Un modelo animal grande para la hipertensión pulmonar y la insuficiencia ventricular derecha: ligadura de la arteria pulmonar izquierda y bandas progresivas de la arteria pulmonar principal en ovejas

Resumen

Este manuscrito describe la técnica quirúrgica y el enfoque experimental para desarrollar una sobrecarga severa de presión ventricular derecha para modelar sus fenotipos adaptativos y desadaptativos.

Resumen

La insuficiencia ventricular derecha (FVR) descompensada en la hipertensión pulmonar (HP) es fatal, con opciones de tratamiento médico limitadas. El desarrollo y la prueba de nuevas terapias para la HP requieren un modelo animal grande clínicamente relevante de aumento de la resistencia vascular pulmonar y la FVR. Este manuscrito discute el último desarrollo del modelo ovino PH-RVF previamente publicado que utiliza la ligadura de la arteria pulmonar izquierda (AP) y la oclusión principal de PA. Este modelo de PH-RVF es una plataforma versátil para controlar no solo la gravedad de la enfermedad, sino también la respuesta fenotípica del RV.

Las ovejas adultas (60-80 kg) se sometieron a ligadura de PA izquierda (LPA), colocación del manguito de PA principal e inserción de monitor de presión de RV. El manguito de PA y el monitor de presión RV se conectaron a puertos subcutáneos. Los sujetos se sometieron a bandas progresivas de AF dos veces por semana durante 9 semanas con medidas secuenciales de presión de RV, presiones del manguito de PA y gaso sanguíneo venoso mixto (_SvO2). Al inicio y al punto final de este modelo, la función ventricular y las dimensiones se evaluaron mediante ecocardiografía. En un grupo representativo de 12 sujetos animales, la media de RV y la presión sistólica aumentaron de 28 ± 5 y 57 ± 7 mmHg en la semana 1, respectivamente, a 44 ± 7 y 93 ± 18 mmHg (desviación media ± estándar) en la semana 9. La ecocardiografía demostró hallazgos característicos de PH-RVF, notablemente dilatación de RV, aumento del grosor de la pared y inclinación septal. La tendencia longitudinal de la presión del manguito _svO2 y PA demuestra que la tasa de bandas PA se puede ajustar para provocar fenotipos de RV variables. Una estrategia de anillamiento de PA más rápida condujo a una disminución precipitada en _svO2 < 65%, lo que indica la descompensación de RV, mientras que una estrategia más lenta y de ritmo condujo al mantenimiento de SvO2 fisiológico en 70% -80%. Un animal que experimentó la estrategia acelerada desarrolló varios litros de derrame pleural y ascitis en la semana 9. Este modelo de PH-RVF crónico proporciona una herramienta valiosa para estudiar los mecanismos moleculares, desarrollar biomarcadores de diagnóstico y permitir la innovación terapéutica para gestionar la adaptación y la inadaptación de RV a partir de PH.

Introducción

La insuficiencia ventricular derecha (RV) descompensada es la causa predominante de morbilidad y mortalidad en pacientes con hipertensión pulmonar (HP). El fracaso de rv es responsable de más del 50% de las hospitalizaciones en pacientes con HP y es una causa común de muerte en esta población de ^pacientes1,2. Aunque los tratamientos médicos actuales para la HP pueden proporcionar medidas de temporización, no revierten la progresión de la enfermedad. Como tal, el único tratamiento a largo plazo es el trasplante de pulmón. Para explorar y probar nuevos tratamientos e intervenciones médicas para la HP y la FVR, se necesita un modelo animal clínicamente relevante para recapitular la compleja fisiopatología de la enfermedad. En particular, existe una gran necesidad clínica de desarrollar terapias dirigidas a RV para pacientes con HP para mejorar la función de RV. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios en animales publicados sobre la disfunción de PH y RV se han basado en pequeños mamíferos como ratones y ^ratas3. Por otro lado, solo ha habido un puñado de modelos animales grandes para estudiar la enfermedad y la fisiopatología de RV a partir de la poscarga anormal4,5,6,7. Además, ninguno de los modelos animales grandes publicados anteriormente incluye descripciones de procedimientos experimentales para la titulación controlada de la gravedad de la enfermedad que conduce diferencialmente a fenotipos de falla de RV compensados versus descompensados. Se necesita un modelo animal de HP que se pueda ajustar para inducir la insuficiencia aguda y crónica de RV con diversos grados de compensación para estudiar los mecanismos de la enfermedad y desarrollar, probar y traducir nuevos diagnósticos y terapias para PH y RVF en la práctica clínica. Tal modelo en un animal grande es especialmente valioso para el desarrollo de dispositivos mecánicos de soporte ^{circulatorio8}.

Aquí se presenta un modelo crónico de PH-RVF en animales grandes que utiliza ligadura de la arteria pulmonar izquierda (AF) y bandas de AF principal progresiva en ovejas ^adultas9,10. La ligadura de la AF izquierda (LPA) aumenta la resistencia vascular pulmonar y disminuye la capacitancia de la ^AF11,12. El enfoque progresivo de bandas pa permite una titulación precisa de la gravedad de la enfermedad y la adaptación a RV. Esta plataforma también se puede utilizar fácilmente para la investigación longitudinal de la progresión de la enfermedad hacia la descompensación de RV. Los procedimientos y procesos necesarios para ejecutar este modelo se presentan como un recurso para los investigadores interesados en una plataforma de animales grandes para desarrollar nuevos tratamientos para ph y RVF.

