Un grande modello animale per l'ipertensione polmonare e l'insufficienza ventricolare destra: legatura dell'arteria polmonare sinistra e bendaggio progressivo dell'arteria polmonare principale nelle pecore

Riepilogo

Questo manoscritto descrive la tecnica chirurgica e l'approccio sperimentale per sviluppare un grave sovraccarico di pressione ventricolare destra per modellare i loro fenotipi adattivi e disadattivi.

Abstract

L'insufficienza ventricolare destra scompensata (RVF) nell'ipertensione polmonare (PH) è fatale, con opzioni di trattamento medico limitate. Lo sviluppo e la sperimentazione di nuove terapie per il PH richiede un modello animale di grandi dimensioni clinicamente rilevante di aumento della resistenza vascolare polmonare e della RVF. Questo manoscritto discute l'ultimo sviluppo del modello PH-RVF ovino precedentemente pubblicato che utilizza la legatura dell'arteria polmonare sinistra (PA) e l'occlusione PA principale. Questo modello di PH-RVF è una piattaforma versatile per controllare non solo la gravità della malattia, ma anche la risposta fenotipica del RV.

Le pecore adulte (60-80 kg) sono state sottoposte a legatura PA (LPA) sinistra, posizionamento del bracciale PA principale e inserimento del monitor di pressione RV. Il bracciale PA e il monitor di pressione RV sono stati collegati alle porte sottocutanee. I soggetti sono stati sottoposti a banding PROGRESSIVO PA due volte a settimana per 9 settimane con misure sequenziali di pressione RV, pressione del bracciale PA e gas ematico venoso misto (_SvO2). All'inizio e all'endpoint di questo modello, la funzione ventricolare e le dimensioni sono state valutate utilizzando l'ecocardiografia. In un gruppo rappresentativo di 12 soggetti animali, la pressione media e sistolica del RV è aumentata da 28 ± 5 e 57 ± 7 mmHg alla settimana 1, rispettivamente, a 44 ± 7 e 93 ± 18 mmHg (deviazione standard media ±) entro la settimana 9. L'ecocardiografia ha dimostrato risultati caratteristici del PH-RVF, in particolare la dilatazione del camper, l'aumento dello spessore della parete e l'incurvamento del setto. L'andamento longitudinale della pressione del bracciale _SvO2 e PA dimostra che il tasso di banding PA può essere titolato per suscitare fenotipi RV variabili. Una strategia di banding PA più veloce ha portato a un calo precipitoso di _SvO2 < 65%, indicando uno scompenso RV, mentre una strategia più lenta e più ritmata ha portato al mantenimento di SvO2 fisiologico al 70% -80%. Un animale che ha sperimentato la strategia accelerata ha sviluppato diversi litri di versamento pleurico e ascite entro la settimana 9. Questo modello ph-RVF cronico fornisce uno strumento prezioso per studiare i meccanismi molecolari, sviluppare biomarcatori diagnostici e consentire l'innovazione terapeutica per gestire l'adattamento e il disadattamento del RV dal PH.

Introduzione

L'insufficienza ventricolare destra scompensata (RV) è la causa predominante di morbilità e mortalità per i pazienti con ipertensione polmonare (PH). Il fallimento del camper è responsabile di oltre il 50% dei ricoveri in pazienti con PH ed è una causa comune di morte in questa popolazione di ^pazienti1,2. Sebbene gli attuali trattamenti medici per il PH possano fornire misure temporizzanti, non invertono la progressione della malattia. Come tale, l'unico trattamento a lungo termine è il trapianto di polmone. Per esplorare e testare nuovi trattamenti e interventi medici per PH e RVF, è necessario un modello animale clinicamente rilevante per ricapitolare la complessa fisiopatologia della malattia. In particolare, vi è una grande necessità clinica di sviluppare terapie mirate al camper per i pazienti con PH per migliorare la funzione del RV. Ad oggi, la maggior parte degli studi pubblicati sugli animali sulla disfunzione di PH e RV si sono basati su piccoli mammiferi come topi e ^ratti3. D'altra parte, ci sono stati solo una manciata di modelli animali di grandi dimensioni per studiare la malattia e la fisiopatologia RV da postcarico anormale4,5,6,7. Inoltre, nessuno dei modelli animali di grandi dimensioni precedentemente pubblicati include descrizioni di procedure sperimentali per la titolazione controllata della gravità della malattia che porta in modo differenziale a fenotipi di fallimento RV compensati rispetto a quelli scompensati. Un modello animale di PH che può essere titolato per indurre insufficienza RV acuta e cronica con vari gradi di compensazione è necessario per studiare i meccanismi della malattia e per sviluppare, testare e tradurre nuove diagnosi e terapie per PH e RVF nella pratica clinica. Un tale modello in un animale di grandi dimensioni è particolarmente prezioso per lo sviluppo di dispositivi di supporto circolatorio ^meccanico8.

Qui, viene presentato un modello PH-RVF cronico di grandi dimensioni che utilizza la legatura dell'arteria polmonare sinistra (PA) e il bendaggio PA principale progressivo nelle pecore ^adulte9,10. La legatura del PA sinistro (LPA) aumenta la resistenza vascolare polmonare e diminuisce la capacità ^pa11,12. L'approccio progressivo di banding PA consente una titolazione precisa della gravità della malattia e dell'adattamento RV. Questa piattaforma può anche essere prontamente utilizzata per l'indagine longitudinale della progressione della malattia verso lo scompenso del RV. Le procedure e i processi necessari per eseguire questo modello sono presentati come una risorsa per gli investigatori interessati a una grande piattaforma animale per sviluppare nuovi trattamenti per PH e RVF.

