouse IgG2a	Dako	X0943	1:200 dilution
Negative control Mouse IgG1	Dako	X093101-2	1:200 dilution
Paraffin (melting temperature 56°- 58°)	Merck	10,73,37,100
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Gibco	15140122
PBS pH 7,4 (1x) Flow Cytometry Grade	Gibco	A12860301
Resazurin sodium salt; 10 mg/ml in PBS	Sigma Aldrich	R7017	1:250 dilution
Ringer's solution	Fresenius Kabi	2610813
RPMI-1640 Medium	Sigma Aldrich (Merck)	R8758
Tissue culture testplate 6	TPP	92006
Triton X-100	Sigma Aldrich	9002-93-1
VECTASTAIN Elite ABC-Peroxidase Kit	Vector Laboratories	PK-6200
Xylene (extra pure)	J.T.Baker	8,11,85,000
Equipment
ClarioStar Microplate Reader	BMG Labtech
Paraffin Embedding Center E61110	Leica
Rotary Microtome Microm HM355S	Thermo Scientific
Section Transfer System Microm STS	Thermo Scientific
VT 1200S Vibratom	Leica