Protocolo

El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt aprobó el protocolo. Los procedimientos descritos se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía del Consejo Nacional de Investigación de los Estados Unidos para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, 8ª edición. La visión general y el cronograma del procedimiento experimental se proporcionan en la Figura 1. La Tabla suplementaria 1 describe el sexo, el peso, la raza, la fuente de las ovejas y otra información relevante que puede ser útil para fines de reproducibilidad.

1. Un día antes de la cirugía, preparación del animal

1. Retenga los alimentos durante 24-40 h antes del procedimiento quirúrgico para descomprimir el rumen del animal.
2. Aplique un parche de fentanilo de 50 μg / h en un área esquilada en el dorso de la oveja 12 h antes del procedimiento. Limpie el área con clorhexidina para eliminar los residuos de aceite de lanolina antes de la aplicación del parche. Cubra y proteja el parche con un apósito tubular elástico.

2. Día de la cirugía, pasos preoperatorios en la sala de preparación

1. Administrar tiletamine/zolazepam por vía intramuscular (2,2-5 mg/kg) y administrar 1%-3% de isoflurano mezclado con 80%-100% de oxígeno a través de una mascarilla para inducir la anestesia.
2. Coloque la oveja en decúbito supino en la mesa de preparación y asegure sus patas.
3. Intubar con un tubo endotraqueal de 10 mm e iniciar ventilación mecánica en modo de control de volumen (volumen corriente, TV = 10 ml/kg, frecuencia respiratoria, RR = 15 respiraciones por minuto).
4. Afeitar el campo quirúrgico desde el cuello de la oveja hasta la parte superior del abdomen, como se detalla a continuación.
   1. Afeitar el cuello anterior de la oveja para exponer la piel que recubre las venas yugulares para el cateterismo venoso central (ver paso 3.7).
   2. Afeitarse el tórax anterolateral bilateralmente en preparación para la toracotomía (ver paso 4.1).
   3. Afeitar el lado izquierdo del torso desde el pecho hasta la espalda (es decir, tan dorsalmente como la mesa lo permita con el sujeto en posición supina), y desde el pecho hasta el flanco posterior caudalmente, en preparación para la implantación de puertos subcutáneos (ver pasos 4.12-4.15).
5. Inserte un angiocatéter de 20 G en la arteria auricular para el monitoreo de la presión arterial y el muestreo de gases en sangre.
6. Coloque un tubo de silicona con un diámetro interior de 3/8 "-1/2" para la descompresión ruminal. El tubo orogástrico permanecerá en el rumen durante todo el procedimiento.
7. Transporte al animal desde la sala de preparación preoperatoria hasta la sala quirúrgica.

3. Día de la cirugía, pasos preoperatorios en el quirófano

1. Vuelva a conectar las ovejas al ventilador en la sala quirúrgica y continúe la ventilación en el mismo ajuste en el paso 2.3 (isoflurano 1% -3%, TV = 10 ml / kg, RR = 15 respiraciones por minuto)
2. Conecte la oximetría de pulso (_SpO2), la presión arterial, la temperatura, el capnógrafo de marea final y los sensores de electrocardiograma (ECG) al monitor anestésico.
3. Conecte los sensores de signos vitales al animal.
   1. Coloque el oxímetro de pulso en la lengua del animal.
   2. Coloque la sonda de temperatura en el recto.
   3. Conecte sondas de electrocardiograma de 3 derivaciones: Coloque la correa roja en la pierna trasera izquierda, la correa blanca en la pierna delantera derecha y la correa negra en la pierna anterior izquierda.
   4. Conecte el extremo luer macho de la llave de paso de tres vías al angiocatéter de la arteria auricular y conecte el extremo opuesto del luer hembra al transductor de presión para el monitoreo de la línea arterial utilizando un tubo de presión del tamaño adecuado.
      1. Alinee el transductor al nivel de la mesa de operaciones.
      2. Abra la llave de paso de tres vías en el transductor.
      3. Desplácese por la perilla principal del monitor de signos vitales para resaltar el canal de presión arterial y luego presione la perilla para seleccionar el canal.
      4. Seleccione CERO IBP para poner a cero el transductor.
   5. Conecte la conexión luer macho de la línea del monitor de capnografía a la conexión luer hembra en el tubo del ventilador para monitorear el _CO2 de marea final.
4. Configure las bombas intravenosas para la administración continua de líquidos y el soporte inotrópico o vasopresor.
   1. Perfore el tabique en la bolsa salina con el juego de administración IV. Asegúrese de que el tubo intravenoso esté sujeto antes de perforar la bolsa para evitar derrames.
   2. Alinee y ajuste el tubo del conjunto de administración IV en la bomba de rodillo IV y verifique si la dirección especificada en la bomba coincide con la dirección de administración del fluido.
      NOTA: Asegúrese de que el conjunto de administración IV es compatible con la bomba IV.
   3. Encienda la bomba y especifique PRIME para eliminar todo el aire de la línea.
5. Coloque las ovejas para el procedimiento operativo.
   1. Desde la posición supina, gire las ovejas a una posición de decúbito lateral derecho parcial.
   2. Asegure el pie delantero derecho hacia abajo y asegure el pie delantero izquierdo mientras lo retrae cefalada y lateral con cuerda o correas atraumáticas.
   3. Realizar ecocardiografía transtorácica para la evaluación basal de la anatomía y función ventricular. La ecografía también es útil para determinar el espacio intercostal óptimo que facilita el acceso quirúrgico tanto a la arteria pulmonar principal como a la arteria pulmonar izquierda.
6. Limpie el campo quirúrgico libre de suciedad y otros contaminantes con jabón o cepillo exfoliante. Prepare el cuello y el pecho con solución de clorhexidina o betadina y cubra el campo quirúrgico de manera estéril.
7. Usando guía de ultrasonido o puntos de referencia anatómicos, acceda a la vena yugular interna izquierda o derecha usando una aguja de búsqueda o angiocath. Usando la técnica de Seldinger, inserte un catéter venoso central de triple lumen de 7 franceses en la vena yugular interna para el acceso intravenoso y el monitoreo de la presión venosa central.
   1. Utilice el puerto proximal para la monitorización de la presión y el puerto distal para la administración de líquidos y fármacos.
8. Administrar 20 mg/kg de cefazolina y 5 mg/kg de enrofloxacina por vía intravenosa. Repita la dosificación de cefazolina cada 2-4 h durante el procedimiento.
9. Administre un bolo de 500 ml de solución salina normal para aumentar la precarga antes de la cirugía. Comience una tasa de líquido intravenoso de mantenimiento de 15 ml / kg / h.

