결핵에 대한 숙주 유도 요법의 전임상 테스트에 사용하기 위한 자동화된 배양 시스템

요약

세포 내 M. 결핵 성장의 신속하고 효율적인 정량화는 결핵(TB)에 대한 개선된 치료법을 추구하는 데 중요합니다 . 이 프로토콜은 후보 숙주 지시 요법으로 처리된 대식세포에서 Mtb 성장을 정량화하기 위해 자동화된 액체 배양 시스템을 사용하는 브로스 기반 비색 검출 분석을 설명합니다.

초록

결핵(TB)의 원인균인 결핵균(Mtb)은 COVID-19가 출현하기 전까지 전 세계적으로 가장 심각한 전염병 사망자였습니다. Mtb는 세포 내 환경에서 지속되고 숙주 방어를 피하며 많은 항 결핵 약물에 대한 내성을 개발하도록 진화했습니다. 내성을 해결하는 한 가지 접근법은 Mtb에 대한 숙주 면역 반응을 증가시키는 기존의 승인 된 약물을 식별하는 것입니다. 그런 다음 이러한 약물을 보조 숙주 유도 요법(HDT)으로 용도를 변경하여 치료 시간을 단축하고 항생제 내성을 극복하는 데 도움이 될 수 있습니다.

대식세포에서 세포내 Mtb 성장의 정량화는 잠재적인 HDT를 평가하는 중요한 측면입니다. Mtb 성장을 측정하기 위한 황금 표준은 한천 플레이트에서 집락 형성 단위(CFU)를 계산하는 것입니다. 이것은 약물의 신속한 스크리닝에 적합하지 않은 느리고 노동 집약적 인 분석입니다. 이 프로토콜에서는 임상 표본에서 Mtb를 검출하는 데 더 일반적으로 사용되는 자동화된 브로스 기반 배양 시스템이 숙주 지시 요법의 전임상 스크리닝에 맞게 조정되었습니다. HDT로 처리된 대식세포에서 세포내 Mtb 성장을 조사하기 위한 액체 배양 분석 시스템의 용량을 평가하였다. Mtb 성장을 억제하는 능력에 대해 테스트된 HDT는 용액에 담겨 있고 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 미립자와 인터페론-감마와 리네졸리드의 조합으로 캡슐화된 올-트랜스 레티노산(AtRA)이었습니다. CFU 방법에 비해 이 자동화된 액체 배양 기반 기술의 장점은 설정이 간단하고, 노동 집약적인 준비가 적고, 결과 도출 시간이 더 빠르다는 것입니다(한천 플레이트의 경우 21일 이상에 비해 5-12일).

서문

결핵의 원인균인 결핵균(Mtb)은 2019년 전 세계적으로 가장 심각한 전염병 사망자였습니다¹. 숙주 방어를 피하기 위해 Mtb는 대식세포 및 수지상 세포(DC)와 같은 선천성 면역 세포의 진균 살균 활성을 파괴하여 세포 내에서 지속되고 복제할 수 있도록^합니다2. 성인 폐결핵을 예방하는 효과적인 백신의 부족과 약물 내성 균주의 출현 증가는 새로운 치료법의 긴급한 필요성을 강조합니다.

보조 숙주 지시 요법(HDT)은 치료 시간을 단축^{하고 내성을} 극복하는 데 도움이 될 수 있습니다3. 대식세포 내에서 진균살균 활성을 결정하기 위한 시험관 내 HDT 후보의 전임상 평가는 종종 고체 한천 플레이트에서 콜로니 형성 단위(CFU)에 의한 Mtb 성장의 정량화에 의존합니다. 이것은 약물의 신속한 스크리닝에 적합하지 않은 느리고 노동 집약적 인 분석입니다. 상업적으로 이용 가능한 자동화된 브로스 기반 미생물 검출 시스템은 임상 표본에서 Mtb 및 기타 마이코박테리아 종의 검출 및 약물 감수성 테스트를 위해 임상 미생물학 실험실에서 더 일반적으로^{사용됩니다4.}....

프로토콜

이 프로토콜에 설명된 실험은 봉쇄 레벨 37 실험실에서 처리할 수 있는 Mtb의 약독화된 H2Ra 균주를 사용하여 수행되었습니다. 살아있는 마이코 박테리아의 모든 조작은 클래스 II 생물학적 안전 캐비닛 (BSC)에서 수행되었습니다. 실험 절차는 에어로졸 생성을 최소화하도록 설계되었습니다. 진핵 세포 배양 (THP-1 세포)은 또한 클래스 II BSC에서 수행되었다. 실험실은 위험 평가를 수행하고 모든 절차가 기관 및 국가 생물 안전 규정에 따라 수행되었는지 확인했습니다. 인간 단핵구 THP-1 세포주를 사용하여 기재된 바와 같은 방법을 수행하였다(단계 1). 세포는 마이코박테리아에 감염되기 전에 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)로 자극한 후 대식세포로 분화됩니다.