Protocollo

Il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso il Vanderbilt University Medical Center ha approvato il protocollo. Le procedure descritte sono state condotte in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del Consiglio nazionale delle ricerche degli Stati Uniti, 8a edizione. La panoramica e la tempistica della procedura sperimentale sono fornite nella Figura 1. La tabella supplementare 1 descrive il sesso, il peso, la razza, la fonte di ovini e altre informazioni pertinenti che possono essere utili ai fini della riproducibilità.

1. Un giorno prima dell'intervento chirurgico, preparazione dell'animale

1. Trattenere il cibo per 24-40 ore prima della procedura chirurgica per decomprimere il rumine dell'animale.
2. Applicare un cerotto di fentanil da 50 μg/h su un'area tosata sul dorso della pecora 12 ore prima della procedura. Pulire l'area con clorexidina per rimuovere i residui di olio di lanolina prima dell'applicazione del cerotto. Coprire e proteggere il cerotto con una medicazione tubolare elastica.

2. Giorno dell'intervento, fasi pre-operatorie nella sala di preparazione

1. Somministrare tiletamina/zolazepam per via intramuscolare (2,2-5 mg/kg) e somministrare l'1%-3% di isoflurano miscelato con l'80%-100% di ossigeno tramite una maschera facciale per indurre l'anestesia.
2. Posizionare la pecora supina sul tavolo di preparazione e fissare le zampe.
3. Intubare con un tubo endotracheale da 10 mm e avviare la ventilazione meccanica in modalità di controllo del volume (volume di marea, TV = 10 ml / kg, frequenza respiratoria, RR = 15 respiri al minuto).
4. Rasare il campo chirurgico dal collo della pecora alla parte superiore dell'addome, come descritto di seguito.
   1. Rasare il collo anteriore della pecora per esporre la pelle sovrastante le vene giugulari per il cateterismo venoso centrale (vedere passo 3.7).
   2. Radere bilateralmente il torace anterolaterale in preparazione alla toracotomia (vedere fase 4.1).
   3. Radere il lato sinistro del busto dal torace alla schiena (cioè, dorsalmente come il tavolo permetterà con il soggetto in posizione supina), e dal seno al fianco posteriore caudalmente, in preparazione per l'impianto di porte sottocutanee (vedi passaggi 4.12-4.15).
5. Inserire un angiocatetere da 20 G nell'arteria auricolare per il monitoraggio della pressione arteriosa e il prelievo di gas nel sangue.
6. Posizionare un tubo di silicone con un diametro interno di 3/8 "-1/2" per la decompressione ruminale. Il tubo orogastrico rimarrà nel rumine durante l'intera procedura.
7. Trasportare l'animale dalla sala di preparazione pre-operatoria alla suite chirurgica.

3. Giorno dell'intervento chirurgico, fasi pre-operatorie nella suite operatoria

1. Ricollegare le pecore al ventilatore nella suite chirurgica e continuare la ventilazione con la stessa impostazione nel passaggio 2.3 (isoflurano 1%-3%, TV = 10 ml / kg, RR = 15 respiri al minuto)
2. Collegare i sensori di pulsossimetria (_SpO2), pressione arteriosa, temperatura, capnografo di fine marea ed elettrocardiogramma (ECG) al monitor anestetico.
3. Collegare i sensori per i segni vitali all'animale.
   1. Posizionare il pulsossimetro sulla lingua dell'animale.
   2. Posizionare la sonda di temperatura nel retto.
   3. Collegare le sonde a elettrocardiogramma a 3 derivazioni: posizionare il piombo rosso sulla gamba posteriore sinistra, il piombo bianco sulla gamba anteriore destra e il piombo nero sulla gamba anteriore sinistra.
   4. Collegare l'estremità luer maschio del rubinetto a tre vie all'angiocatetere dell'arteria auricolare e collegare l'estremità luer femmina opposta al trasduttore di pressione per il monitoraggio della linea arteriosa utilizzando un tubo di pressione di dimensioni appropriate.
      1. Allineare il trasduttore al livello della tavola operatoria.
      2. Aprire il rubinetto a tre vie sul trasduttore.
      3. Scorrere la manopola principale del monitor vitals per evidenziare il canale della pressione arteriosa, quindi premere la manopola per selezionare il canale.
      4. Selezionate ZERO IBP per azzerare il trasduttore.
   5. Collegare il collegamento luer maschio della linea del monitor capnografico al collegamento luer femmina sul tubo del ventilatore per monitorare la _CO2 di fine marea.
4. Impostare le pompe IV per la somministrazione continua di fluidi e il supporto inotropo o vasopressore.
   1. Perforare il setto sulla sacca salina con il set di somministrazione endovenosa. Assicurarsi che il tubo IV sia bloccato prima di perforare il sacchetto per evitare fuoriuscite.
   2. Allineare e montare il tubo del set di somministrazione IV nella pompa a rulli IV e verificare se la direzione specificata sulla pompa corrisponde alla direzione di somministrazione del fluido.
      NOTA: assicurarsi che il set di somministrazione IV sia compatibile con la pompa IV.
   3. Accendere la pompa e specificare PRIME per rimuovere tutta l'aria nella linea.
5. Posizionare le pecore per la procedura operativa.
   1. Dalla posizione supina, ruotare la pecora in una posizione parziale laterale destra decubito.
   2. Fissare il piede anteriore destro verso il basso e fissare il piede anteriore sinistro mentre lo si ritrae cefalade e laterale con corda o cinghie atraumatiche.
   3. Eseguire l'ecocardiografia transtoracica per la valutazione al basale dell'anatomia e della funzione ventricolare. L'ecografia è utile anche per determinare lo spazio intercostale ottimale che facilita l'accesso chirurgico sia all'arteria polmonare principale che all'arteria polmonare sinistra.
6. Pulire il campo chirurgico privo di sporco e altri contaminanti usando sapone o spazzola scrub. Preparare il collo e il torace con soluzione di clorexidina o betadina e drappeggiare il campo chirurgico in modo sterile.
7. Utilizzando la guida ad ultrasuoni o punti di riferimento anatomici, accedere alla vena giugulare interna sinistra o destra utilizzando un ago del mirino o un angiocato. Utilizzando la tecnica Seldinger, inserire un catetere venoso centrale a 7 lumi francesi nella vena giugulare interna per l'accesso endovenoso e il monitoraggio della pressione venosa centrale.
   1. Utilizzare la porta prossimale per il monitoraggio della pressione e la porta distale per la somministrazione di liquidi e farmaci.
8. Somministrare 20 mg/kg di cefazolina e 5 mg/kg di enrofloxacina per via endovenosa. Ripetere il dosaggio di cefazolin ogni 2-4 ore durante la procedura.
9. Somministrare un bolo da 500 ml di soluzione salina normale per aumentare il precarico prima dell'intervento chirurgico. Iniziare una velocità di mantenimento del fluido per via endovenosa di 15 ml/ kg / h.

