Un sistema de cultivo automatizado para su uso en pruebas preclínicas de terapias dirigidas al huésped para la tuberculosis

Resumen

La cuantificación rápida y eficiente del crecimiento intracelular de M. tuberculosis es crucial para buscar mejores terapias contra la tuberculosis (TB). Este protocolo describe un ensayo de detección colorimétrica basado en caldo utilizando un sistema automatizado de cultivo líquido para cuantificar el crecimiento de Mtb en macrófagos tratados con terapias candidatas dirigidas al huésped.

Resumen

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), el agente causal de la tuberculosis (TB), fue la enfermedad infecciosa más importante a nivel mundial hasta la llegada de COVID-19. Mtb ha evolucionado para persistir en su entorno intracelular, evadir las defensas del huésped y ha desarrollado resistencia a muchos medicamentos antituberculosos. Un enfoque para resolver la resistencia es identificar los medicamentos aprobados existentes que aumentarán la respuesta inmune del huésped a Mtb. Estos medicamentos podrían reutilizarse como terapias complementarias dirigidas al huésped (HDT) para acortar el tiempo de tratamiento y ayudar a superar la resistencia a los antibióticos.

La cuantificación del crecimiento intracelular de Mtb en macrófagos es un aspecto crucial de la evaluación del HDT potencial. El estándar de oro para medir el crecimiento de Mtb es contar unidades formadoras de colonias (UFC) en placas de agar. Este es un ensayo lento y laborioso que no se presta a la detección rápida de medicamentos. En este protocolo, se ha adaptado un sistema de cultivo automatizado basado en caldo, que se usa más comúnmente para detectar Mtb en muestras clínicas, para la detección preclínica de terapias dirigidas al huésped. Se evaluó la capacidad del sistema de ensayo de cultivo líquido para investigar el crecimiento intracelular de Mtb en macrófagos tratados con HDT. Los HDT probados por su capacidad para inhibir el crecimiento de Mtb fueron ácido retinoico todo-trans (AtRA), tanto en solución como encapsulado en micropartículas de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) y la combinación de interferón-gamma y linezolid. Las ventajas de esta técnica automatizada basada en el cultivo líquido sobre el método CFU incluyen simplicidad de configuración, preparación menos laboriosa y un tiempo de obtención de resultados más rápido (5-12 días en comparación con 21 días o más para las placas de agar).

Introducción

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), el agente causal de la tuberculosis, fue la enfermedad infecciosa más importante a nivel mundial en 2019¹. Para evadir las defensas del huésped, Mtb subvierte la actividad micobactericida de las células inmunes innatas como los macrófagos y las células dendríticas (DC), lo que le permite persistir intracelularmente y replicarse². La falta de una vacuna eficaz para prevenir la tuberculosis pulmonar en adultos y la creciente aparición de cepas resistentes a los medicamentos ponen de relieve la necesidad urgente de nuevas terapias.

