Um grande modelo animal para hipertensão pulmonar e falha ventricular direita: Ligação da Artéria Pulmonar Esquerda e Banda de Artéria Pulmonar Principal Progressiva em Ovelhas

Resumo

Este manuscrito descreve a técnica cirúrgica e a abordagem experimental para desenvolver uma severa sobrecarga de pressão ventricular direita para modelar seus fenótipos adaptativos e mal-dados.

Resumo

A falha ventricular direita descompensada (RVF) na hipertensão pulmonar (AP) é fatal, com opções limitadas de tratamento médico. Desenvolver e testar novas terapêuticas para PH requer um modelo animal de grande porte clinicamente relevante de maior resistência vascular pulmonar e RVF. Este manuscrito discute o mais recente desenvolvimento do modelo ph-RVF ovino publicado anteriormente que utiliza a ligadura da artéria pulmonar esquerda (PA) e a oclusão principal do PA. Este modelo de PH-RVF é uma plataforma versátil para controlar não apenas a gravidade da doença, mas também a resposta fenotípica do RV.

Ovinos adultos (60-80 kg) foram submetidos à ligadura esquerda pa (LPA), colocação do manguito pa principal e inserção do monitor de pressão rv. O manguito pa e o monitor de pressão rv foram conectados a portas subcutâneas. Os sujeitos foram submetidos a banda progressiva de PA duas vezes por semana durante 9 semanas com medidas sequenciais de pressão de RV, pressões de manguitos pa e gás sanguíneo venoso misto (SvO2). Na iniciação e ponto final deste modelo, a função ventricular e as dimensões foram avaliadas por meio da ecocardiografia. Em um grupo representativo de 12 indivíduos animais, a pressão média e sistólica da RV aumentou de 28 ± 5 e 57 ± 7 mmHg na semana 1, respectivamente, para 44 ± 7 e 93 ± 18 mmHg (média ± desvio padrão) na semana 9. A ecocardiografia demonstrou achados característicos de PH-RVF, notadamente dilatação de RV, aumento da espessura da parede e inclinação septal. A tendência longitudinal da pressão do manguito _SvO2 e pa demonstra que a taxa de banda de PA pode ser titulada para provocar fenótipos de RV variados. Uma estratégia mais rápida de banda de PA levou a um declínio vertiginoso no _SvO2 < 65%, indicando a descompensação do RV, enquanto uma estratégia mais lenta e mais acelerada levou à manutenção do SvO2 fisiológico em 70%-80%. Um animal que experimentou a estratégia acelerada desenvolveu vários litros de derrame pleural e ascites na semana 9. Este modelo crônico de PH-RVF fornece uma ferramenta valiosa para estudar mecanismos moleculares, desenvolver biomarcadores diagnósticos e permitir a inovação terapêutica para gerenciar a adaptação e a má adaptação do RV a partir de PH.

Introdução

A falha ventricular direita descompensada (RV) é a causa predominante de morbidade e mortalidade para pacientes com hipertensão pulmonar (AP). A falha do RV é responsável por mais de 50% das internações em pacientes com PH e é uma causa comum de morte nessa população ^{de pacientes1,2}. Embora os tratamentos médicos atuais para a AP possam fornecer medidas temporizantes, eles não revertem a progressão da doença. Como tal, o único tratamento a longo prazo é o transplante de pulmão. Para explorar e testar novos tratamentos médicos e intervenções para PH e RVF, é necessário um modelo animal clinicamente relevante para recapitular a fisiopatologia complexa da doença. Em particular, há uma grande necessidade clínica de desenvolver terapêutica direcionada a RV para pacientes com PH para melhorar a função de RV. Até o momento, a maioria dos estudos em animais publicados sobre disfunção de PH e RV tem se apoiado em pequenos mamíferos, como camundongos e ^ratos3. Por outro lado, houve apenas um punhado de grandes modelos animais para estudar a doença e a fisiopatologia rv de pós-carga anormal4,5,6,7. Além disso, nenhum dos modelos animais de grande porte publicados anteriormente incluem descrições de procedimentos experimentais para titulação controlada da gravidade da doença que diferencialmente leva a fenótipos compensados versus descompensados de falha de RV. Um modelo animal de PH que pode ser titulado para induzir falha de RV aguda e crônica com diferentes graus de compensação é necessário para estudar mecanismos de doença e desenvolver, testar e traduzir novos diagnósticos e terapêuticas para PH e RVF na prática clínica. Tal modelo em um animal grande é especialmente valioso para o desenvolvimento de dispositivos de suporte circulatório ^mecânico8.

Aqui, ^{é apresentado um} modelo de PH-RVF animal crônico e grande utilizando ligadura pulmonar esquerda (PA) e banda progressiva de AF principal em ovinos adultos^. A ligadura da PA esquerda (LPA) aumenta a resistência vascular pulmonar e diminui a capacitância de ^PA11,12. A abordagem progressiva de banda de AF permite a titulação precisa da gravidade da doença e adaptação do RV. Esta plataforma também pode ser prontamente utilizada para investigação longitudinal da progressão da doença em direção à descompensação do RV. Os procedimentos e processos necessários para a execução desse modelo são apresentados como um recurso para pesquisadores interessados em uma grande plataforma animal para desenvolver novos tratamentos para PH e RVF.

Protocolo

O Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro Médico da Universidade Vanderbilt aprovou o protocolo. Os procedimentos descritos foram conduzidos de acordo com o Guia do Conselho Nacional de Pesquisa dos EUA para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, 8ª edição. A visão geral e a linha do tempo do procedimento experimental estão previstas na Figura 1. A Tabela Suplementar 1 descreve o sexo, o peso, a raça, a origem das ovelhas e outras informações relevantes que podem ser úteis para fins de reprodutibilidade.