4. Procedura operativa

1. Eseguire una mini-toracotomia che risparmia i muscoli (lunghezza < 8 cm) nel quarto spazio intercostale sinistro per ottenere l'esposizione al mediastino. Scegli la mini-toracotomia per accelerare il recupero postoperatorio.
   1. Dopo aver diviso la pelle, dividere il muscolo sottostante (pettorale maggiore) longitudinalmente lungo le sue fibre, che corrono leggermente oblique allo spazio intercostale. Posizionare un riavvolgitore auto-trattenuto per diffondere lo strato muscolare ed esporre la parete toracica.
   2. Dividere il serrato anteriore e il muscolo intercostale sottostante nello spazio intercostale selezionato, avendo cura di rimanere immediatamente cefalad alla costola.
   3. Entra nello spazio pleurico e poi continua a rilasciare completamente i muscoli intercostali posteriormente verso la colonna vertebrale e anteromedialmente verso lo sterno per prevenire fratture involontarie della costola o lussazione allo sterno. Evitare lesioni ai vasi mammari medialmente.
   4. Posizionare i riavvolgitori auto-trattenibili per aprire lo spazio delle costole e il tessuto molle sovrastante. Utilizzare un divaricatore Finochietto piccolo o medio per separare le costole e un divaricatore Tuffier (lama retrattile da 5 cm) per sedersi perpendicolarmente al Finochietto all'interno dello spazio intercostale, che ritrae i tessuti molli all'interno dello spazio intercostale per migliorare l'esposizione.
2. Incidere il pericardio anteriore al nervo frenico senza ferirlo e creare un pozzo pericardico con suture di seta 2-0 per esporre il PA e il RV principali. Identificare l'appendice atriale sinistra all'interno dell'esposizione come punto di riferimento per il livello della biforcazione PA.
   1. Valutare l'esposizione e assicurarsi che sia stato inserito lo spazio intercostale appropriato. Idealmente, il PA prossimale e l'appendice atriale sinistra sono facilmente visibili direttamente sotto l'incisione, suggerendo che lo spazio intercostale ottimale è stato selezionato per fornire esposizione sia al PA principale che all'LPA.
   2. Se l'esposizione è ritenuta inadeguata per raggiungere in sicurezza sia il PA principale che l'LPA, non esitare ad aprire uno spazio intercostale aggiuntivo per compiere tutti i passaggi necessari dell'operazione; tuttavia, questo non sarà necessario con un'appropriata selezione dell'incisione.
3. Sezionare intorno al PA principale e isolarlo con un nastro ombelicale. Garantire un'adeguata dissezione posteriore per l'eventuale posizionamento dell'occlusore e la sonda di flusso PA il più distale possibile sul PA principale.
   1. Posizionare una sonda di flusso sterile in una ciotola d'acqua o soluzione salina sul campo sterile per calibrare il software di acquisizione dati. Consegnare la spina elettrica all'altra estremità a un designato non sterile per collegare la sonda al misuratore.
      1. Fare riferimento ai documenti supplementari per i dettagli sul collegamento e la calibrazione della sonda di flusso e del misuratore PA.
   2. Applicare una generosa quantità di gel ad ultrasuoni sterile nella scanalatura della sonda di flusso PA.
   3. Inserire il rivestimento in silicone nella scanalatura della sonda di flusso PA e applicare uno strato aggiuntivo di gel ad ultrasuoni sul rivestimento.
   4. Posizionare la sonda di flusso PA sul PA e acquisire le letture del flusso PA sul misuratore di portata e sull'interfaccia di acquisizione dati.
      1. Il posizionamento della sonda di flusso PA può causare un'occlusione parziale del PA che può ridurre il precarico ventricolare sinistro e la pressione arteriosa media. Prestare particolare attenzione all'emodinamica durante l'acquisizione del flusso PA.
      2. Controllare sullo schermo del flussometro per assicurarsi che la potenza del segnale di flusso PA sia di 5 bar. Se il misuratore visualizza meno di 5 bar, garantire un contatto adeguato tra la sonda di flusso e il PA principale. Applicare ulteriore gel ad ultrasuoni, se necessario.
4. Completare la dissezione intrapericardica di LPA e circondarla con un nastro ombelicale.
   1. Utilizzare un piccolo bastoncino di spugna o un sottile divaricatore malleabile per la retrazione caudale dell'appendice atriale sinistra.
      NOTA: L'esposizione all'LPA è facilitata dalla retrazione caudale dell'appendice atriale sinistra, dalla retrazione cefalade del PA principale e dalla retrazione laterale del pericardio appena anteriore a dove l'LPA esce dal pericardio.
5. Posizionare un occlusore vascolare in silicone per impieghi gravosi attorno al PA principale (Figura 2A,B, cerchio). La dimensione dell'occlusore può essere regolata in base al diametro del PA; assicurarsi che la vestibilità sia aderente. Utilizzare una sutura di seta 0 su un ago Keith per fissare le estremità dell'occlusore vascolare insieme a un punto U. Una volta fissato attorno al PA principale, far scorrere l'occlusore distalmente lungo il PA principale.
6. Circondare il PA principale prossimale con uno scarico Penrose da 1/2" per facilitare la dissezione e riservare spazio per posizionare una sonda di flusso al successivo intervento chirurgico ri-operatorio. Tagliare lo scarico Penrose per adattarlo liberamente al PA e fissare il Penrose a se stesso con una sutura Prolene 4-0 in esecuzione (Figura 2B).
7. Stabilire una linea di pressione RV per il monitoraggio delle pressioni RV (Figura 2B, freccia bianca).
   1. Selezionare una posizione per la linea di pressione del camper nella parete priva di tratto di deflusso del camper. Posizionare un monofilamento 5-0, sutura a cordone di borsa in polipropilene non assorbibile con pegni che circondano la posizione selezionata e posizionare un laccio vascolare. Prendi le promesse da un guanto chirurgico sterile.