4. Procedimiento operativo

1. Realizar una minitoracotomía con preservación muscular (longitud < 8 cm) en el cuarto espacio intercostal izquierdo para obtener exposición mediastínica. Elija la minitoracotomía para acelerar la recuperación postoperatoria.
   1. Después de dividir la piel, divida el músculo subyacente (pectoral mayor) longitudinalmente a lo largo de sus fibras, que corren ligeramente oblicuas al espacio intercostal. Coloque un retractor autocontenido para extender la capa muscular y exponer la pared torácica.
   2. Divida el serrato anterior y el músculo intercostal subyacente en el espacio intercostal seleccionado, teniendo cuidado de permanecer inmediatamente cefalado a la costilla.
   3. Ingrese al espacio pleural y luego continúe liberando completamente los músculos intercostales posteriormente hacia la columna vertebral y anteromedialmente hacia el esternón para evitar la fractura o dislocación inadvertida de la costilla en el esternón. Evite lesiones en los vasos mamarios medialmente.
   4. Coloque los retractores autocontenetivos para abrir el espacio de las costillas y el tejido blando suprayacente. Use un retractor Finochietto pequeño o mediano para separar las costillas y un retractor Tuffier (hoja retractora de 5 cm) para sentarse perpendicular al Finochietto dentro del espacio intercostal, que retrae el tejido blando dentro del espacio intercostal para mejorar la exposición.
2. Incise el pericardio anterior al nervio frénico sin lesionarlo y cree un pozo pericárdico con suturas de seda 2-0 para exponer el PA principal y RV. Identifique el apéndice auricular izquierdo dentro de la exposición como un punto de referencia para el nivel de la bifurcación PA.
   1. Evalúe la exposición y asegúrese de que se ha introducido el espacio intercostal adecuado. Idealmente, la AF proximal y el apéndice auricular izquierdo son fácilmente visibles directamente debajo de la incisión, lo que sugiere que se ha seleccionado el espacio intercostal óptimo para proporcionar exposición tanto a la AF principal como a la LPA.
   2. Si la exposición se considera inadecuada para llegar de forma segura tanto al PA principal como al LPA, no dude en abrir un espacio intercostal adicional para realizar todos los pasos necesarios de la operación; sin embargo, esto no será necesario con la selección adecuada de la incisión.
3. Diseccionar alrededor de la AP principal y aislarla con una cinta umbilical. Asegurar una disección posterior adecuada para la eventual colocación del oclusor y la sonda de flujo de PA lo más distal posible en la PA principal.
   1. Coloque una sonda de flujo estéril en un recipiente con agua o solución salina en el campo estéril para calibrar el software de adquisición de datos. Entregue el enchufe eléctrico en el otro extremo a una persona designada no estéril para conectar la sonda al medidor.
      1. Consulte los documentos complementarios para obtener detalles sobre la conexión y calibración de la sonda de flujo de PA y el medidor.
   2. Aplique una cantidad generosa de gel de ultrasonido estéril en la ranura de la sonda de flujo pa.
   3. Coloque el revestimiento de silicona en la ranura de la sonda de flujo PA y aplique una capa adicional de gel de ultrasonido en el revestimiento.
   4. Coloque la sonda de flujo de PA en el PA y adquiera lecturas de flujo de PA en el medidor de flujo y la interfaz de adquisición de datos.
      1. La colocación de la sonda de flujo de PA puede causar oclusión parcial de la AP que puede disminuir la precarga del ventrículo izquierdo y la presión arterial media. Preste mucha atención a la hemodinámica durante la adquisición del flujo de PA.
      2. Compruebe en la pantalla del medidor de flujo para asegurarse de que la intensidad de la señal de flujo pa es de 5 bares. Si el medidor muestra menos de 5 bares, asegúrese de un contacto adecuado entre la sonda de flujo y la megafonía principal. Aplique gel de ultrasonido adicional si es necesario.
4. Completa la disección intraperiocárdica de LPA y rodearla con una cinta umbilical.
   1. Use un pequeño palo de esponja o un retractor maleable delgado para la retracción caudal del apéndice auricular izquierdo.
      NOTA: La exposición al LPA se ve facilitada por la retracción caudal del apéndice auricular izquierdo, la retracción cefálica de la AP principal y la retracción lateral del pericardio justo antes de donde el LPA sale del pericardio.
5. Coloque un oclusor vascular de silicona de alta resistencia alrededor de la AP principal (Figura 2A, B, círculo). El tamaño del oclusor se puede ajustar en función del diámetro de PA; asegúrese de que el ajuste sea ajustado. Use una sutura de seda 0 en una aguja Keith para asegurar los extremos del oclusor vascular junto con una puntada en U. Una vez asegurado alrededor del PA principal, deslice el oclusor distalmente a lo largo del PA principal.
6. Rodear la AP principal proximal con un drenaje de Penrose de 1/2" para facilitar la disección y reservar espacio para colocar una sonda de flujo en la cirugía reoperatoria posterior. Recorte el desagüe de Penrose para que quepa holgadamente alrededor del PA y asegure el Penrose a sí mismo con una sutura de Prolene 4-0 (Figura 2B).
7. Establezca una línea de presión de RV para monitorear las presiones de RV (Figura 2B, flecha blanca).
   1. Seleccione una ubicación para la línea de presión de RV en la pared sin tracto de salida de RV. Coloque una sutura de cuerda de monedero de polipropileno no absorbible de 5-0 monofilamento con prendas que rodean la ubicación seleccionada y coloque una trampa vascular. Haga las promesas con un guante quirúrgico estéril.
