Système de culture automatisé destiné à être utilisé dans les essais précliniques de thérapies dirigées par l’hôte pour la tuberculose

Résumé

Une quantification rapide et efficace de la croissance intracellulaire de M. tuberculosis est cruciale pour poursuivre des thérapies améliorées contre la tuberculose (TB). Ce protocole décrit un test de détection colorimétrique à base de bouillon utilisant un système automatisé de culture liquide pour quantifier la croissance de Mtb dans les macrophages traités avec des thérapies candidates dirigées par l’hôte.

Résumé

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l’agent causal de la tuberculose (TB), était la maladie infectieuse la plus meurtrière dans le monde jusqu’à l’avènement de la COVID-19. Le VTT a évolué pour persister dans son environnement intracellulaire, échapper aux défenses de l’hôte et a développé une résistance à de nombreux médicaments antituberculeux. Une approche pour résoudre la résistance consiste à identifier les médicaments approuvés existants qui stimuleront la réponse immunitaire de l’hôte au Mtb. Ces médicaments pourraient ensuite être réutilisés en tant que thérapies d’appoint dirigées par l’hôte (HDT) pour raccourcir la durée du traitement et aider à surmonter la résistance aux antibiotiques.

La quantification de la croissance intracellulaire du Mtb dans les macrophages est un aspect crucial de l’évaluation du potentiel HDT. L’étalon-or pour mesurer la croissance du Mtb est le comptage des unités formant colonie (UFC) sur des plaques de gélose. Il s’agit d’un test lent et laborieux qui ne se prête pas à un dépistage rapide des médicaments. Dans ce protocole, un système de culture automatisé à base de bouillon, qui est plus couramment utilisé pour détecter le Mtb dans les échantillons cliniques, a été adapté pour le dépistage préclinique des thérapies dirigées par l’hôte. La capacité du système d’essai de culture liquide à étudier la croissance intracellulaire du Mtb dans les macrophages traités par HDT a été évaluée. Les HDT testés pour leur capacité à inhiber la croissance de Mtb étaient de l’acide rétinoïque tout-trans (AtRA), à la fois en solution et encapsulé dans des microparticules de poly(acide lactique-co-glycolique) (PLGA) et la combinaison d’interféron-gamma et de linézolide. Les avantages de cette technique automatisée basée sur la culture liquide par rapport à la méthode CFU comprennent la simplicité de configuration, une préparation moins laborieuse et un délai d’obtention des résultats plus rapide (5-12 jours contre 21 jours ou plus pour les plaques de gélose).

Introduction

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l’agent causal de la tuberculose, était la maladie infectieuse la plus meurtrière dans le monde en 2019¹. Pour échapper aux défenses de l’hôte, le Mtb subvertit l’activité mycobactéricide des cellules immunitaires innées telles que les macrophages et les cellules dendritiques (DC), ce qui lui permet de persister intracellulaire et de se répliquer². L’absence d’un vaccin efficace pour prévenir la tuberculose pulmonaire chez l’adulte et l’émergence croissante de souches pharmacorésistantes soulignent le besoin urgent de nouvelles thérapies.

Les thérapie....

Protocole

Les expériences décrites dans ce protocole ont été réalisées en utilisant la souche H37Ra atténuée de Mtb, qui peut être manipulée dans un laboratoire de niveau de confinement 2. Toutes les manipulations de mycobactéries vivantes ont été effectuées dans une enceinte de sécurité biologique (ESB) de classe II. Des procédures expérimentales ont été conçues pour minimiser la production d’aérosols. Une culture de cellules eucaryotes (cellules THP-1) a également été réalisée dans une ESB de classe II. Le laboratoire a procédé à une évaluation des risques et s’est assuré que toutes les procédures étaient conformes aux réglementations institutionnelles et nationales en matièr....

Résultats

L’instrument automatisé de culture liquide utilisé dans cette étude surveille les niveaux de CO₂ toutes les 10 minutes. Un changement de couleur dans le capteur au fond de la bouteille de l’instrument est mesuré colorimétriquement et exprimé en unités de réflectance. Le logiciel de l’instrument applique ensuite des algorithmes de détection pour calculer le temps jusqu’à la positivité (TTP), c’est-à-dire le nombre de jours entre l’inoculation et le marquage des cultures comme positives (.......