   2. Preparare la linea di pressione del camper: tagliare l'estremità maschile del tubo di pressione sterile da 36 '' con un angolo di 30 ° per facilitare l'inserimento attraverso il miocardio. Utilizzare una cravatta di seta 2-0 per contrassegnare la linea di pressione a una profondità ottimale per il posizionamento all'interno del camper.
   3. Usando un bisturi a 11 lame, fai una piccola cardiotomia nella parete libera di RVOT all'interno della sutura a cordone di borsa precedentemente posizionata. Controllare il sanguinamento con la pressione manuale o stringendo il laccio sulla sutura del cordone della borsa.
      NOTA: Ottenere una biopsia di base della parete libera da camper in questa fase campionando il tessuto RV all'interno della sutura della stringa della borsa. Questo sito di biopsia può quindi fungere da punto di ingresso per la linea di pressione RV.
   4. Inserire e fissare l'estremità tagliata del tubo di pressione nel tratto di deflusso RV (RVOT). Legare il cordone della borsa e quindi fissare il cordone della borsa al tubo di pressione per fissare la linea di pressione.
8. Estendere il tubo RVOT collegando un tubo di pressione aggiuntivo alla linea di pressione RVOT.
9. Consegnare il tubo di pressione aggiuntivo a un designato non sterile per collegare il tubo a un trasduttore di pressione e monitorare la misurazione della pressione RV di base. Impostare il trasduttore di pressione come segue.
   1. Collegare l'estremità luer maschile del set di somministrazione IV all'estremità luer femminile del trasduttore.
   2. Collegare l'estremità luer femmina del tubo di pressione all'estremità luer maschile del trasduttore.
   3. Inserire la somministrazione endovenosa in una sacca salina eparinizzata (2 UI/mL).
   4. Inserire il sacchetto salino in un sacchetto a pressione e pompare il sacchetto a pressione a 250-300 mmHg come indicato sul manometro.
   5. Innescare completamente la linea rilasciando la valvola sul trasduttore, garantendo una corretta de-airing.
   6. Seguire i metodi supplementari per la calibrazione del trasduttore.
10. Dopo aver accuratamente sezionato intorno all'LPA, circondarlo con un nastro ombelicale. Ligate l'LPA legando il nastro ombelicale. Si noti la risposta emodinamica dell'animale alla legatura, se rilevante per lo studio. Aumentare la ventilazione minima per compensare l'aumento della ventilazione dello spazio morto creato dalla legatura dell'LPA. Queste regolazioni del ventilatore mitigano l'acidosi respiratoria.
11. Iniettare lentamente fino a 3 ml di soluzione salina nell'occlusore PA principale per garantire che non vi siano perdite durante il monitoraggio della pressione RV dalla linea di pressione RVOT. Una volta confermata la risposta RV, ritirare la soluzione salina instillata.
12. Portare la linea di pressione RVOT e il tubo dell'occlusore PA fuori dal torace uno spazio intercostale sotto l'incisione toracotomia.
13. Formare due tasche sottodermiche lungo lo strato fasciale sul dorso sinistro della pecora per quanto possibile verso la colonna vertebrale all'interno del campo sterile. Questi servono come siti per le porte interne (Figura 2C).
14. Utilizzando un estrattore di tubi toracici, tunnel la linea di pressione RVOT e tubi occlusi dall'incisione toracica verso i siti della porta del dorso sinistro.
15. Fissare sia il tubo dell'occlusore che la linea di pressione del camper alle connessioni barbe del porto. Ancorare l'occlusore e il tubo di pressione attorno ai connettori della porta con fascette aggiuntive. Utilizzare il raccordo del connettore spinato fornito per proteggere la connessione (Figura 1C). Posizionare le porte all'interno delle tasche sottodermiche preformate.
16. Ancorare le porte in tre posizioni attorno al bordo alla fascia sottostante con suture in polipropilene 3-0 per impedire la migrazione del porto. Riassegnare il tessuto sottocutaneo, il derma e la pelle in strati con suture di poliglattina 910. Riconfermare le letture della pressione attraverso l'accesso percutaneo delle porte. Lavare la porta RVOT con 5 mL (1000 UI/mL, 5000 unità) di eparina sodica.
17. Posizionare un tubo toracico a 16 francesi nella cavità pleurica sinistra attraverso un'incisione separata, fissarlo alla pelle e quindi collegarlo a un'unità di drenaggio del tubo toracico chiuso ad una pressione di -20 cm·_H2O. Posizionare un punto a U slegato attorno al tubo per facilitare la chiusura dopo la rimozione del tubo toracico.
18. Somministrare un blocco del nervo intercostale (0,5-1 mg/kg di bupivacaina) per l'analgesia postoperatoria.
19. Chiudi la toracotomia con figure-of-eight, #2 poliglactin 910 suture. Chiudere lo strato muscolare pettorale con running #0 polyglactin 910. Chiudere il tessuto sottocutaneo in strati di suture di poliglactina 910 #2-0 in esecuzione e pinzare la pelle.
20. Riposizionare l'animale alla reclinazione dorsale, rimuovere il tubo orogastrico e quindi interrompere l'isoflurano.
21. Continuare la ventilazione meccanica e le cure di supporto fino a quando il pH del sangue arterioso > 7,35 e il _pCO2 < 55 mmHg.
22. Estubare una volta che l'animale respira spontaneamente, sollevando la testa e masticando il tubo endotracheale. Rimuovere il tubo toracico prima del recupero anestetico completo. Legare il punto a U per chiudere l'incisione del tubo toracico.
23. Trasferire l'animale nella sua gabbia mentre si monitora il recupero dell'anestesia. Assicurarsi che l'ossigeno supplementare (3-5 L / min con maschera facciale) sia disponibile in ogni momento mentre le pecore rimangono immobili. Monitorare i segni vitali ogni ora per le prime 4 ore, ogni 8 ore per le successive 24 ore e una volta al giorno dopo.