   2. Prepare la línea de presión RV: corte el extremo masculino del tubo de presión estéril de 36 '' en un ángulo de 30 ° para facilitar la inserción a través del miocardio. Use una corbata de seda 2-0 para marcar la línea de presión a una profundidad óptima para su colocación dentro del RV.
   3. Usando un bisturí de 11 cuchillas, haga una pequeña cardiotomía en la pared libre de RVOT dentro de la sutura de cuerda de bolso colocada previamente. Controle el sangrado con presión manual o apretando la trampa en la sutura de la cuerda del bolso.
      NOTA: Obtenga una biopsia basal de la pared libre de RV en este paso mediante el muestreo de tejido de RV dentro de la sutura de cuerda de bolsa. Este sitio de biopsia puede servir como punto de entrada para la línea de presión de RV.
   4. Inserte y asegure el extremo de corte del tubo de presión en el tracto de salida de RV (RVOT). Ate la cuerda del bolso y luego asegure la cuerda del bolso al tubo de presión para asegurar la línea de presión.
8. Extienda el tubo RVOT conectando un tubo de presión adicional a la línea de presión RVOT.
9. Entregue el tubo de presión adicional a una persona designada no estéril para conectar el tubo a un transductor de presión y monitorear la medición de la presión de RV de referencia. Configure el transductor de presión de la siguiente manera.
   1. Conecte el extremo luer macho del conjunto de administración IV al extremo luer femenino del transductor.
   2. Conecte el extremo luer hembra del tubo de presión al extremo luer macho del transductor.
   3. Pico de la administración iv puesta en una bolsa de solución salina heparinizada (2 UI/ml).
   4. Coloque la bolsa salina en una bolsa de presión y bombee la bolsa de presión a 250-300 mmHg como se indica en el medidor.
   5. Imprima completamente la línea liberando la válvula en el transductor, asegurando una desaireación adecuada.
   6. Siga los métodos complementarios para la calibración del transductor.
10. Después de diseccionar cuidadosamente alrededor del LPA, rodearlo con una cinta umbilical. Ligar el LPA atando la cinta umbilical. Tenga en cuenta la respuesta hemodinámica del animal a la ligadura si es relevante para el estudio. Aumente la ventilación minuto para compensar el aumento de la ventilación del espacio muerto creado tras la ligadura de LPA. Estos ajustes del ventilador mitigan la acidosis respiratoria.
11. Inyecte lentamente hasta 3 ml de solución salina en el oclusor de PA principal para asegurarse de que no haya fugas mientras monitorea la presión de RV desde la línea de presión RVOT. Una vez que se confirme la respuesta del RV, retire la solución salina inculcada.
12. Saque la línea de presión RVOT y el tubo oclusor PA del tórax un espacio intercostal debajo de la incisión de toracotomía.
13. Formar dos bolsas subdérmicas a lo largo de la capa fascial en el dorso izquierdo de las ovejas tan posteriormente hacia la columna vertebral como sea posible dentro del campo estéril. Estos sirven como sitios para los puertos de residencia (Figura 2C).
14. Usando un extractor de tubo torácico, tunelice la línea de presión RVOT y el tubo oclusor desde la incisión torácica hasta los sitios del puerto del dorso izquierdo.
15. Asegure tanto el tubo del oclusor como la línea de presión del RV a las conexiones de púas del puerto. Anclar el oclusor y el tubo de presión alrededor de los conectores del puerto con lazos adicionales. Utilice la conexión de conector de púas proporcionada para proteger la conexión (Figura 1C). Coloque los puertos dentro de los bolsillos subdérmicos preformados.
16. Anclar los puertos en tres ubicaciones alrededor de su borde a la fascia subyacente con suturas de polipropileno 3-0 para evitar la migración del puerto. Reapproximar el tejido subcutáneo, la dermis y la piel en capas con suturas de poliglactina 910. Reconfirmar las lecturas de presión a través del acceso percutáneo de los puertos. Enjuague el puerto RVOT con 5 ml (1000 UI/ml, 5000 unidades) de heparina sódica.
17. Coloque un tubo torácico de 16 franceses en la cavidad pleural izquierda a través de una incisión separada, asegúrelo a la piel y luego conéctelo a una unidad de drenaje de tubo torácico cerrada a una presión de -20 cm · _H2O. Coloque un punto en U desatado alrededor del tubo para facilitar el cierre después de la extracción del tubo torácico.
18. Administrar un bloqueo nervioso intercostal (0,5-1 mg/kg de bupivacaína) para la analgesia postoperatoria.
19. Cierre la toracotomía con suturas de figura de ocho, #2 poliglactina 910. Cierre la capa muscular pectoral con la poliglactina #0 910. Cierre el tejido subcutáneo en capas de suturas de poliglactina 910 y grape la piel.
20. Reposicione al animal a la recosta dorsal, retire el tubo orogástrico y luego suspenda el isoflurano.
21. Continuar con la ventilación mecánica y los cuidados de apoyo hasta que el pH de la sangre arterial > 7,35 y el _pCO2 < 55 mmHg.
22. Extubar una vez que el animal esté respirando espontáneamente, levantando la cabeza y masticando el tubo endotraqueal. Retire el tubo torácico antes de la recuperación anestésica completa. Ate la puntada en U para cerrar la incisión del tubo torácico.
23. Transfiera al animal a su jaula mientras monitorea su recuperación de la anestesia. Asegúrese de que el oxígeno suplementario (3-5 L / min por máscara facial) esté disponible en todo momento mientras las ovejas permanecen inmóviles. Controle los signos vitales cada hora durante las primeras 4 h, cada 8 h durante las siguientes 24 h, y una vez al día después de eso.