Las terapias complementarias dirigidas al huésped (HDT) podrían acortar el tiempo de tratamiento y ayudar a superar la resistencia³. La evaluación preclínica de los candidatos a HDT in vitro para determinar la actividad micobactericida dentro de los macrófagos a menudo se basa en la cuantificación del crecimiento de Mtb por unidades formadoras de colonias (UFC) en placas sólidas de agar. Este es un ensayo lento y laborioso que no se presta a la detección rápida de medicamentos. Los sistemas automatizados de detección microbiana basados en caldos disponibles comercialmente se utilizan más comúnmente en los laboratorios de microbiología clínica para la detección y las pruebas de susceptibilidad a los medicamentos de Mtb y otras especies micobacterianas en muestras clínicas⁴. Estos instrumentos miden el crecimiento indirectamente en función de la actividad metabólica bacteriana que conduce a cambios físicos en los medios de cultivo (cambio en los niveles o presión de CO2 u_O2) monitoreados a lo largo del tiempo⁵. La lectura es el tiempo de positividad (TPP), que previamente se ha demostrado que se correlaciona con Mtb CFU en muestras de esputo de pacientes con TB en respuesta al tratamiento ^6,7 y en lisados de pulmón y bazo murinos infectados⁸. Además, se han utilizado sistemas de detección de cultivos líquidos para medir el efecto de las terapias convencionales dirigidas a patógenos sobre el crecimiento de micobacterias en cultivo axénico y macrófagos cultivados ^9,10. El instrumento también se ha utilizado para investigar la capacidad innata de las células dendríticas y de los macrófagos alveolares para controlar el crecimiento intracelular de Mtb^11,12. Este protocolo experimental demuestra que se puede adaptar un sistema de diagnóstico de cultivo líquido para realizar el cribado preclínico de HDT para TB en macrófagos cultivados. En comparación con la enumeración de UFC, la principal ventaja de esta técnica es que reduce considerablemente el trabajo experimental y el tiempo requerido para cuantificar el crecimiento/supervivencia micobacteriana intracelular. Esta técnica se basa en el acceso a un instrumento de cultivo automatizado que se puede utilizar para evaluar la supervivencia micobacteriana intracelular en células inmunes tratadas con una amplia gama de reactivos farmacológicos dirigidos a las funciones celulares para aumentar la inmunidad del huésped.

Protocolo

Los experimentos descritos en este protocolo se llevaron a cabo utilizando la cepa atenuada H37Ra de Mtb, que se puede manejar en un laboratorio de Contención de Nivel 2. Todas las manipulaciones de micobacterias vivas se llevaron a cabo en un gabinete de seguridad biológica (BSC) de Clase II. Se diseñaron procedimientos experimentales para minimizar la generación de aerosoles. El cultivo de células eucariotas (células THP-1) también se llevó a cabo en un BSC de Clase II. El laboratorio llevó a cabo una evaluación de riesgos y se aseguró de que todos los procedimientos se llevaran a cabo de conformidad con las normas institucionales y nacionales de seguridad biológica. Se utilizó la línea celular monocítica humana THP-1 para realizar el método descrito (paso 1). Las células se diferencian en macrófagos después de la estimulación con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) antes de la infección con micobacterias.

1. Cultivo celular

1. Propague el stock de semillas de H37Ra a la fase logarítmica en caldo Middlebrook 7H9 (MB) suplementado con enriquecimiento de albúmina-dextrosa-catalasa (ADC) (10%) y polisorbato al 0,05% 80. Almacene las existencias de H37Ra en alícuotas de 1 ml en un congelador a -80 °C durante un máximo de 1 año.
2. Descongele un vial de 1 ml de Mtb-H37Ra y transfiéralo a un matraz T25 con una tapa filtrante que contenga 9 ml de caldo suplementado con MB aproximadamente 1 semana antes del experimento planificado. Incubar a 37 °C durante 5-7 días en una incubadora estática.
3. Cultivar células THP-1 en RPMI-1640 suplementadas con suero fetal de ternera al 10% sin muerte por calor (RPMI (c)completo) en un matraz T75 en una incubadora humidificada con CO₂ al 5% y subcultivo dos veces por semana para mantener una densidad de menos de 1 x 10⁶ células/ml.
4. Diferenciar las células THP-1 en macrófagos 3 días antes de la infección pipeteando suavemente las células varias veces con una pipeta serológica en matraces T75 para dispersar cualquier grupo y colocarlos en un tubo cónico de 50 ml.
5. Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente, decantar el sobrenadante y resuspender suavemente el pellet en 2 ml de RPMI. Realizar el recuento de células para estimar células/ml.
6. Seembrar 2 mL de macrófagos THP-1 en placas de cultivo tisular de 12 pocillos a una densidad de 100.000 células/mL en cRPMI con 100 ng/mL PMA durante 72 h. Retire el medio que contiene PMA de las células y reponga con cRPMI fresco antes de la infección por Mtb.
7. Configure placas individuales para cada punto de tiempo requerido.
8. Células semilla con la misma densidad (100.000 células/ml) en portaobjetos de cámara de vidrio de 2 pocillos para determinar la multiplicidad de la infección (MOI).
9. Colocar en una incubadora humidificada de_CO2 al 5% durante 3 días a 37 °C.