5. Recupero postoperatorio

1. Monitorare quotidianamente i siti di toracotomia e impianto delle porte per rilevare eventuali segni di infezione. Somministrare antibiotici a lunga durata d'azione (ceftiofur, 5 mg/kg per via intramuscolare) entro 24 ore dalla procedura e ogni 3-4 giorni dopo quella per 1 settimana.
2. Continuare il cerotto di fentanil postoperatoriamente per un totale di 72 ore. Successivamente, fornire ulteriore analgesia (ad esempio, meloxicam, 1 mg / kg una volta al giorno per via intramuscolare) se l'animale continua a mostrare segni di dolore (ad esempio, digrignamento dei denti, frequenza cardiaca elevata).
3. Rimuovere le suture esterne e le graffette cutanee 10-14 giorni dopo l'intervento chirurgico o come raccomandato dal personale veterinario.
4. Garantire la protezione del sito portuale dall'animale che sfrega o raschia i siti portuali contro le strutture circostanti utilizzando una medicazione tubolare (Figura 2D).

6. Bendaggio PA cronico (9 - 10 settimane)

1. Trasferisci le pecore in un piccolo recinto. Tagliare la lana in eccesso attorno alle porte impiantate.
2. Pulire le aree rasate con alcool isopropilico al 70%. Applicare spray topico alla lidocaina per anestetico locale.
3. Preparare due trasduttori di pressione per il monitoraggio delle pressioni dei polsini RV e occlusori (Figura 3A).
   1. Per entrambi i trasduttori: collegare l'estremità luer femmina del tubo a pressione (36 in o più) all'estremità luer maschio del trasduttore. Collegare l'estremità luer maschio del tubo di pressione a una delle connessioni luer femmina su un rubinetto a tre vie. Infine, collega un ago Huber da 22 G all'estremità luer maschio di quel rubinetto a tre vie.
   2. Per il trasduttore di pressione per camper: appendere un sacchetto salino eparinizzato (2 UI/mL), forare il sacchetto con il set di somministrazione IV e collegare la connessione luer maschio del set di somministrazione IV alla connessione luer femmina del trasduttore di pressione RV. Quindi, pressurizzare il sacchetto salino (ad esempio, sacchetto a pressione).
   3. Per il trasduttore dell'occlusore: innescare completamente il trasduttore e il tubo di pressione. Mettere un cappuccio luer maschio sull'estremità luer femmina del trasduttore di pressione per evitare che il fluido del bracciale fuoriesca verso il trasduttore.
   4. Collegare entrambi i trasduttori all'hardware di acquisizione dati utilizzando un cavo o un adattatore appropriato.
4. Calibrare i trasduttori come specificato nel file supplementare 1.
5. Fare clic su Start in alto a destra della finestra del software per avviare la registrazione del software di acquisizione dati per acquisire forme d'onda di pressione del bracciale RV e PA a 400 Hz.
6. Chiedi a un assistente di fornire una leggera moderazione dell'animale prima dell'accesso al porto. Inserire l'ago Huber dal trasduttore di pressione RV alla porta RV. Attaccare una siringa da 10 mL al rubinetto a tre vie e tentare di aspirare il sangue nella siringa dalla porta RV (Figura 3B).
   1. Se è difficile tirare indietro la siringa, prima iniettare 5-10 ml di soluzione salina nella porta RV per rimuovere la fonte di occlusione.
   2. Se l'intasamento persiste, instillare 2 mg di attivatore tissutale del plasminogeno (tPA) nella porta come agente fibrinolitico e lasciarlo durante la notte. Controllare il giorno seguente per aspirare il tPA.
7. Una volta stabilita la linea di pressione del camper, collegare l'ago Huber dal trasduttore del bracciale PA.
8. Acquisire i valori iniziali delle pressioni dei polsini RV e PA (Figura 3C). Nota eventuali cambiamenti drastici rispetto alle letture precedenti.
   1. Se la pressione del bracciale PA e / o del camper è scesa sostanzialmente rispetto alla lettura precedente, potrebbe essere un segno che il bracciale PA sta perdendo.
   2. Osserva un altro segno evidente di perdita del bracciale PA studiando la forma d'onda del bracciale PA. Se la pressione media del bracciale PA scende a una velocità distinguibile, allora c'è un'alta probabilità che il bracciale stia perdendo.
      NOTA: controllare nuovamente che tutte le connessioni luer sul trasduttore di pressione, sul tubo e sul rubinetto di arresto siano serrate. Il contenuto di fluido altamente pressurizzato dal bracciale PA può fluire indietro e fuoriuscire da connessioni luer allentate.
      1. Se il bracciale PA perde, determinare l'entità della perdita. Se il tasso di perdita è lento, una strategia di banding più frequente può superare la perdita per rendere il modello di malattia ancora efficace.
9. Iniettare lentamente il 3% di soluzione salina ipertonica nella porta dell'occlusore prestando attenzione alle pressioni del camper e del bracciale.
   1. Regolare la quantità di iniezione in base alla gravità della malattia PH desiderata e al fenotipo RV. Un aumento settimanale della pressione del bracciale di 100-150 mmHg è un obiettivo ragionevole per sviluppare un fenotipo RV compensativo adattivo.
   2. Aumenti più rapidi della pressione del bracciale (>250 mmHg a settimana) produrranno probabilmente un fenotipo RV scompensante.
10. Una volta che il bracciale PA è gonfiato alla quantità desiderata, rimuovere l'ago Huber dalla porta del bracciale.
11. Ottenere un campione di sangue dalla porta RV.
    1. Aspirare 10 ml di sangue dalla porta del camper in modo sterile e mettere da parte.
    2. Posizionare una nuova siringa al posto della siringa di aspirazione e aspirare tutto il sangue necessario senza superare il limite settimanale di prelievo di sangue del 7,5% del volume totale del sangue.
    3. Ricollegare la siringa originale con sangue aspirato e restituirla attraverso la porta RV.
    4. Tirare la leva della valvola del trasduttore di pressione per lavare la soluzione salina eparinizzata dal sacchetto salino nella porta RV. Continuare a lavare fino a quando l'intera linea diventa chiara e incolore.
12. Lavare la porta RV con 10 ml di soluzione salina. Quindi, lavare ulteriormente la porta con 5 mL di 1000 U / mL di eparina sodica.
13. Ripetere i passaggi 6.1-6.12 ogni 1-4 giorni per 9-10 settimane.