5. Recuperación postoperatoria

1. Monitoree diariamente los sitios de toracotomía e implantación portuaria para detectar signos de infección. Administrar antibiótico de acción prolongada (ceftiofur, 5 mg/kg por vía intramuscular) dentro de las 24 h posteriores al procedimiento y cada 3-4 días después de eso durante 1 semana.
2. Continúe el parche de fentanilo después de la operación durante un total de 72 h. Después de eso, proporcione analgesia adicional (por ejemplo, meloxicam, 1 mg / kg una vez al día por vía intramuscular) si el animal continúa mostrando signos de dolor (es decir, rechinar los dientes, frecuencia cardíaca elevada).
3. Retire las suturas externas y las grapas de la piel 10-14 días después de la cirugía o según lo recomendado por el personal veterinario.
4. Asegurar la protección del sitio del puerto contra el animal frotando o raspando los sitios del puerto contra las estructuras circundantes utilizando un apósito tubular (Figura 2D).

6. Anillamiento crónico de AF (9 - 10 semanas)

1. Transfiera las ovejas a un pequeño recinto. Cortar el exceso de lana alrededor de los puertos implantados.
2. Limpie las áreas afeitadas con alcohol isopropílico al 70%. Aplique el aerosol tópico de lidocaína para el anestésico local.
3. Prepare dos transductores de presión para monitorear las presiones de RV y manguito de oclusor (Figura 3A).
   1. Para ambos transductores: Conecte el extremo luer hembra del tubo de presión (36 pulgadas o más) al extremo luer macho del transductor. Conecte el extremo luer macho del tubo de presión a una de las conexiones luer hembra en una llave de paso de tres vías. Finalmente, conecte una aguja Huber de 22 G al extremo luer macho de esa llave de paso de tres vías.
   2. Para el transductor de presión RV: Cuelgue una bolsa salina heparinizada (2 UI / ml), perfore la bolsa con el conjunto de administración IV y conecte la conexión luer macho del conjunto de administración IV a la conexión luer hembra del transductor de presión RV. Luego, presurice la bolsa salina (por ejemplo, bolsa a presión).
   3. Para el transductor de oclusión: Cebar completamente el transductor y el tubo de presión. Coloque una tapa de luer macho en el extremo luer hembra del transductor de presión para evitar que el líquido del manguito se filtre de regreso al transductor.
   4. Conecte ambos transductores al hardware de adquisición de datos mediante un cable o adaptador adecuado.
4. Calibre los transductores como se especifica en el archivo complementario 1.
5. Haga clic en Inicio en la parte superior derecha de la ventana del software para comenzar a registrar el software de adquisición de datos para capturar formas de onda de presión de manguito rv y PA a 400 Hz.
6. Haga que un asistente proporcione una restricción leve del animal antes del acceso al puerto. Inserte la aguja Huber desde el transductor de presión RV hasta el puerto RV. Conecte una jeringa de 10 ml a la llave de paso de tres vías e intente extraer sangre de nuevo en la jeringa desde el puerto de RV (Figura 3B).
   1. Si es difícil tirar hacia atrás de la jeringa, primero inyecte solución salina de 5-10 ml en el puerto de RV para desalojar la fuente de oclusión.
   2. Si la obstrucción persiste, instila 2 mg de activador tisular del plasminógeno (tPA) en el puerto como agente fibrinolítico y déjelo durante la noche. Verifique al día siguiente para aspirar el tPA.
7. Una vez establecida la línea de presión RV, conecte la aguja Huber desde el transductor del manguito PA.
8. Capture los valores iniciales de las presiones del manguito RV y PA (Figura 3C). Tenga en cuenta cualquier cambio drástico con respecto a las lecturas anteriores.
   1. Si la presión del manguito de PA y / o RV disminuyó sustancialmente con respecto a la lectura anterior, puede ser una señal de que el manguito de PA está goteando.
   2. Observe otro signo obvio de fuga del manguito pago estudiando la forma de onda del manguito PA. Si la presión promedio del manguito de PA cae a una velocidad discernible, entonces hay una alta probabilidad de que el manguito tenga fugas.
      NOTA: Vuelva a comprobar que todas las conexiones luer del transductor de presión, el tubo y la llave de paso estén apretadas. El contenido de fluido altamente presurizado del manguito de PA puede fluir hacia atrás y filtrarse de las conexiones de luer sueltas.
      1. Si el manguito de PA tiene fugas, determine el alcance de la fuga. Si la tasa de fugas es lenta, entonces una estrategia de bandas más frecuente puede superar la fuga para que el modelo de enfermedad siga siendo efectivo.
9. Inyecte lentamente solución salina hipertónica al 3% en el puerto del oclusor mientras presta atención a las presiones de RV y manguito.
   1. Ajuste la cantidad de inyección en función de la gravedad deseada de la enfermedad de PH y el fenotipo de RV. Un aumento semanal de la presión del manguito en 100-150 mmHg es un objetivo razonable para desarrollar un fenotipo de RV compensador adaptativo.
   2. Los aumentos más rápidos en la presión del manguito (>250 mmHg por semana) probablemente producirán un fenotipo rv descompensante.
10. Una vez que el manguito país esté inflado a la cantidad deseada, retire la aguja Huber del puerto del manguito.
11. Obtenga una muestra de sangre del puerto de RV.
    1. Aspire 10 ml de sangre fuera del puerto de RV de manera estéril y reserve.
    2. Coloque una jeringa nueva en lugar de la jeringa de aspiración y aspire tanta sangre como sea necesario sin exceder el límite semanal de extracción de sangre del 7,5% del volumen total de sangre.
    3. Vuelva a conectar la jeringa original con sangre aspirada y devuélvala a través del puerto de RV.
    4. Tire de la palanca de la válvula del transductor de presión para enjuagar la solución salina heparinizada de la bolsa salina al puerto de RV. Continúe enjuagando hasta que toda la línea se vuelva clara e incolora.
12. Enjuague el puerto de RV con 10 ml de solución salina. Luego, enjuague aún más el puerto con 5 ml de 1000 U / ml de heparina sódica.
13. Repita los pasos 6.1-6.12 cada 1-4 días durante 9-10 semanas.