Discussion

Les auteurs ont utilisé la méthode de culture liquide décrite dans ce protocole pour surveiller la croissance de Mtb dans les macrophages dérivés de monocytes et les macrophages alvéolaires et les cellules THP-1 différenciées avec PMA^11,16,17. Cette technique peut également être modifiée pour une utilisation avec des cellules non adhérentes¹². Plus récemment, l’instrument a également été.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
IX51 Fluorescent Microscope	Olympus, Japan	N/A	AFB detection and imaging
2 mL microtube, flat bottom, screw cap, sterile	Sarstedt, North Carolina, USA	72.694.006	Mtb infection of macropahges
5 mL syringe, Luer lock	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	SZR-150-031K	Mtb infection of macropahges/CFU
50 mL tube, sterile	Sarstedt, North Carolina, USA	62.547.254	Mtb infection of macropahges
all-trans-Retinoic Acid (ATRA) ≥98% (HPLC)	Sigma Aldrich, Missouri, USA	R2625	Host directed therapy candidate
BacT/ALERT 3D Microbial Detection System	Biomerieux ( Hampshire, UK)	247001	Broth-based colormetric detection system
BACT/ALERT MP  BACT/ALERT MP Nutrient Supplement	Biomerieux ( Hampshire, UK)	414997	Broth-based colormetric detection assay
BACT/ALERT MP culture bottles	Biomerieux ( Hampshire, UK)	419744	Broth-based colormetric detection assay
BD BBL Middlebrook ADC Enrichment, 20 mL	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	M0553	Mycobacterium liquid culture
BD BBL Middlebrook OADC Enrichment, 20mL	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	M0678	Colony Forming Units
Cell scraper, 25 cm	Sarstedt, North Carolina, USA	83.1830	Harvest of lmacrophage lysates
Corning Syringe Filter, 0.2 µm	Corning Incorporated, Germany	431219	Sterilization of lysis buffer
Cover glass (borosilicate), 24 x 50 mm, #1.5 thickness	VWR International Limited	631 - 0147
Cycloheximide, from microbial	Sigma Aldrich, Missouri, USA	C7698	Colony Forming Units
Dako Fluorescent Mounting Medium	Agilent Technologies Ireland Limited	S3023	Antifade mounting medium
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich, Missouri, USA	D8537	Mtb infection of macropahges
Fetal Bovine Serum, Gibco	Thermo Fisher, Massachusetts, USA	10270106	Macrophage cell culture
Glycerol, Difco	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	228220	Colony Forming Units
Hoescht 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride)	Sigma Aldrich, Missouri, USA	B2261	Nuclear stain
IFNγ, recombinant human	R&D Systems Inc, Minnesota, USA	285-IF	Host directed therapy candidate
Labtek 2-well chamber slide, sterile, Nunc	Thermo Fisher, Massachusetts, USA	TKT-210-150R	Mtb infection of macropahges
L-Asparagine, anhydrous	Sigma Aldrich, Missouri, USA	A4159	Colony Forming Units
Linezolid	Sigma Aldrich, Missouri, USA	PZ0014	Antibiotic
Microlance Hypodermic Needle 25 G	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	300400	Mtb infection of macropahges/CFU
Middlebrook 7H10 Agar Base	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	M0303	Colony Forming Units
Middlebrook 7H9 Broth Base	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	M0178	Mycobacterium liquid culture
Modified Auramine O Stain and Decolourizer	Scientific Device Laboratory, IL, USA	345-250	AFB stain
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich, Missouri, USA	158127	Mtb infection of macropahges
Petri dishes, 92 x 16mm (20/bag)	Sarstedt, North Carolina, USA	82.1473.001	Colony Forming Units
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma Aldrich, Missouri, USA	P8139	Macrophage cell culture
Polysorbate 80, Difco	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	231181	Mycobacterium liquid culture
RPMI-1640, Gibco	Thermo Fisher, Massachusetts, USA	52400025	Macrophage cell culture
Sterile Cell Spreader, L-Shaped	Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA	RB-44103	Colony Forming Units
T25 TC flask, angled neck, filter cap, sterile, Nunc	Thermo Fisher, Massachusetts, USA	156367	Mycobacterium liquid culture
THP-1 cell line	ATCC, Virginia, USA	ATCC TIB-202	Macrophage cell culture