Risultati

Un gruppo rappresentativo di 12 pecore viene utilizzato per mostrare l'efficacia di questo modello per lo sviluppo di vari gradi di PH-RVF. Tra queste pecore, la pressione media del bracciale PA è aumentata da 32 ± 20 mmHg alla settimana 1 a 1002 ± 429 mmHg alla settimana 9. Ciò ha comportato un aumento della media RV e delle pressioni sistoliche da 28 ± 5 e 57 ± 7 mmHg alla settimana 1, rispettivamente, a 44 ± 7 e 93 ± 18 mmHg entro la settimana 9. Inoltre, il profilo di pressione del bracciale PA è stato sovra...

Discussione

Il modello PH-RVF presentato può indurre in modo affidabile diversi livelli di gravità della malattia per soddisfare gli obiettivi dell'indagine. Due diversi approcci sono utilizzati in combinazione per indurre questo modello di malattia. In primo luogo, la legatura LPA serve ad aumentare la resistenza vascolare polmonare e diminuire la capacità ^PA11,12, stabilendo così il punto di partenza del modello cronico in uno stato di postcarico RV già aumentato. Qui...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride Irrigation Pour Bottle by Baxter Healthcare, 1000 mL	Medline	BHL2F7124	Surgical Disposable
0.25% Bupivacaine	Hospira Inc	0409-1160-18	Medication, Intra-Operative
0.9% Normal Saline, 1000 mL	Baxter Healthcare Corp	0338-0049-04	Medication, Intra-Operative
0.9% Normal Saline, 500 mL	Baxter Healthcare Corp.,	0338-0049-03	Medication, Chronic PH
16 mm Heavy Duty Occluder with actuating tubing	Access Technologies	OC-16HD	Surgical Disposable
3-mL Skin Prep Applicator	Medline	MDF260400	Surgical Disposable
70% isopropyl alcohol prep pads	Medline	MDS090670	Disposable, Chronic PH
Adhesive bandage tape	Patterson Veterinary		Disposable, Chronic PH
Adson forceps	V. Mueller	NL1400	Surgical Instrument
Allis tissue forceps	V. Mueller	CH1560	Surgical Instrument
Aortic clamp, straight (bainbridge forceps)	V. Mueller	SU6001	Surgical Instrument
Backhaus towel forceps	V. Mueller	SU2900	Surgical Instrument
Bags, Infusion: Nonsterile Novaplus Infusion Bag, 500 mL	Medline	TCV4005H	Disposable, Chronic PH
Berry sternal needle holder	V. Mueller	CH2540	Surgical Instrument
Blades, Electrode: Electrode Blade, 6.5", with 0.24 cm Shaft	Medline	VALE15516	Surgical Disposable
Blades: Stainless-Steel Sterile Surgical Blade, Size #10	Medline	B-D371210	Surgical Disposable
Blades: Stainless-Steel Sterile Surgical Blade, Size #11	Medline	B-D371211	Surgical Disposable
Blades: Stainless-Steel Sterile Surgical Blade, Size #15	Medline	B-D371215	Surgical Disposable
BNC Male to BNC Male Cable	Digi-Key	415-0198-036	Equipment
Castroviejo needle holder	V. Mueller	CH8589	Surgical Instrument
Cefazolin	Apotex Corp	60505-6142-0	Medication, Intra-Operative
Ceftiofur Crystalline Free Acid	Zoetis Inc	54771-5223-1	Medication, Post-Operative
Chest Drain, with Dry Suction, Adult-Pediatric	Medline	DEKA6000LFH	Surgical Disposable
Chest tube passer	V. Mueller	CH04189	Surgical Instrument
COnfidence Flowprobes for Research (PAU-Series)	Transonic	24PAU	Equipment, Perivascular Flow Probe
Cooley tangential occlusion clamp	V. Mueller	CH6572	Surgical Instrument
Data Acquisition Hardware	ADInstruments	PowerLab 16/30	Equipment
DeBakey Aorta clamp	V. Mueller	CH7247	Surgical Instrument
DeBakey multi-purpose clamp	V. Mueller	CH7276	Surgical Instrument
Debakey tissue forceps, 12’’	V. Mueller	CH5906	Surgical Instrument
Debakey vascular tissue forceps 7 3/4’’	V. Mueller	CH5902	Surgical Instrument
Debakey vascular tissue forceps, 9’’	V. Mueller	CH5904	Surgical Instrument
Electrosurgical Generator	Covidien	Force FX-C	Equipment
Endotracheal Tube, 10mm	Patterson Veterinary	07-882-9008	Surgical Disposable
Enrofloxacin	Norbrook Laboratories Limited	55529-152-05	Medication, Intra-Operative
Fentanyl Transdermal Patch	Apotex Corp	60505-7007-2	Medication, Pre-Operative
Ferris smith tissue forceps	V. Mueller	SU2510	Surgical Instrument