1. Um dia antes da cirurgia, preparação do animal

1. Reter alimentos por 24-40 h antes do procedimento cirúrgico para descomprimir o rúsco do animal.
2. Aplique um patch de fentanil de 50 μg/h em uma área de corte no dorso da ovelha 12 h antes do procedimento. Limpe a área com clorexidina para remover resíduos de óleo de lanolina antes da aplicação do patch. Cubra e proteja o patch com um curativo tubular elástico.

2. Dia da cirurgia, etapas pré-operatórias na sala de preparação

1. Administre tiletamina/zolazepam intramuscularmente (2,2-5 mg/kg) e entregue 1%-3% de isoflurane misturado com 80%-100% de oxigênio através de uma máscara facial para induzir anestesia.
2. Posicione o supino de ovelhas sobre a mesa de preparação e segure suas pernas.
3. Entubar com tubo endotraqueal de 10 mm e iniciar ventilação mecânica sob o modo de controle de volume (volume de maré, TV = 10 mL/kg, taxa respiratória, RR = 15 respirações por minuto).
4. Raspe o campo cirúrgico do pescoço da ovelha até o abdômen superior, conforme detalhado abaixo.
   1. Raspe o pescoço anterior da ovelha para expor a pele sobrevoando as veias jugulares para cateterismo venoso central (ver passo 3.7).
   2. Raspe o tórax anterolateral bilateralmente em preparação para a toracotomia (ver passo 4.1).
   3. Raspe o lado esquerdo do tronco do peito para trás (ou seja, tão dorsalmente quanto a mesa permitirá com o sujeito na posição supina), e da mama ao flanco traseiro caudalmente, em preparação para implantação de portas subcutâneas (ver passos 4.12-4.15).
5. Insira um angiocateter de 20 G na artéria auricular para monitoramento da pressão arterial e amostragem de gás arterial.
6. Coloque um tubo de silicone com diâmetro interno de 3/8"-1/2" para descompressão de rumen. A sonda orogástrica permanecerá no rúsco durante todo o procedimento.
7. Transporte o animal da sala de preparação pré-operatória para a suíte cirúrgica.

3. Dia de cirurgia, etapas pré-operatórias na suíte de operação

1. Reconecte as ovelhas ao ventilador na suíte cirúrgica, e continue a ventilação no mesmo ajuste na etapa 2.3 (isoflurane 1%-3%, TV = 10 mL/kg, RR = 15 respirações por minuto)
2. Conecte os sensores de oximetria de pulso (_SpO2), pressão arterial, temperatura, capnógrafo de marés finais e eletrocardiograma (ECG) ao monitor anestésico.
3. Conecte os sensores para sinais vitais ao animal.
   1. Coloque o oxímetro de pulso na língua do animal.
   2. Coloque a sonda de temperatura no reto.
   3. Conecte sondas de eletrocardiograma de 3 chumbo: Coloque o chumbo vermelho na perna traseira esquerda, o chumbo branco na perna dianteira direita e o chumbo preto na perna anterior esquerda.
   4. Conecte a extremidade de luer macho da torneira a três ao angiocateter da artéria auricular e conecte a extremidade feminina oposta à extremidade transdutor de pressão para monitoramento da linha arterial usando um tubo de pressão de tamanho apropriado.
      1. Alinhe o transdutor ao nível da tabela de operação.
      2. Abra a torneira de três vias no transdutor.
      3. Role o botão principal do monitor de sinais vitais para destacar o canal de pressão arterial e, em seguida, pressione o botão para selecionar o canal.
      4. Selecione ZERO IBP para zerar o transdutor.
   5. Conecte a conexão luer masculina da linha de monitor de capnografia à conexão luer feminina no tubo do ventilador para monitorar o _CO2 de maré final.
4. Configure as bombas intravenosas para administração contínua de fluidos e suporte inotrópico ou vasopressor.
   1. Perfure o septo no saco salino com o conjunto de administração IV. Certifique-se de que a tubulação IV está presa antes de perfurar o saco para evitar derramamento.
   2. Alinhe e encaixe a tubulação do conjunto de administração IV na bomba de rolo IV e verifique se a direção especificada na bomba corresponde à direção da administração do fluido.
      NOTA: Certifique-se de que o conjunto de administração IV é compatível com a bomba IV.
   3. Ligue a bomba e especifique o PRIME para remover todo o ar da linha.
5. Posicione as ovelhas para o procedimento cirúrgico.
   1. Da posição supina, gire as ovelhas para uma posição parcial lateral lateral decúbito.
   2. Fixar o pé dianteiro direito para baixo e fixar o pé dianteiro esquerdo enquanto retrava-o cefaleia e lateral com corda ou alças atraumáticas.
   3. Realize a ecocardiografia transtorácica para avaliação da linha de base da anatomia e função ventriculares. A ultrassonografia também é útil para determinar o espaço intercostal ideal que facilita o acesso cirúrgico tanto à artéria pulmonar principal quanto à artéria pulmonar esquerda.
6. Limpe o campo cirúrgico livre de sujeira e outros contaminantes usando sabão ou escova de esfregar. Prepare o pescoço e o peito com solução de clorexidina ou betadina e coloque o campo cirúrgico de forma estéril.
7. Usando orientação de ultrassom ou pontos de referência anatômicos, acesse a veia jugular interna esquerda ou direita usando uma agulha de localizador ou angiocato. Utilizando a técnica Seldinger, insira um cateter venoso central de 7-lúmen triplo-lúmen na veia jugular interna para acesso intravenoso e monitoramento de pressão venosa central.
   1. Use a porta proximal para monitoramento de pressão e porta distal para administração de fluidos e medicamentos.
8. Administre 20 mg/kg de cefazolina e 5 mg/kg de enrofloxacina por via intravenosa. Repita a dosagem de cefazolina a cada 2-4 horas durante o procedimento.
9. Administre um bolus de 500 mL de solução salina normal para aumentar a pré-carga antes da cirurgia. Inicie uma taxa de fluido intravenoso de manutenção de 15 mL/kg/h.