1. 세포 배양

1. 알부민-덱스트로스-카탈라아제(ADC) 농축(10%) 및 0.05% 폴리소르베이트 80이 보충된 미들브룩 7H9(MB) 브로쓰에서 H37Ra 종자 스톡을 로그 단계로 전파합니다. H37Ra 재고를 1mL 분취량에 담아 -80°C 냉동고에 최대 1년 동안 보관하십시오.
2. Mtb-H37Ra 1mL 바이알을 해동하고 계획된 실험 약 25주 전에 MB 보충 국물 9mL가 들어 있는 필터 캡이 있는 T1 플라스크로 옮깁니다. 정....

결과

이 연구에 사용 된 자동화 된 액체 배양 기기는 10 분마다 CO₂ 수준을 모니터링합니다. 계기 병 바닥에 있는 센서의 색상 변화는 비색으로 측정되고 반사율 단위로 표시됩니다. 그런 다음 기기 소프트웨어는 검출 알고리즘을 적용하여 양성까지의 시간(TTP), 즉 접종 후 배양이 양성으로 플래그가 지정될 때까지의 일수를 계산합니다(그림 1A). 초기 접종물에서 TTP와 log

토론

저자들은 이 프로토콜에 설명된 액체 배양 방법을 사용하여 PMA^11,16,17로 분화된 단핵구 유래 대식세포 및 폐포 대식세포 및 THP-1 세포에서 Mtb 성장을 모니터링했습니다. 이 기술은 또한 비부착성 세포⁽¹²)와 함께 사용하기 위해 변형될 수 있다. 보다 최근에이 기기는 TB¹⁷에 대한 HDT로서 흡입 된.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
IX51 Fluorescent Microscope	Olympus, Japan	N/A	AFB detection and imaging
2 mL microtube, flat bottom, screw cap, sterile	Sarstedt, North Carolina, USA	72.694.006	Mtb infection of macropahges
5 mL syringe, Luer lock	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	SZR-150-031K	Mtb infection of macropahges/CFU
50 mL tube, sterile	Sarstedt, North Carolina, USA	62.547.254	Mtb infection of macropahges
all-trans-Retinoic Acid (ATRA) ≥98% (HPLC)	Sigma Aldrich, Missouri, USA	R2625	Host directed therapy candidate
BacT/ALERT 3D Microbial Detection System	Biomerieux ( Hampshire, UK)	247001	Broth-based colormetric detection system
BACT/ALERT MP  BACT/ALERT MP Nutrient Supplement	Biomerieux ( Hampshire, UK)	414997	Broth-based colormetric detection assay
BACT/ALERT MP culture bottles	Biomerieux ( Hampshire, UK)	419744	Broth-based colormetric detection assay
BD BBL Middlebrook ADC Enrichment, 20 mL	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	M0553	Mycobacterium liquid culture
BD BBL Middlebrook OADC Enrichment, 20mL	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	M0678	Colony Forming Units
Cell scraper, 25 cm	Sarstedt, North Carolina, USA	83.1830	Harvest of lmacrophage lysates
Corning Syringe Filter, 0.2 µm	Corning Incorporated, Germany	431219	Sterilization of lysis buffer
Cover glass (borosilicate), 24 x 50 mm, #1.5 thickness	VWR International Limited	631 - 0147
Cycloheximide, from microbial	Sigma Aldrich, Missouri, USA	C7698	Colony Forming Units
Dako Fluorescent Mounting Medium	Agilent Technologies Ireland Limited	S3023	Antifade mounting medium
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich, Missouri, USA	D8537	Mtb infection of macropahges
Fetal Bovine Serum, Gibco	Thermo Fisher, Massachusetts, USA	10270106	Macrophage cell culture
Glycerol, Difco	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	228220	Colony Forming Units
Hoescht 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride)	Sigma Aldrich, Missouri, USA	B2261	Nuclear stain
IFNγ, recombinant human	R&D Systems Inc, Minnesota, USA	285-IF	Host directed therapy candidate
Labtek 2-well chamber slide, sterile, Nunc	Thermo Fisher, Massachusetts, USA	TKT-210-150R	Mtb infection of macropahges
L-Asparagine, anhydrous	Sigma Aldrich, Missouri, USA	A4159	Colony Forming Units
Linezolid	Sigma Aldrich, Missouri, USA	PZ0014	Antibiotic
Microlance Hypodermic Needle 25 G	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	300400	Mtb infection of macropahges/CFU
Middlebrook 7H10 Agar Base	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	M0303	Colony Forming Units
Middlebrook 7H9 Broth Base	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	M0178	Mycobacterium liquid culture
Modified Auramine O Stain and Decolourizer	Scientific Device Laboratory, IL, USA	345-250	AFB stain
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich, Missouri, USA	158127	Mtb infection of macropahges
Petri dishes, 92 x 16mm (20/bag)	Sarstedt, North Carolina, USA	82.1473.001	Colony Forming Units
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma Aldrich, Missouri, USA	P8139	Macrophage cell culture
Polysorbate 80, Difco	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	231181	Mycobacterium liquid culture
RPMI-1640, Gibco	Thermo Fisher, Massachusetts, USA	52400025	Macrophage cell culture
Sterile Cell Spreader, L-Shaped	Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA	RB-44103	Colony Forming Units
T25 TC flask, angled neck, filter cap, sterile, Nunc	Thermo Fisher, Massachusetts, USA	156367	Mycobacterium liquid culture
THP-1 cell line	ATCC, Virginia, USA	ATCC TIB-202	Macrophage cell culture