2. Cuantificación de la captación de Mtb

1. Determinación de la captación de Mtb por macrófagos (MOI)
   1. Instale el gabinete de seguridad biológica (BSC) de clase II el día de la infección y trabaje en dos capas de papel de seda para detectar cualquier derrame. Configure contenedores de desecho de residuos de acuerdo con las regulaciones locales.
   2. Extraer 6-8 ml de cultivo micobacteriano del matraz T25 y transferirlo a un tubo de polipropileno de 15 ml.
      NOTA: Los tubos de menor volumen se pueden utilizar para experimentos más pequeños.
   3. Centrifugar el tubo en una centrífuga de sobremesa a temperatura ambiente durante 10 min a 2890 x g.
   4. Retire con cuidado el tubo de la centrífuga y transfiéralo al gabinete de seguridad biológica. Espere 1 minuto para permitir que las bacterias se asienten.
      1. Vierta el sobrenadante en el recipiente de desecho del desinfectante, vuelva a tapar el tubo y resuspenda las bacterias en el medio restante golpeando el costado del tubo. Espere 1 minuto para permitir que las bacterias se asienten.
   5. Agregue 2 ml de cRPMI precalentado, mezcle suavemente y transfiera a un tubo cónico de 50 ml.
   6. Resuspender las micobacterias con mucho cuidado con una aguja de 25 G y una jeringa de 5 ml. Para resuspender, extraiga la suspensión de micobacterias en la jeringa y expulse muy suavemente por la pared lateral del tubo para minimizar la producción de aerosol. Repita 6-8 veces.
      NOTA: Tenga la máxima precaución ya que se trata de un cultivo de micobacterias de alta densidad. Para evitar el riesgo de lesiones por pinchazo de aguja, use agujas romas siempre que sea posible y jeringas Luer lock.
   7. Deseche la aguja y la jeringa en un recipiente para objetos punzantes en el BSC.
   8. Transfiera la suspensión a un tubo de microfuga de 2 ml (con tapón roscado) y centrifugar a temperatura ambiente durante 3 minutos a 100 x g para granular cualquier grumo restante. Devuelva el tubo al gabinete de seguridad y espere 1 minuto para permitir que las bacterias se asienten.
   9. Transfiera la parte superior de 1-1.5 ml del sobrenadante a un tubo nuevo. Deseche el tubo original en el cubo de basura que contiene desinfectante. Mezclar bien y añadir varias cantidades de la suspensión micobacteriana (por ejemplo, 5, 25, 50, 150 μL) a los portaobjetos de la cámara de vidrio de 2 pocillos e incubar durante 3 h en una incubadora de_CO2 a 37 °C.
2. Tinción para bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR)
   NOTA: Después de 3 h de incubación, los macrófagos se lavan y se fijan con paraformaldehído para inactivar las micobacterias. Luego, los portaobjetos se tiñen con un kit de auramina O modificada (consulte la Tabla de materiales) para estimar las micobacterias fagocitadas por célula. Debido a su pared celular cerosa, las micobacterias retienen el colorante Auramine después de un lavado ácido-alcohol. Los núcleos de macrófagos se contra-tiñen con Hoechst. Este método permite contar el número de bacterias fagocitadas por célula y se utiliza para determinar la multiplicidad de la infección (MOI) de los macrófagos.