4. Procedimento operacional

1. Realize uma mini-toracotomia poupadora muscular (comprimento < 8 cm) no quarto espaço intercostal esquerdo para obter exposição mediastinal. Escolha mini-toracotomia para acelerar a recuperação pós-operatória.
   1. Depois de dividir a pele, divida o músculo subjacente (peitoral maior) longitudinalmente ao longo de suas fibras, que correm ligeiramente oblíquos ao espaço intercostal. Coloque um retrátil auto-retentor para espalhar a camada muscular e exponha a parede do peito.
   2. Divida o serratus anterior e o músculo intercostal subjacente no espaço intercostal selecionado, tomando o cuidado de ficar imediatamente cefálico na costela.
   3. Entre no espaço pleural e continue liberando totalmente os músculos intercostais posteriormente em direção à coluna vertebral e anteromedialmente em direção ao esterno para evitar fratura ou luxação inadvertida da costela no esterno. Evite ferimentos nos vasos mamários mediadamente.
   4. Coloque os retentores auto-retentores para abrir o espaço da costela e o tecido mole sobrelado. Use um retrátil Finochietto pequeno ou médio para separar as costelas e um retratedor Tuffier (lâmina retrátil de 5 cm) para sentar perpendicular ao Finochietto dentro do espaço intercostal, que retrai o tecido mole dentro do espaço intercostal para melhorar a exposição.
2. Incisar o pericárdio anterior ao nervo frênico sem feri-lo e criar um poço pericárdico com suturas de seda 2-0 para expor o PA principal e rv. Identifique o apêndice atrial esquerdo dentro da exposição como um marco para o nível da bifurcação do PA.
   1. Avalie a exposição e certifique-se se o espaço intercostal adequado foi inserido. Idealmente, o PA proximal e o apêndice atrial esquerdo são facilmente visíveis diretamente abaixo da incisão, sugerindo que o espaço intercostal ideal foi selecionado para fornecer exposição tanto ao PA principal quanto ao LPA.
   2. Se a exposição for considerada inadequada para alcançar com segurança tanto o PA principal quanto o LPA, não hesite em abrir um espaço intercostal adicional para realizar todas as etapas necessárias da operação; no entanto, isso não será necessário com a seleção de incisão apropriada.
3. Disseca ao redor do PA principal e isole-o com uma fita umbilical. Certifique-se de dissecção posterior adequada para a eventual colocação do oclusão e a sonda de fluxo pa o mais distal possível no PA principal.
   1. Coloque uma sonda de fluxo estéril em uma tigela de água ou soro fisiológico no campo estéril para calibrar o software de aquisição de dados. Entregue a tomada elétrica na outra extremidade para um design não estéril para conectar a sonda ao medidor.
      1. Consulte os documentos complementares para obter detalhes sobre a conexão e calibração da sonda de fluxo e do medidor de fluxo de PA.
   2. Aplique uma quantidade generosa de gel de ultrassom estéril na ranhura da sonda de fluxo PA.
   3. Coloque o forro de silicone na ranhura da sonda de fluxo PA e aplique uma camada adicional de gel de ultrassom no forro.
   4. Coloque a sonda de fluxo PA no PA e adquira leituras de fluxo de PA no medidor de fluxo e na interface de aquisição de dados.
      1. A colocação da sonda de fluxo pa pode causar oclusão parcial do PA que pode diminuir a pré-carga ventricular esquerda e a pressão arterial média. Preste atenção à hemodinâmica durante a aquisição do fluxo de PA.
      2. Verifique a tela do medidor de fluxo para garantir que a força do sinal de fluxo pa seja de 5 barras. Se o medidor exibir menos de 5 barras, certifique-se de um contato adequado entre a sonda de fluxo e a PA principal. Aplique gel de ultrassom adicional, se necessário.
4. Dissecção intra-pericárdica completa de LPA e circunda-a com uma fita umbilical.
   1. Use uma pequena vara de esponja ou retrátil maleável fino para retração caudal do apêndice atrial esquerdo.
      NOTA: A exposição ao LPA é facilitada pela retração caudal do apêndice atrial esquerdo, retração cefáade do PA principal e retração lateral do pericárdio apenas antes de onde o LPA sai do pericárdio.
5. Coloque um oclúlgio vascular de silicone pesado ao redor do PA principal (Figura 2A,B, círculo). O tamanho do oclúldio pode ser ajustado com base no diâmetro da AF; certifique-se de que o ajuste é confortável. Use uma sutura de seda 0 em uma agulha Keith para fixar as extremidades do oclúldio vascular junto com um ponto U. Uma vez fixado ao redor do PA principal, deslize o occlusalmente ao longo do PA principal.
6. Circundegue o PA principal proximal com um dreno de penrose de 1/2" para facilitar a dissecção e reservar espaço para colocar uma sonda de fluxo na cirurgia de re-operatória subsequente. Corte o ralo Penrose para caber solto ao redor do PA e fixar a Penrose para si mesma com uma sutura prolene 4-0 em execução (Figura 2B).
7. Estabeleça uma linha de pressão rv para monitoramento de pressões de RV (Figura 2B, seta branca).
   1. Selecione um local para a linha de pressão RV na parede sem saída do RV. Coloque uma sutura de bolsa de polifileno nãoabsorível 5-0 com penhores em torno do local selecionado e coloque uma armadilha vascular. Faça os candidatos de uma luva cirúrgica estéril.