Resultados

Se utiliza un grupo representativo de 12 ovejas para mostrar la eficacia de este modelo para desarrollar diversos grados de PH-RVF. Entre estas ovejas, la presión media del manguito de PA aumentó de 32 ± 20 mmHg en la semana 1 a 1002 ± 429 mmHg en la semana 9. Esto resultó en el aumento de la media de RV y las presiones sistólicas de 28 ± 5 y 57 ± 7 mmHg en la semana 1, respectivamente, a 44 ± 7 y 93 ± 18 mmHg en la semana 9. Además, el perfil de presión del manguito de PA se superpuso a la saturación venosa...

Discusión

El modelo PH-RVF presentado puede inducir de manera confiable diferentes niveles de gravedad de la enfermedad para que coincida con los objetivos de la investigación. Se utilizan dos enfoques diferentes en combinación para inducir este modelo de enfermedad. En primer lugar, la ligadura LPA sirve para aumentar la resistencia vascular pulmonar y disminuir la capacitancia de ^PA11,12, estableciendo así el punto de partida del modelo crónico en un estado de poscar...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride Irrigation Pour Bottle by Baxter Healthcare, 1000 mL	Medline	BHL2F7124	Surgical Disposable
0.25% Bupivacaine	Hospira Inc	0409-1160-18	Medication, Intra-Operative
0.9% Normal Saline, 1000 mL	Baxter Healthcare Corp	0338-0049-04	Medication, Intra-Operative
0.9% Normal Saline, 500 mL	Baxter Healthcare Corp.,	0338-0049-03	Medication, Chronic PH
16 mm Heavy Duty Occluder with actuating tubing	Access Technologies	OC-16HD	Surgical Disposable
3-mL Skin Prep Applicator	Medline	MDF260400	Surgical Disposable
70% isopropyl alcohol prep pads	Medline	MDS090670	Disposable, Chronic PH
Adhesive bandage tape	Patterson Veterinary		Disposable, Chronic PH
Adson forceps	V. Mueller	NL1400	Surgical Instrument
Allis tissue forceps	V. Mueller	CH1560	Surgical Instrument
Aortic clamp, straight (bainbridge forceps)	V. Mueller	SU6001	Surgical Instrument
Backhaus towel forceps	V. Mueller	SU2900	Surgical Instrument
Bags, Infusion: Nonsterile Novaplus Infusion Bag, 500 mL	Medline	TCV4005H	Disposable, Chronic PH
Berry sternal needle holder	V. Mueller	CH2540	Surgical Instrument
Blades, Electrode: Electrode Blade, 6.5", with 0.24 cm Shaft	Medline	VALE15516	Surgical Disposable
Blades: Stainless-Steel Sterile Surgical Blade, Size #10	Medline	B-D371210	Surgical Disposable
Blades: Stainless-Steel Sterile Surgical Blade, Size #11	Medline	B-D371211	Surgical Disposable
Blades: Stainless-Steel Sterile Surgical Blade, Size #15	Medline	B-D371215	Surgical Disposable
BNC Male to BNC Male Cable	Digi-Key	415-0198-036	Equipment
Castroviejo needle holder	V. Mueller	CH8589	Surgical Instrument
Cefazolin	Apotex Corp	60505-6142-0	Medication, Intra-Operative
Ceftiofur Crystalline Free Acid	Zoetis Inc	54771-5223-1	Medication, Post-Operative
Chest Drain, with Dry Suction, Adult-Pediatric	Medline	DEKA6000LFH	Surgical Disposable
Chest tube passer	V. Mueller	CH04189	Surgical Instrument
COnfidence Flowprobes for Research (PAU-Series)	Transonic	24PAU	Equipment, Perivascular Flow Probe
Cooley tangential occlusion clamp	V. Mueller	CH6572	Surgical Instrument
Data Acquisition Hardware	ADInstruments	PowerLab 16/30	Equipment
DeBakey Aorta clamp	V. Mueller	CH7247	Surgical Instrument
DeBakey multi-purpose clamp	V. Mueller	CH7276	Surgical Instrument
Debakey tissue forceps, 12’’	V. Mueller	CH5906	Surgical Instrument
Debakey vascular tissue forceps 7 3/4’’	V. Mueller	CH5902	Surgical Instrument
Debakey vascular tissue forceps, 9’’	V. Mueller	CH5904	Surgical Instrument
Electrosurgical Generator	Covidien	Force FX-C	Equipment
Endotracheal Tube, 10mm	Patterson Veterinary	07-882-9008	Surgical Disposable
Enrofloxacin	Norbrook Laboratories Limited	55529-152-05	Medication, Intra-Operative
Fentanyl Transdermal Patch	Apotex Corp	60505-7007-2	Medication, Pre-Operative
Ferris smith tissue forceps	V. Mueller	SU2510	Surgical Instrument