   1. Retire el medio del portaobjetos de la cámara de vidrio después de pipetear hacia arriba y hacia abajo tres veces para desalojar las bacterias que no han sido fagocitadas.
   2. Lavar una vez con 2 ml de PBS a temperatura ambiente.
   3. Almacenar existencias de paraformaldehído al 4%, disueltas en PBS en alícuotas a -20 °C durante un máximo de 6 meses. Descongelar una alícuota de paraformaldehído al 4% inmediatamente antes de su uso. Diluir a 2% de paraformaldehído con PBS y añadir 2 ml por pocillo.
   4. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente. El portaobjetos de la cámara de vidrio se puede quitar del gabinete de seguridad en esta etapa para teñirlo.
   5. Lave el tobogán bajo un suave chorro de agua del grifo.
   6. Dispense suficiente auramina en el portaobjetos para cubrir las células con una pipeta de transferencia de plástico e incube durante 1 minuto a temperatura ambiente en la oscuridad (cubra con papel de aluminio).
   7. Lave el exceso de tinte del portaobjetos con agua del grifo y agregue el decolorante/enfriador durante 1 minuto en la oscuridad.
   8. Lave el exceso con agua del grifo e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente con Hoechst 33342 (10 μg/ml en PBS) en la oscuridad.
   9. Lave la mancha de Hoechst con agua del grifo, retire las cámaras, drene el exceso de agua del portaobjetos, agregue una gota de antidecoloración y cubreobjetos, y seque al aire.
   10. Examine el portaobjetos bajo el microscopio fluorescente utilizando el objetivo de aceite 100x. Las micobacterias emitirán fluorescencia verde bajo el filtro FIFC. Los núcleos fluorescen de color azul bajo el filtro DAPI (Figura 1C).
   11. Determinar el MOI contando el número de micobacterias fagocitadas por célula y el porcentaje de células infectadas.
   12. Calcular el volumen de suspensión micobacteriana necesaria para lograr el MOI requerido basado en el área de superficie de un pozo en la placa; Por ejemplo, el área de superficie de las diapositivas de la cámara de vidrio utilizadas en este experimento es de 4 cm². El MOI bajo (aproximadamente 1-2 bacilos / célula) es deseable para experimentos realizados durante varios días (por ejemplo, 5 días).
3. Infección de macrófagos
   1. Mezcle bien la suspensión de micobacterias y agregue la cantidad necesaria a las células en placas de 12 pocillos una vez que se haya determinado el volumen requerido para lograr el MOI deseado.
   2. Incubar a 37 °C durante 3 h para permitir que las micobacterias sean fagocitadas.
   3. Elimine las bacterias extracelulares lavando los pocillos con RPMI caliente o HBSS varias veces.
   4. Lisar los macrófagos en un pocillo (muestra de 3 h) para determinar el porcentaje de tiempo hasta la positividad (TTP) del inóculo inicial (muestra de 3 h) como se describe en el paso 3 a continuación.
   5. Añadir cRPMI fresco y las dosis de fármaco requeridas o control del vehículo a los pocillos restantes, incubar las placas en la incubadora de_CO2 a 37 °C durante el tiempo necesario (dependiendo del diseño experimental, pero generalmente a varios intervalos entre 1 y 8 días).