   2. Prepare a linha de pressão do RV: corte a extremidade masculina da tubulação de pressão estéril de 36'' em um ângulo de 30° para facilitar a inserção através do miocárdio. Use uma gravata de seda 2-0 para marcar a linha de pressão em uma profundidade ideal para colocação dentro do RV.
   3. Usando um bisturi de 11 lâminas, faça uma pequena cardiotomia na parede livre RVOT dentro da sutura de corda de bolsa previamente colocada. Controle o sangramento com pressão manual ou apertando a armadilha na sutura da corda da bolsa.
      NOTA: Obtenha uma biópsia de linha de base da parede livre do RV nesta etapa, amostrando tecido rv dentro da sutura de corda de bolsa. Este local de biópsia pode então servir como o ponto de entrada para a linha de pressão do RV.
   4. Insira e fixe a extremidade de corte da tubulação de pressão no trato de saída do RV (RVOT). Amarre a corda da bolsa e, em seguida, segure a corda da bolsa na tubulação de pressão para fixar a linha de pressão.
8. Estenda a tubulação RVOT conectando uma tubulação de pressão adicional à linha de pressão RVOT.
9. Entregue a tubulação de pressão adicional a um design não estéril para conectar a tubulação a um transdutor de pressão e monitor para a medição da pressão do RV de base. Configure o transdutor de pressão da seguinte forma.
   1. Conecte o luer masculino do conjunto de administração IV ao luer feminino do transdutor.
   2. Conecte a extremidade de luer feminina do tubo de pressão à extremidade masculina do transdutor.
   3. Espetar a administração IV fixada em um saco salino heparinizado (2 UI/mL).
   4. Coloque o saco salino em um saco de pressão e bombeie o saco de pressão para 250-300 mmHg como indicado no medidor.
   5. Prime totalmente a linha liberando a válvula no transdutor, garantindo a des-arejada adequada.
   6. Siga métodos suplementares para calibração transdutor.
10. Depois de dissecar cuidadosamente ao redor do LPA, cerque-o com uma fita umbilical. Ligate o LPA amarrando a fita umbilical. Note a resposta hemodinâmica do animal à ligadura se for relevante para o estudo. Aumente a ventilação minuciosa para compensar o aumento da ventilação do espaço morto criada após a ligadura LPA. Esses ajustes do ventilador atenuam a acidose respiratória.
11. Injete lentamente até 3 mL de soro fisiológico no oclúdio principal do PA para garantir que não haja vazamento enquanto monitora a pressão do RV da linha de pressão RVOT. Uma vez confirmada a resposta do trailer, retire o soro fisiológico instilado.
12. Leve a linha de pressão RVOT e o tubo de oclusão pa para fora do peito um espaço intercostal abaixo da incisão de toracotomia.
13. Formar dois bolsões subdérmicos ao longo da camada fascial no dorso esquerdo das ovelhas tão posteriormente em direção à coluna como viável dentro do campo estéril. Estes servem como locais para portas de moradia (Figura 2C).
14. Usando um puxador de tubo torácico, túnel da linha de pressão RVOT e tubos de oclusão do ocúrio para os locais da porta dorsum esquerda.
15. Proteja tanto a tubulação de oclúdio quanto a linha de pressão rv para as conexões de barb do porto. Ancore o oclundo o ocluante e a tubulação de pressão ao redor dos conectores da porta com laços adicionais. Use o encaixe do conector farpado fornecido para proteger a conexão (Figura 1C). Assento as portas dentro dos bolsos subdérmicos pré-formados.
16. Ancore as portas em três locais ao redor de sua borda até a fáscia subjacente com suturas de polipropileno 3-0 para evitar a migração do porto. Reaproximar o tecido subcutâneo, derme e pele em camadas com suturas de poliglactina 910. Reconfirmar as leituras de pressão através do acesso percutâneo dos portos. Lave a porta RVOT com 5 mL (1000 UI/mL, 5000 unidades) de sódio de heparina.
17. Coloque um tubo torácico de 16 franceses na cavidade pleural esquerda através de uma incisão separada, fixe-o na pele e, em seguida, conecte-se a uma unidade de drenagem de tubos torácicos fechados a uma pressão de -20 cm·_H2O. Coloque um u-stitch desamarrado ao redor do tubo para facilitar o fechamento após a remoção do tubo torácico.
18. Administre um bloqueio nervoso intercostal (0,5-1 mg/kg bupivacaína) para analgesia pós-operatória.
19. Feche a toracotomia com figura de oito, suturas de poliglactina nº 2. Feche a camada muscular peitoral com poliglactina 910. Feche o tecido subcutâneo em camadas de poliglactina 910 e grampeie a pele.
20. Reposicione o animal para a recumência dorsal, retire a sonda orogástrica e, em seguida, descontinua o isoflurane.
21. Continue a ventilação mecânica e os cuidados de suporte até que o pH do sangue arterial > 7,35 e o _pCO2 < 55 mmHg.
22. Extubar quando o animal estiver respirando espontaneamente, levantando a cabeça e mastigando o tubo endotraqueal. Remova o tubo torácico antes da recuperação completa do anestésico. Amarre o ponto U para fechar a incisão do tubo torácico.
23. Transfira o animal para sua gaiola enquanto monitora sua recuperação da anestesia. Certifique-se de que o oxigênio suplementar (3-5 L/min por máscara facial) esteja disponível o tempo todo enquanto as ovelhas permanecem imóveis. Monitore sinais vitais a cada hora durante as primeiras 4h, a cada 8h para as próximas 24 horas, e uma vez por dia depois disso.