Finochietto rib spreaders, large	V. Mueller	CH1220-1	Surgical Instrument
Finochietto rib spreaders, medium	V. Mueller	CH1215-1	Surgical Instrument
Flexsteel ribbon retractor, 1” x 13”	V. Mueller	SU3340	Surgical Instrument
Flexsteel ribbon retractor, 2” x 13”	V. Mueller	SU3346	Surgical Instrument
Foerster sponge forceps, curved	V. Mueller	GL660	Surgical Instrument
Gauze Sponges: Sterile X-ray Compatible Gauze Sponges, 16-Ply, 4" x 4"	Medline	PRM21430LFH	Surgical Disposable
Gerald-DeBakey forceps	V. Mueller	CH04242	Surgical Instrument
Glassman Allis	V. Mueller	SU6152	Surgical Instrument
Halsted mosquito forceps	V. Mueller	SU2702	Surgical Instrument
Harken clamp	V. Mueller	CH6462	Surgical Instrument
Heat Therapy Pump	Gaymar/Stryker	TP-400	Equipment
Heparin	Fresenius Kabi,	63323-540-31	Medication, Chronic PH
Hospira Primary IV Sets, 80"	Patterson Veterinary	07-835-0123	Surgical Disposable
Hypertonic saline 3%	Baxter Healthcare Corp.,	0338-0054-03	Medication, Chronic PH
Hypodermic Needle with Bevel and Regular Wall, 20 G x 1"	Medline	B-D305175Z	Disposable, Chronic PH
Interface Cable, Edwards LifeScience Transducer to ADInstruments  Bridge Amplifier	Fogg System	0395-2434	Equipment
Intravenous Infusion Pump	Heska	Vet/IV 2.2 Infusion Pump	Equipment
Isoflurane	Patterson Veterinary	14043-704-06	Medication, Pre-Operative
Kantrowitz thoracic clamp, 9-1/2”	V. Mueller	CH1722	Surgical Instrument
Kelly hemostats	V. Mueller	88-0314	Surgical Instrument
Lidocaine HCl, 2.46%	PRN Pharmacal,	49427-434-04	Medication, Chronic PH
Ligaclip Multiple-Clip Appliers by Ethicon	Medline	ETHMCS20	Surgical Disposable
Loop, Vessel, Mini, Red, 2/pk, Sterile	Medline	DYNJVL12	Surgical Disposable
Lorna non-perforating towel forceps	V. Mueller	SU2937	Surgical Instrument
Mayo dissecting scissors, curved	V. Mueller	SU1826	Surgical Instrument
Mayo dissecting scissors, straight	V. Mueller	SU1821	Surgical Instrument
Medipore Dress-It Pre-Cut Dressing Covers by 3M	Medline	MMM2955Z	Surgical Disposable
Meloxicam	Patterson Veterinary	14043-909-10	Medication, Post-Operative
Mixter thoracic forceps, 9”	V. Mueller	CH1730-003	Surgical Instrument
Mosquito hemostats	V. Mueller	88-0301	Surgical Instrument
Multi-Channel Research Consoles	Transonic	T402/T403	Equipment, Perivascular Flow Meter
Multi-Lumen Central Venous Catheterization Kits	Medline	ARW45703XP1AH	Surgical Disposable
Multi-Parameter Vital Signs Monitor	Smiths Medical	SurgiVet Advisor 3	Equipment
Needles: Hypodermic Needle with Regular Bevel, Sterile, 18 G x 1.5"	Medline	B-D305185Z	Surgical Disposable
No. 3 knife handle	V. Mueller	SU1403-001	Surgical Instrument
No. 7 knife handle	V. Mueller	SU1407	Surgical Instrument
Non-Vented Male Luer Cap	Qosina	13614	Disposable, Chronic PH
Octal Bridge Amplifier	ADInstruments	FE228	Equipment
Ophthalmic Ointment	Akorn Animal Health	59399-162-35	Medication, Pre-Operative
Penrose Tubing, 6 mm x 46 cm, 11 mm Flat	Medline	SWD514604H	Surgical Disposable
Perma-Hand Black Braided Silk:  2-0 SH Taperpoint Needle, Control Release, 30"	Medline	ETHD8552	Surgical Disposable
Perma-Hand Suture, Black Braided, Size 0, 6 x 30”	Medline	ETHA306H	Surgical Disposable
Perma-Hand Suture, Black Braided, Size 4-0, 12 x 30"	Medline	ETHA303H	Surgical Disposable
Phenylephrine	West-Ward	0641-6142-25	Medication, Intra-Operative
Polyhesive Cordless Patient Return Electrodes, Adult	Medline	SWDE7509	Surgical Disposable
Port-A-Cath Huber Needle, Straight, 22 G x 1-1/2"	Medline	AAKM21200724	Disposable, Chronic PH
PROLENE Monofilament Suture, Blue, Size 4-0, 36", Double Arm, RB-1 Needle	Medline	ETHD7143	Surgical Disposable
PROLENE Polypropylene Monofilament Suture, Blue, Double-Armed, RB-1 Needle, Size 5-0, 24"	Medline	ETH8555H	Surgical Disposable
Regional Block Needles, 22-gauge	Medline	B-D408348Z	Surgical Disposable
Schnidt tonsil artery forceps	V. Mueller	M01700	Surgical Instrument