3. Recolección de muestras para el sistema de detección de cultivo líquido

NOTA: El día de la infección, las micobacterias extracelulares se eliminan mediante lavado, y las micobacterias intracelulares se cosechan mediante lisis de un pocillo de macrófagos (muestra de 3 h) para determinar la cantidad inicial fagocitada como control basal de la infección. En momentos posteriores, tanto el medio, el lisado celular y los lavados se combinan para medir el crecimiento micobacteriano total. El crecimiento extracelular e intracelular también se puede evaluar por separado si se desea.

1. Recolección de muestra de 3 h para determinar TTP
   1. Lavar las micobacterias extracelulares de todos los pocillos después de las 3 h iniciales de la infección, tal como se describe en el paso 2.3.3. Agregue 1 ml de medios frescos al pozo de control de 3 h para igualar el volumen de lisado con los de los puntos de tiempo posteriores.
      NOTA: Ver paso 3.2.7 si las micobacterias extracelulares deben excluirse del análisis.
2. Recogida de muestras
   1. Caldo de MB caliente y botellas de cultivo de instrumentos para llevarlas a temperatura ambiente.
   2. Transfiera el medio de la placa de 12 pocillos a los tubos cónicos etiquetados correspondientes.
   3. Agregue 500 μL de tampón de lisis estéril (0.1% Triton x-100 en PBS filtrado a través de un filtro estéril de 0.2 μm) a cada pocillo durante 10 min.
   4. Raspa suavemente las células del pozo con un raspador estéril y combínalas con el medio en el tubo cónico apropiado.
   5. Lave el pozo con 0,5 ml de PBS estéril y transfiéralo al tubo apropiado.
   6. Pase suavemente cada muestra a través de una aguja y una jeringa (25 G) 6-8 veces para romper los grumos. Diluir las muestras 1:10 en caldo MB; 100 μL de muestra + 900 μL MB de medio.
   7. En los momentos/días requeridos (generalmente entre 1 y 8 días), cosechar las muestras restantes siguiendo los pasos 3.2.1-3.2.6 anteriores.
      NOTA: Los investigadores pueden preferir excluir las micobacterias extracelulares de su análisis, en cuyo caso, en el paso 3.2.2 anterior, se descarta el medio de cada pocillo y los macrófagos se lavan varias veces antes de agregar tampón de lisis.
3. Inocular y cargar botellas de cultivo de instrumentos
   NOTA: Los detalles del instrumento de cultivo líquido y los consumibles relacionados se proporcionan en la Tabla de materiales.
   1. Esterilice la tapa de goma del frasco de cultivo del instrumento con papel de seda empapado en alcohol al 70% y deje que se seque al aire.
      NOTA: Este paso debe llevarse a cabo en el BSC.
   2. Prepare los frascos transfiriendo suficientes suplementos nutricionales para todas las muestras en un tubo cónico (0,5 ml / botella). Use una aguja y una jeringa para inyectar 0,5 ml de suplemento nutricional en el frasco de cultivo del instrumento.
   3. Pipetear 500 μL de la muestra diluida (1:10) en un tubo con fondo en V de 1 ml.
   4. Utilice una aguja y una jeringa para inyectar los 500 μL de muestra en el frasco de cultivo del instrumento asignado.
   5. Esterilice la tapa de goma del frasco de cultivo del instrumento con papel de seda empapado en alcohol al 70% y deje que se seque al aire. Limpie las botellas con papel de seda empapado en alcohol al 70% antes de retirarlas del BSC.
   6. Transporte cuidadosamente las botellas desde el gabinete de bioseguridad hasta el instrumento para cargar.
   7. Pulse el botón de carga del sistema automatizado de detección microbiana.
   8. Escanee los códigos de barras de las botellas de cultivo de instrumentos y coloque las botellas en la incubadora del sistema de detección a 37 °C durante un máximo de 42 días. Lea y registre el tiempo necesario para alcanzar la positividad desde la pantalla del instrumento.
      NOTA: El código de barras permite que el instrumento identifique la botella y vincule las lecturas de reflectancia con una botella en particular.
   9. Calcular el porcentaje de tiempo hasta la positividad (TTP) comparando el TTP del inóculo intracelular inicial (Día 0) con el de los macrófagos cultivados durante los tiempos indicados. Un cambio positivo en el porcentaje de TTP significa crecimiento micobacteriano¹³.
      Por ejemplo, para el día 3:
      Cambio porcentual en el tiempo hasta la positividad =

Resultados

El instrumento automatizado de cultivo líquido utilizado en este estudio monitorea los niveles de_CO2 cada 10 min. Un cambio de color en el sensor en la parte inferior de la botella del instrumento se mide colorimétricamente y se expresa como unidades de reflectancia. Luego, el software del instrumento aplica algoritmos de detección para calcular el tiempo de positividad (TTP), es decir, el número de días desde la inoculación hasta que los cultivos se marcan como positivos (Figura 1A<...