5. Recuperação pós-operatória

1. Monitore diariamente os locais de toracotomia e implantação de portas para sinais de infecção. Administre antibiótico de longa duração (ceftiofur, 5 mg/kg intramuscularmente) dentro de 24 horas após o procedimento e a cada 3-4 dias depois disso por 1 semana.
2. Continue o patch de fentanil no pós-operatório por um total de 72 horas. Depois disso, forneça analgesia adicional (por exemplo, meloxicam, 1 mg/kg uma vez por dia intramuscularmente) se o animal continuar a apresentar sinais de dor (ou seja, ranger os dentes, batimentos cardíacos elevados).
3. Remova as suturas externas e grampos de pele 10-14 dias após a cirurgia ou conforme recomendado pela equipe veterinária.
4. Certifique-se de proteção do local do porto contra o animal esfregando ou raspando os locais do porto contra estruturas circundantes usando um curativo tubular (Figura 2D).

6. Banda crônica de PA (9 - 10 semanas)

1. Transfira as ovelhas para um pequeno recinto. Cortar o excesso de lã ao redor das portas implantadas.
2. Limpe as áreas raspadas com 70% de álcool isopropílico. Aplique spray de lidocaína tópico para anestésico local.
3. Prepare dois transdutores de pressão para monitorar as pressões do punho rv e oclusão (Figura 3A).
   1. Para ambos os transdutores: Conecte a extremidade luer feminina da tubulação de pressão (36 ou mais) à extremidade luer masculina do transdutor. Conecte a extremidade luer macho da tubulação de pressão a uma das conexões femininas em uma torneira de três vias. Finalmente, conecte uma agulha Huber de 22 G à extremidade masculina da torneira de três vias.
   2. Para transdutor de pressão rv: Pendure um saco de soro fisiológico heparinizado (2 UI/mL), puna o saco com o conjunto de administração IV e conecte a conexão masculina do conjunto de administração IV à conexão luer feminina do transdutor de pressão rv. Em seguida, pressurize o saco salino (por exemplo, saco de pressão).
   3. Para o transdutor oclúdio: Prime o transdutor e o tubo de pressão totalmente. Coloque uma tampa de luer macho na extremidade luer fêmea do transdutor de pressão para evitar que o fluido da braçadeira vaze de volta para o transdutor.
   4. Conecte ambos os transdutores ao hardware de aquisição de dados usando um cabo ou adaptador apropriado.
4. Calibrar os transdutores conforme especificado no Arquivo Suplementar 1.
5. Clique em Iniciar no canto superior direito da janela de software para começar a gravar o software de aquisição de dados para capturar formas de onda de pressão de punho RV e PA a 400 Hz.
6. Tenha um assistente fornecer leve contenção do animal antes do acesso ao porto. Insira a agulha Huber do transdutor de pressão RV para a porta RV. Conecte uma seringa de 10 mL à torneira de três vias e tente retirar sangue de volta para a seringa da porta rv (Figura 3B).
   1. Se for difícil puxar para trás na seringa, primeiro injete 5-10 mL salina na porta rv para desalojar a fonte de oclusão.
   2. Se o entupimento persistir, insira 2 mg de ativador de plasmininogênio de tecido (tPA) na porta como agente fibrinolítico e deixe-o durante a noite. Verifique no dia seguinte para aspirar o tPA.
7. Uma vez estabelecida a linha de pressão do RV, conecte a agulha Huber do transdutor de punho PA.
8. Capture os valores iniciais das pressões de punho RV e PA (Figura 3C). Observe quaisquer mudanças drásticas em de leituras anteriores.
   1. Se a pressão do manguito e/ou do RV caiu substancialmente da leitura anterior, pode ser um sinal de que o manguito PA está vazando.
   2. Observe outro sinal óbvio de vazamento de manguito pa estudando a forma de onda de manguitos pa. Se a pressão média do punho pa cair a uma taxa perceptível, então há uma grande chance de que a braçadeira esteja vazando.
      NOTA: Verifique se todas as conexões de luer no transdutor de pressão, tubulação e torneira estão apertadas. O conteúdo de fluido altamente pressurizado da braçadeira pa pode fluir para trás e vazar de conexões mais soltas.
      1. Se a braçadeira estiver vazando, determine a extensão do vazamento. Se a taxa de vazamento for lenta, então uma estratégia de banda mais frequente pode superar o vazamento para tornar o modelo da doença ainda eficaz.
9. Injete lentamente 3% de soro fisiológico hipertônico na porta do oclusão, prestando atenção às pressões de RV e punho.
   1. Ajuste a quantidade de injeção com base na gravidade da doença ph desejada e fenótipo de RV. Um aumento semanal da pressão do punho em 100-150 mmHg é um alvo razoável para desenvolver um fenótipo de RV compensativo adaptativo.
   2. Aumentos mais rápidos na pressão do punho (>250 mmHg por semana) provavelmente produzirão um fenótipo derv descompensado.
10. Uma vez que o manguito PA esteja inflado na quantidade desejada, remova a agulha Huber da porta da braçadeira.
11. Obtenha uma amostra de sangue da porta do trailer.
    1. Aspire 10 mL de sangue fora da porta rv de forma estéril e reserve.
    2. Coloque uma nova seringa no lugar da seringa aspirada e aspire o máximo de sangue necessário sem ultrapassar o limite semanal de coleta de sangue de 7,5% do volume sanguíneo total.
    3. Reconecte a seringa original com sangue aspirado e devolva-a através da porta do trailer.
    4. Puxe a alavanca da válvula do transdutor de pressão para lavar a solução salina heparinizada do saco salino para a porta do trailer. Continue lavando até que toda a linha fique clara e incolor.
12. Lave a porta rv com 10 mL de soro fisiológico. Em seguida, lave ainda mais a porta com 5 mL de 1000 U/mL de sódio de heparina.
13. Repita as etapas 6.1-6.12 a cada 1-4 dias durante 9-10 semanas.