Skin staple extractor	Medline	CND3031	Disposable, Chronic PH
Skin stapler 35 wide, with counter	Medline	STAPLER35W	Surgical Disposable
Sphygmomanometer	Medline		Equipment
Sponge bowl	V. Mueller	GE-75	Surgical Instrument
Sponge, Lap: X-Ray Detectable Sterile Lap Sponge, 18" x 18", 5/Pack	Medline	MDS241518HH	Surgical Disposable
Sponge, Peanut: X-Ray Detectable Sterile Peanut Sponge, Small, 3/8"	Medline	MDS72038	Surgical Disposable
Sterile Disposable Deluxe OR Towel, Blue, 17'' x 27'', 2/Pack	Medline	MDT2168202	Surgical Disposable
Sterile Luer-Lock Syringe, 3 mL	Medline	SYR103010Z	Disposable, Chronic PH
Sterile Luer-Lock Syringe, 5 mL	Medline	SYR105010Z	Disposable, Chronic PH
Sterile Surgical Equipment Probe Covers	Medline	DYNJE5930	Surgical Disposable
Stopcock: 3-Way Stopcock with Handle in OFF Position, Rotating Adaptor Male Collar Fitting, 45 PSI	Medline	DYNJSC301	Surgical Disposable
Stopcock: 3-Way Stopcock with Handle in OFF Position, Rotating Adaptor Male Collar Fitting, 45 PSI	Medline	DYNJSC301	Disposable, Chronic PH
Subcutaneous Port with 5-French Connector and Blue Boot	Access Technologies	CP2AC-5NC	Surgical Disposable
Super cut metzenbaum dissecting scissors	V. Mueller	CH2032-S	Surgical Instrument
Super cut nelson-metzenbaum dissecting scissors	V. Mueller	CH2025-S	Surgical Instrument
Syringes: Sterile Luer-Lock Syringe, 10 mL	Medline	SYR110010Z	Surgical Disposable
Thoracic Catheter, Straight, 28 Fr x 20"	Medline	SWD570549H	Surgical Disposable
Three-quarter surgical drape	Medline	DYNJP2414H	Surgical Disposable
Tiletamine + Zolazepam	Zoetis Inc	54771-9050-1	Medication, Pre-Operative
TourniKwik Tourniquet Set with Four 7.5" Bronze-Colored Tubes and 1 Snare, 12 French	Medline	CVR79013	Surgical Disposable
Transducer clip	Edwards LifeScience	TCLIP05	Equipment
Trigger Aneroid Gauge (Sphygmomanometer)	Patterson Veterinary	07-815-0464	Equipment
TruWave Disposable Pressure Transducer Kits by Edwards Lifesciences	Medline	VSYPX260	Surgical Disposable and Chronic PH
TS420 Perivascular Flow Module	Transonic	TS420	Equipment, Perivascular Flow Meter
Tubing, Suction: Sterile Universal Suction Tubing with Straight Ribbed Connectors, 1/4" x 12'	Medline	OR612	Surgical Disposable
Tubing: Pressure Monitoring Tubing with Fixed Male Luer Lock and Female Fitting, Low Pressure, 72" L	Medline	DYNJPMTBG72MF	Surgical Disposable
Tubing: Pressure Monitoring Tubing with Fixed Male Luer Lock and Female Fitting, Low Pressure, 72" L	Medline	DYNJPMTBG72MF	Disposable, Chronic PH
Tubular Elastic Dressing Retainer	Medline	DERGL711	Disposable, Chronic PH
Tuffier rib retractor	V. Mueller	CD1101	Surgical Instrument
Tygon E-3603 Flexible Tubings	Fisher Scientific	14-171-227	Surgical Disposable
U.S.A retractor	V. Mueller	SU3660	Surgical Instrument
Umbilical Tape, Cotton, 3-Strand, 1/8 x 36"	Medline	ETHU12TH	Surgical Disposable
Valleylab Button Switch Pencil	Medline	VALE2516H	Surgical Disposable
Vanderbilt deep vessel forceps	V. Mueller	CH1687	Surgical Instrument
Veterinary Anesthesia Machine	Midmark	Matrx VMC	Equipment
Veterinary Anesthesia Ventilator	Hallowell EMC	Model 2000	Equipment
Vicryl: Undyed Coated Vicryl 0 CT-1 36" Suture	Medline	ETHVCP946H	Surgical Disposable
Vicryl: Undyed Coated Vicryl 2 TP-1 Taper 54" Suture	Medline	ETHVCP880T	Surgical Disposable
Vicryl: Undyed Coated Vicryl 2-0 CT-1 18" Suture	Medline	ETHVCP739D	Surgical Disposable
Vital crile-wood needle holder, 10-3/8”	V. Mueller	CH2427	Surgical Instrument
Vital mayo-hegar needle holder, 7-1/4”	V. Mueller	CH2417	Surgical Instrument
Vital metzenbaum dissecting scissors, 14’’	V. Mueller	CH2009	Surgical Instrument
Vital metzenbaum dissecting scissors, 9”	V. Mueller	CH2006	Surgical Instrument
Vital ryder needle holder, 9”	V. Mueller	CH2510	Surgical Instrument
Yankauer, Bulb Tip: Sterile Rigid Yankauer with Bulb Tip, No Vent	Medline	DYND50130	Surgical Disposable