Finochietto rib spreaders, large	V. Mueller	CH1220-1	Surgical Instrument
Finochietto rib spreaders, medium	V. Mueller	CH1215-1	Surgical Instrument
Flexsteel ribbon retractor, 1” x 13”	V. Mueller	SU3340	Surgical Instrument
Flexsteel ribbon retractor, 2” x 13”	V. Mueller	SU3346	Surgical Instrument
Foerster sponge forceps, curved	V. Mueller	GL660	Surgical Instrument
Gauze Sponges: Sterile X-ray Compatible Gauze Sponges, 16-Ply, 4" x 4"	Medline	PRM21430LFH	Surgical Disposable
Gerald-DeBakey forceps	V. Mueller	CH04242	Surgical Instrument
Glassman Allis	V. Mueller	SU6152	Surgical Instrument
Halsted mosquito forceps	V. Mueller	SU2702	Surgical Instrument
Harken clamp	V. Mueller	CH6462	Surgical Instrument
Heat Therapy Pump	Gaymar/Stryker	TP-400	Equipment
Heparin	Fresenius Kabi,	63323-540-31	Medication, Chronic PH
Hospira Primary IV Sets, 80"	Patterson Veterinary	07-835-0123	Surgical Disposable
Hypertonic saline 3%	Baxter Healthcare Corp.,	0338-0054-03	Medication, Chronic PH
Hypodermic Needle with Bevel and Regular Wall, 20 G x 1"	Medline	B-D305175Z	Disposable, Chronic PH
Interface Cable, Edwards LifeScience Transducer to ADInstruments  Bridge Amplifier	Fogg System	0395-2434	Equipment
Intravenous Infusion Pump	Heska	Vet/IV 2.2 Infusion Pump	Equipment
Isoflurane	Patterson Veterinary	14043-704-06	Medication, Pre-Operative
Kantrowitz thoracic clamp, 9-1/2”	V. Mueller	CH1722	Surgical Instrument
Kelly hemostats	V. Mueller	88-0314	Surgical Instrument
Lidocaine HCl, 2.46%	PRN Pharmacal,	49427-434-04	Medication, Chronic PH
Ligaclip Multiple-Clip Appliers by Ethicon	Medline	ETHMCS20	Surgical Disposable
Loop, Vessel, Mini, Red, 2/pk, Sterile	Medline	DYNJVL12	Surgical Disposable
Lorna non-perforating towel forceps	V. Mueller	SU2937	Surgical Instrument
Mayo dissecting scissors, curved	V. Mueller	SU1826	Surgical Instrument
Mayo dissecting scissors, straight	V. Mueller	SU1821	Surgical Instrument
Medipore Dress-It Pre-Cut Dressing Covers by 3M	Medline	MMM2955Z	Surgical Disposable
Meloxicam	Patterson Veterinary	14043-909-10	Medication, Post-Operative
Mixter thoracic forceps, 9”	V. Mueller	CH1730-003	Surgical Instrument
Mosquito hemostats	V. Mueller	88-0301	Surgical Instrument
Multi-Channel Research Consoles	Transonic	T402/T403	Equipment, Perivascular Flow Meter
Multi-Lumen Central Venous Catheterization Kits	Medline	ARW45703XP1AH	Surgical Disposable
Multi-Parameter Vital Signs Monitor	Smiths Medical	SurgiVet Advisor 3	Equipment
Needles: Hypodermic Needle with Regular Bevel, Sterile, 18 G x 1.5"	Medline	B-D305185Z	Surgical Disposable
No. 3 knife handle	V. Mueller	SU1403-001	Surgical Instrument
No. 7 knife handle	V. Mueller	SU1407	Surgical Instrument
Non-Vented Male Luer Cap	Qosina	13614	Disposable, Chronic PH
Octal Bridge Amplifier	ADInstruments	FE228	Equipment
Ophthalmic Ointment	Akorn Animal Health	59399-162-35	Medication, Pre-Operative
Penrose Tubing, 6 mm x 46 cm, 11 mm Flat	Medline	SWD514604H	Surgical Disposable
Perma-Hand Black Braided Silk:  2-0 SH Taperpoint Needle, Control Release, 30"	Medline	ETHD8552	Surgical Disposable
Perma-Hand Suture, Black Braided, Size 0, 6 x 30”	Medline	ETHA306H	Surgical Disposable
Perma-Hand Suture, Black Braided, Size 4-0, 12 x 30"	Medline	ETHA303H	Surgical Disposable
Phenylephrine	West-Ward	0641-6142-25	Medication, Intra-Operative
Polyhesive Cordless Patient Return Electrodes, Adult	Medline	SWDE7509	Surgical Disposable
Port-A-Cath Huber Needle, Straight, 22 G x 1-1/2"	Medline	AAKM21200724	Disposable, Chronic PH
PROLENE Monofilament Suture, Blue, Size 4-0, 36", Double Arm, RB-1 Needle	Medline	ETHD7143	Surgical Disposable
PROLENE Polypropylene Monofilament Suture, Blue, Double-Armed, RB-1 Needle, Size 5-0, 24"	Medline	ETH8555H	Surgical Disposable
Regional Block Needles, 22-gauge	Medline	B-D408348Z	Surgical Disposable
Schnidt tonsil artery forceps	V. Mueller	M01700	Surgical Instrument