Resultados

Um grupo representativo de 12 ovinos é usado para mostrar a eficácia deste modelo para o desenvolvimento de diferentes graus de PH-RVF. Entre essas ovelhas, a pressão média do manguito pa aumentou de 32 ± 20 mmHg na semana 1 para 1002 ± 429 mmHg na semana 9. Isso resultou no aumento das pressões médias e sistólicas do RV de 28 ± 5 e 57 ± 7 mmHg na semana 1, respectivamente, para 44 ± 7 e 93 ± 18 mmHg na semana 9. Além disso, o perfil de pressão do punho pa foi sobreposto à saturação de oxigênio venosa ...

Discussão

O modelo PH-RVF apresentado pode induzir de forma confiável diferentes níveis de gravidade da doença para corresponder aos objetivos da investigação. Duas abordagens diferentes são usadas em combinação para induzir este modelo de doença. Em primeiro lugar, a ligadura LPA serve para aumentar a resistência vascular pulmonar e diminuir a capacitância ^pa11,12, estabelecendo assim o ponto de partida do modelo crônico em um estado de pós-carga de RV já au...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride Irrigation Pour Bottle by Baxter Healthcare, 1000 mL	Medline	BHL2F7124	Surgical Disposable
0.25% Bupivacaine	Hospira Inc	0409-1160-18	Medication, Intra-Operative
0.9% Normal Saline, 1000 mL	Baxter Healthcare Corp	0338-0049-04	Medication, Intra-Operative
0.9% Normal Saline, 500 mL	Baxter Healthcare Corp.,	0338-0049-03	Medication, Chronic PH
16 mm Heavy Duty Occluder with actuating tubing	Access Technologies	OC-16HD	Surgical Disposable
3-mL Skin Prep Applicator	Medline	MDF260400	Surgical Disposable
70% isopropyl alcohol prep pads	Medline	MDS090670	Disposable, Chronic PH
Adhesive bandage tape	Patterson Veterinary		Disposable, Chronic PH
Adson forceps	V. Mueller	NL1400	Surgical Instrument
Allis tissue forceps	V. Mueller	CH1560	Surgical Instrument
Aortic clamp, straight (bainbridge forceps)	V. Mueller	SU6001	Surgical Instrument
Backhaus towel forceps	V. Mueller	SU2900	Surgical Instrument
Bags, Infusion: Nonsterile Novaplus Infusion Bag, 500 mL	Medline	TCV4005H	Disposable, Chronic PH
Berry sternal needle holder	V. Mueller	CH2540	Surgical Instrument
Blades, Electrode: Electrode Blade, 6.5", with 0.24 cm Shaft	Medline	VALE15516	Surgical Disposable
Blades: Stainless-Steel Sterile Surgical Blade, Size #10	Medline	B-D371210	Surgical Disposable
Blades: Stainless-Steel Sterile Surgical Blade, Size #11	Medline	B-D371211	Surgical Disposable
Blades: Stainless-Steel Sterile Surgical Blade, Size #15	Medline	B-D371215	Surgical Disposable
BNC Male to BNC Male Cable	Digi-Key	415-0198-036	Equipment
Castroviejo needle holder	V. Mueller	CH8589	Surgical Instrument
Cefazolin	Apotex Corp	60505-6142-0	Medication, Intra-Operative
Ceftiofur Crystalline Free Acid	Zoetis Inc	54771-5223-1	Medication, Post-Operative
Chest Drain, with Dry Suction, Adult-Pediatric	Medline	DEKA6000LFH	Surgical Disposable
Chest tube passer	V. Mueller	CH04189	Surgical Instrument
COnfidence Flowprobes for Research (PAU-Series)	Transonic	24PAU	Equipment, Perivascular Flow Probe
Cooley tangential occlusion clamp	V. Mueller	CH6572	Surgical Instrument
Data Acquisition Hardware	ADInstruments	PowerLab 16/30	Equipment
DeBakey Aorta clamp	V. Mueller	CH7247	Surgical Instrument
DeBakey multi-purpose clamp	V. Mueller	CH7276	Surgical Instrument
Debakey tissue forceps, 12’’	V. Mueller	CH5906	Surgical Instrument
Debakey vascular tissue forceps 7 3/4’’	V. Mueller	CH5902	Surgical Instrument
Debakey vascular tissue forceps, 9’’	V. Mueller	CH5904	Surgical Instrument
Electrosurgical Generator	Covidien	Force FX-C	Equipment
Endotracheal Tube, 10mm	Patterson Veterinary	07-882-9008	Surgical Disposable
Enrofloxacin	Norbrook Laboratories Limited	55529-152-05	Medication, Intra-Operative
Fentanyl Transdermal Patch	Apotex Corp	60505-7007-2	Medication, Pre-Operative
Ferris smith tissue forceps	V. Mueller	SU2510	Surgical Instrument