Discusión

Los autores han utilizado el método de cultivo líquido descrito en este protocolo para monitorizar el crecimiento de Mtb en macrófagos derivados de monocitos y macrófagos alveolares y células THP-1 diferenciadas con PMA^11,16,17. Esta técnica también puede ser modificada para su uso con células no adherentes¹². Más recientemente, el instrumento también se utilizó en estudios preclínicos para ev...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
IX51 Fluorescent Microscope	Olympus, Japan	N/A	AFB detection and imaging
2 mL microtube, flat bottom, screw cap, sterile	Sarstedt, North Carolina, USA	72.694.006	Mtb infection of macropahges
5 mL syringe, Luer lock	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	SZR-150-031K	Mtb infection of macropahges/CFU
50 mL tube, sterile	Sarstedt, North Carolina, USA	62.547.254	Mtb infection of macropahges
all-trans-Retinoic Acid (ATRA) ≥98% (HPLC)	Sigma Aldrich, Missouri, USA	R2625	Host directed therapy candidate
BacT/ALERT 3D Microbial Detection System	Biomerieux ( Hampshire, UK)	247001	Broth-based colormetric detection system
BACT/ALERT MP  BACT/ALERT MP Nutrient Supplement	Biomerieux ( Hampshire, UK)	414997	Broth-based colormetric detection assay
BACT/ALERT MP culture bottles	Biomerieux ( Hampshire, UK)	419744	Broth-based colormetric detection assay
BD BBL Middlebrook ADC Enrichment, 20 mL	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	M0553	Mycobacterium liquid culture
BD BBL Middlebrook OADC Enrichment, 20mL	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	M0678	Colony Forming Units
Cell scraper, 25 cm	Sarstedt, North Carolina, USA	83.1830	Harvest of lmacrophage lysates
Corning Syringe Filter, 0.2 µm	Corning Incorporated, Germany	431219	Sterilization of lysis buffer
Cover glass (borosilicate), 24 x 50 mm, #1.5 thickness	VWR International Limited	631 - 0147
Cycloheximide, from microbial	Sigma Aldrich, Missouri, USA	C7698	Colony Forming Units
Dako Fluorescent Mounting Medium	Agilent Technologies Ireland Limited	S3023	Antifade mounting medium
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich, Missouri, USA	D8537	Mtb infection of macropahges
Fetal Bovine Serum, Gibco	Thermo Fisher, Massachusetts, USA	10270106	Macrophage cell culture
Glycerol, Difco	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	228220	Colony Forming Units
Hoescht 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride)	Sigma Aldrich, Missouri, USA	B2261	Nuclear stain
IFNγ, recombinant human	R&D Systems Inc, Minnesota, USA	285-IF	Host directed therapy candidate
Labtek 2-well chamber slide, sterile, Nunc	Thermo Fisher, Massachusetts, USA	TKT-210-150R	Mtb infection of macropahges
L-Asparagine, anhydrous	Sigma Aldrich, Missouri, USA	A4159	Colony Forming Units
Linezolid	Sigma Aldrich, Missouri, USA	PZ0014	Antibiotic
Microlance Hypodermic Needle 25 G	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	300400	Mtb infection of macropahges/CFU
Middlebrook 7H10 Agar Base	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	M0303	Colony Forming Units
Middlebrook 7H9 Broth Base	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	M0178	Mycobacterium liquid culture
Modified Auramine O Stain and Decolourizer	Scientific Device Laboratory, IL, USA	345-250	AFB stain
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich, Missouri, USA	158127	Mtb infection of macropahges
Petri dishes, 92 x 16mm (20/bag)	Sarstedt, North Carolina, USA	82.1473.001	Colony Forming Units
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma Aldrich, Missouri, USA	P8139	Macrophage cell culture
Polysorbate 80, Difco	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	231181	Mycobacterium liquid culture
RPMI-1640, Gibco	Thermo Fisher, Massachusetts, USA	52400025	Macrophage cell culture
Sterile Cell Spreader, L-Shaped	Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA	RB-44103	Colony Forming Units
T25 TC flask, angled neck, filter cap, sterile, Nunc	Thermo Fisher, Massachusetts, USA	156367	Mycobacterium liquid culture
THP-1 cell line	ATCC, Virginia, USA	ATCC TIB-202	Macrophage cell culture