Skin staple extractor	Medline	CND3031	Disposable, Chronic PH
Skin stapler 35 wide, with counter	Medline	STAPLER35W	Surgical Disposable
Sphygmomanometer	Medline		Equipment
Sponge bowl	V. Mueller	GE-75	Surgical Instrument
Sponge, Lap: X-Ray Detectable Sterile Lap Sponge, 18" x 18", 5/Pack	Medline	MDS241518HH	Surgical Disposable
Sponge, Peanut: X-Ray Detectable Sterile Peanut Sponge, Small, 3/8"	Medline	MDS72038	Surgical Disposable
Sterile Disposable Deluxe OR Towel, Blue, 17'' x 27'', 2/Pack	Medline	MDT2168202	Surgical Disposable
Sterile Luer-Lock Syringe, 3 mL	Medline	SYR103010Z	Disposable, Chronic PH
Sterile Luer-Lock Syringe, 5 mL	Medline	SYR105010Z	Disposable, Chronic PH
Sterile Surgical Equipment Probe Covers	Medline	DYNJE5930	Surgical Disposable
Stopcock: 3-Way Stopcock with Handle in OFF Position, Rotating Adaptor Male Collar Fitting, 45 PSI	Medline	DYNJSC301	Surgical Disposable
Stopcock: 3-Way Stopcock with Handle in OFF Position, Rotating Adaptor Male Collar Fitting, 45 PSI	Medline	DYNJSC301	Disposable, Chronic PH
Subcutaneous Port with 5-French Connector and Blue Boot	Access Technologies	CP2AC-5NC	Surgical Disposable
Super cut metzenbaum dissecting scissors	V. Mueller	CH2032-S	Surgical Instrument
Super cut nelson-metzenbaum dissecting scissors	V. Mueller	CH2025-S	Surgical Instrument
Syringes: Sterile Luer-Lock Syringe, 10 mL	Medline	SYR110010Z	Surgical Disposable
Thoracic Catheter, Straight, 28 Fr x 20"	Medline	SWD570549H	Surgical Disposable
Three-quarter surgical drape	Medline	DYNJP2414H	Surgical Disposable
Tiletamine + Zolazepam	Zoetis Inc	54771-9050-1	Medication, Pre-Operative
TourniKwik Tourniquet Set with Four 7.5" Bronze-Colored Tubes and 1 Snare, 12 French	Medline	CVR79013	Surgical Disposable
Transducer clip	Edwards LifeScience	TCLIP05	Equipment
Trigger Aneroid Gauge (Sphygmomanometer)	Patterson Veterinary	07-815-0464	Equipment
TruWave Disposable Pressure Transducer Kits by Edwards Lifesciences	Medline	VSYPX260	Surgical Disposable and Chronic PH
TS420 Perivascular Flow Module	Transonic	TS420	Equipment, Perivascular Flow Meter
Tubing, Suction: Sterile Universal Suction Tubing with Straight Ribbed Connectors, 1/4" x 12'	Medline	OR612	Surgical Disposable
Tubing: Pressure Monitoring Tubing with Fixed Male Luer Lock and Female Fitting, Low Pressure, 72" L	Medline	DYNJPMTBG72MF	Surgical Disposable
Tubing: Pressure Monitoring Tubing with Fixed Male Luer Lock and Female Fitting, Low Pressure, 72" L	Medline	DYNJPMTBG72MF	Disposable, Chronic PH
Tubular Elastic Dressing Retainer	Medline	DERGL711	Disposable, Chronic PH
Tuffier rib retractor	V. Mueller	CD1101	Surgical Instrument
Tygon E-3603 Flexible Tubings	Fisher Scientific	14-171-227	Surgical Disposable
U.S.A retractor	V. Mueller	SU3660	Surgical Instrument
Umbilical Tape, Cotton, 3-Strand, 1/8 x 36"	Medline	ETHU12TH	Surgical Disposable
Valleylab Button Switch Pencil	Medline	VALE2516H	Surgical Disposable
Vanderbilt deep vessel forceps	V. Mueller	CH1687	Surgical Instrument
Veterinary Anesthesia Machine	Midmark	Matrx VMC	Equipment
Veterinary Anesthesia Ventilator	Hallowell EMC	Model 2000	Equipment
Vicryl: Undyed Coated Vicryl 0 CT-1 36" Suture	Medline	ETHVCP946H	Surgical Disposable
Vicryl: Undyed Coated Vicryl 2 TP-1 Taper 54" Suture	Medline	ETHVCP880T	Surgical Disposable
Vicryl: Undyed Coated Vicryl 2-0 CT-1 18" Suture	Medline	ETHVCP739D	Surgical Disposable
Vital crile-wood needle holder, 10-3/8”	V. Mueller	CH2427	Surgical Instrument
Vital mayo-hegar needle holder, 7-1/4”	V. Mueller	CH2417	Surgical Instrument
Vital metzenbaum dissecting scissors, 14’’	V. Mueller	CH2009	Surgical Instrument
Vital metzenbaum dissecting scissors, 9”	V. Mueller	CH2006	Surgical Instrument
Vital ryder needle holder, 9”	V. Mueller	CH2510	Surgical Instrument
Yankauer, Bulb Tip: Sterile Rigid Yankauer with Bulb Tip, No Vent	Medline	DYND50130	Surgical Disposable