Finochietto rib spreaders, large	V. Mueller	CH1220-1	Surgical Instrument
Finochietto rib spreaders, medium	V. Mueller	CH1215-1	Surgical Instrument
Flexsteel ribbon retractor, 1” x 13”	V. Mueller	SU3340	Surgical Instrument
Flexsteel ribbon retractor, 2” x 13”	V. Mueller	SU3346	Surgical Instrument
Foerster sponge forceps, curved	V. Mueller	GL660	Surgical Instrument
Gauze Sponges: Sterile X-ray Compatible Gauze Sponges, 16-Ply, 4" x 4"	Medline	PRM21430LFH	Surgical Disposable
Gerald-DeBakey forceps	V. Mueller	CH04242	Surgical Instrument
Glassman Allis	V. Mueller	SU6152	Surgical Instrument
Halsted mosquito forceps	V. Mueller	SU2702	Surgical Instrument
Harken clamp	V. Mueller	CH6462	Surgical Instrument
Heat Therapy Pump	Gaymar/Stryker	TP-400	Equipment
Heparin	Fresenius Kabi,	63323-540-31	Medication, Chronic PH
Hospira Primary IV Sets, 80"	Patterson Veterinary	07-835-0123	Surgical Disposable
Hypertonic saline 3%	Baxter Healthcare Corp.,	0338-0054-03	Medication, Chronic PH
Hypodermic Needle with Bevel and Regular Wall, 20 G x 1"	Medline	B-D305175Z	Disposable, Chronic PH
Interface Cable, Edwards LifeScience Transducer to ADInstruments  Bridge Amplifier	Fogg System	0395-2434	Equipment
Intravenous Infusion Pump	Heska	Vet/IV 2.2 Infusion Pump	Equipment
Isoflurane	Patterson Veterinary	14043-704-06	Medication, Pre-Operative
Kantrowitz thoracic clamp, 9-1/2”	V. Mueller	CH1722	Surgical Instrument
Kelly hemostats	V. Mueller	88-0314	Surgical Instrument
Lidocaine HCl, 2.46%	PRN Pharmacal,	49427-434-04	Medication, Chronic PH
Ligaclip Multiple-Clip Appliers by Ethicon	Medline	ETHMCS20	Surgical Disposable
Loop, Vessel, Mini, Red, 2/pk, Sterile	Medline	DYNJVL12	Surgical Disposable
Lorna non-perforating towel forceps	V. Mueller	SU2937	Surgical Instrument
Mayo dissecting scissors, curved	V. Mueller	SU1826	Surgical Instrument
Mayo dissecting scissors, straight	V. Mueller	SU1821	Surgical Instrument
Medipore Dress-It Pre-Cut Dressing Covers by 3M	Medline	MMM2955Z	Surgical Disposable
Meloxicam	Patterson Veterinary	14043-909-10	Medication, Post-Operative
Mixter thoracic forceps, 9”	V. Mueller	CH1730-003	Surgical Instrument
Mosquito hemostats	V. Mueller	88-0301	Surgical Instrument
Multi-Channel Research Consoles	Transonic	T402/T403	Equipment, Perivascular Flow Meter
Multi-Lumen Central Venous Catheterization Kits	Medline	ARW45703XP1AH	Surgical Disposable
Multi-Parameter Vital Signs Monitor	Smiths Medical	SurgiVet Advisor 3	Equipment
Needles: Hypodermic Needle with Regular Bevel, Sterile, 18 G x 1.5"	Medline	B-D305185Z	Surgical Disposable
No. 3 knife handle	V. Mueller	SU1403-001	Surgical Instrument
No. 7 knife handle	V. Mueller	SU1407	Surgical Instrument
Non-Vented Male Luer Cap	Qosina	13614	Disposable, Chronic PH
Octal Bridge Amplifier	ADInstruments	FE228	Equipment
Ophthalmic Ointment	Akorn Animal Health	59399-162-35	Medication, Pre-Operative
Penrose Tubing, 6 mm x 46 cm, 11 mm Flat	Medline	SWD514604H	Surgical Disposable
Perma-Hand Black Braided Silk:  2-0 SH Taperpoint Needle, Control Release, 30"	Medline	ETHD8552	Surgical Disposable
Perma-Hand Suture, Black Braided, Size 0, 6 x 30”	Medline	ETHA306H	Surgical Disposable
Perma-Hand Suture, Black Braided, Size 4-0, 12 x 30"	Medline	ETHA303H	Surgical Disposable
Phenylephrine	West-Ward	0641-6142-25	Medication, Intra-Operative
Polyhesive Cordless Patient Return Electrodes, Adult	Medline	SWDE7509	Surgical Disposable
Port-A-Cath Huber Needle, Straight, 22 G x 1-1/2"	Medline	AAKM21200724	Disposable, Chronic PH
PROLENE Monofilament Suture, Blue, Size 4-0, 36", Double Arm, RB-1 Needle	Medline	ETHD7143	Surgical Disposable
PROLENE Polypropylene Monofilament Suture, Blue, Double-Armed, RB-1 Needle, Size 5-0, 24"	Medline	ETH8555H	Surgical Disposable
Regional Block Needles, 22-gauge	Medline	B-D408348Z	Surgical Disposable
Schnidt tonsil artery forceps	V. Mueller	M01700	Surgical Instrument
Skin staple extractor	Medline	CND3031	Disposable, Chronic PH
Skin stapler 35 wide, with counter	Medline	STAPLER35W	Surgical Disposable
Sphygmomanometer	Medline		Equipment
Sponge bowl	V. Mueller	GE-75	Surgical Instrument
Sponge, Lap: X-Ray Detectable Sterile Lap Sponge, 18" x 18", 5/Pack	Medline	MDS241518HH	Surgical Disposable
Sponge, Peanut: X-Ray Detectable Sterile Peanut Sponge, Small, 3/8"	Medline	MDS72038	Surgical Disposable
Sterile Disposable Deluxe OR Towel, Blue, 17'' x 27'', 2/Pack	Medline	MDT2168202	Surgical Disposable
Sterile Luer-Lock Syringe, 3 mL	Medline	SYR103010Z	Disposable, Chronic PH
Sterile Luer-Lock Syringe, 5 mL	Medline	SYR105010Z	Disposable, Chronic PH
Sterile Surgical Equipment Probe Covers	Medline	DYNJE5930	Surgical Disposable
Stopcock: 3-Way Stopcock with Handle in OFF Position, Rotating Adaptor Male Collar Fitting, 45 PSI	Medline	DYNJSC301	Surgical Disposable
Stopcock: 3-Way Stopcock with Handle in OFF Position, Rotating Adaptor Male Collar Fitting, 45 PSI	Medline	DYNJSC301	Disposable, Chronic PH
Subcutaneous Port with 5-French Connector and Blue Boot	Access Technologies	CP2AC-5NC	Surgical Disposable
Super cut metzenbaum dissecting scissors	V. Mueller	CH2032-S	Surgical Instrument
Super cut nelson-metzenbaum dissecting scissors	V. Mueller	CH2025-S	Surgical Instrument
Syringes: Sterile Luer-Lock Syringe, 10 mL	Medline	SYR110010Z	Surgical Disposable
Thoracic Catheter, Straight, 28 Fr x 20"	Medline	SWD570549H	Surgical Disposable
Three-quarter surgical drape	Medline	DYNJP2414H	Surgical Disposable
Tiletamine + Zolazepam	Zoetis Inc	54771-9050-1	Medication, Pre-Operative
TourniKwik Tourniquet Set with Four 7.5" Bronze-Colored Tubes and 1 Snare, 12 French	Medline	CVR79013	Surgical Disposable
Transducer clip	Edwards LifeScience	TCLIP05	Equipment
Trigger Aneroid Gauge (Sphygmomanometer)	Patterson Veterinary	07-815-0464	Equipment
TruWave Disposable Pressure Transducer Kits by Edwards Lifesciences	Medline	VSYPX260	Surgical Disposable and Chronic PH
TS420 Perivascular Flow Module	Transonic	TS420	Equipment, Perivascular Flow Meter
Tubing, Suction: Sterile Universal Suction Tubing with Straight Ribbed Connectors, 1/4" x 12'	Medline	OR612	Surgical Disposable
Tubing: Pressure Monitoring Tubing with Fixed Male Luer Lock and Female Fitting, Low Pressure, 72" L	Medline	DYNJPMTBG72MF	Surgical Disposable
Tubing: Pressure Monitoring Tubing with Fixed Male Luer Lock and Female Fitting, Low Pressure, 72" L	Medline	DYNJPMTBG72MF	Disposable, Chronic PH
Tubular Elastic Dressing Retainer	Medline	DERGL711	Disposable, Chronic PH
Tuffier rib retractor	V. Mueller	CD1101	Surgical Instrument
Tygon E-3603 Flexible Tubings	Fisher Scientific	14-171-227	Surgical Disposable
U.S.A retractor	V. Mueller	SU3660	Surgical Instrument
Umbilical Tape, Cotton, 3-Strand, 1/8 x 36"	Medline	ETHU12TH	Surgical Disposable
Valleylab Button Switch Pencil	Medline	VALE2516H	Surgical Disposable
Vanderbilt deep vessel forceps	V. Mueller	CH1687	Surgical Instrument
Veterinary Anesthesia Machine	Midmark	Matrx VMC	Equipment
Veterinary Anesthesia Ventilator	Hallowell EMC	Model 2000	Equipment
Vicryl: Undyed Coated Vicryl 0 CT-1 36" Suture	Medline	ETHVCP946H	Surgical Disposable
Vicryl: Undyed Coated Vicryl 2 TP-1 Taper 54" Suture	Medline	ETHVCP880T	Surgical Disposable
Vicryl: Undyed Coated Vicryl 2-0 CT-1 18" Suture	Medline	ETHVCP739D	Surgical Disposable
Vital crile-wood needle holder, 10-3/8”	V. Mueller	CH2427	Surgical Instrument
Vital mayo-hegar needle holder, 7-1/4”	V. Mueller	CH2417	Surgical Instrument
Vital metzenbaum dissecting scissors, 14’’	V. Mueller	CH2009	Surgical Instrument
Vital metzenbaum dissecting scissors, 9”	V. Mueller	CH2006	Surgical Instrument
Vital ryder needle holder, 9”	V. Mueller	CH2510	Surgical Instrument
Yankauer, Bulb Tip: Sterile Rigid Yankauer with Bulb Tip, No Vent	Medline	DYND50130	Surgical Disposable