Ein automatisiertes Kultursystem zur präklinischen Erprobung wirtsgerichteter Therapien für Tuberkulose

Zusammenfassung

Eine schnelle und effiziente Quantifizierung des intrazellulären M . tuberculosis-Wachstums ist entscheidend für verbesserte Therapien gegen Tuberkulose (TB). Dieses Protokoll beschreibt einen brühebasierten kolorimetrischen Detektionsassay unter Verwendung eines automatisierten Flüssigkultursystems zur Quantifizierung des Mtb-Wachstums in Makrophagen, die mit Wirtstherapiekandidaten behandelt werden.

Zusammenfassung

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), der Erreger der Tuberkulose (TB), war bis zum Aufkommen von COVID-19 der weltweit bedeutendste Killer für Infektionskrankheiten. Mtb hat sich entwickelt, um in seiner intrazellulären Umgebung zu bestehen, die Abwehr des Wirts zu umgehen und hat Resistenzen gegen viele antituberkulöse Medikamente entwickelt. Ein Ansatz zur Lösung von Resistenzen besteht darin, bestehende zugelassene Medikamente zu identifizieren, die die Immunantwort des Wirts auf Mtb verstärken. Diese Medikamente könnten dann als adjunktive wirtsgerichtete Therapien (HDT) umfunktioniert werden, um die Behandlungszeit zu verkürzen und Antibiotikaresistenzen zu überwinden.

Die Quantifizierung des intrazellulären Mtb-Wachstums in Makrophagen ist ein entscheidender Aspekt bei der Beurteilung potenzieller HDT. Der Goldstandard zur Messung des Mtb-Wachstums ist das Zählen koloniebildender Einheiten (CFU) auf Agarplatten. Dies ist ein langsamer, arbeitsintensiver Assay, der sich nicht für ein schnelles Screening von Medikamenten eignet. In diesem Protokoll wurde ein automatisiertes, brühebasiertes Kultursystem, das häufiger zum Nachweis von Mtb in klinischen Proben verwendet wird, für das präklinische Screening wirtsgerichteter Therapien angepasst. Die Fähigkeit des Flüssigkultur-Assay-Systems zur Untersuchung des intrazellulären Mtb-Wachstums in Makrophagen, die mit HDT behandelt wurden, wurde bewertet. Die HDTs, die auf ihre Fähigkeit getestet wurden, das MTB-Wachstum zu hemmen, waren all-trans-Retinsäure (AtRA), sowohl in Lösung als auch in Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) -Mikropartikeln und der Kombination von Interferon-gamma und Linezolid. Zu den Vorteilen dieser automatisierten Flüssigkultur-basierten Technik gegenüber der CFU-Methode gehören die einfache Einrichtung, die weniger arbeitsintensive Vorbereitung und die schnellere Zeit bis zum Ergebnis (5-12 Tage im Vergleich zu 21 Tagen oder mehr für Agarplatten).

Einleitung

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), der Erreger der Tuberkulose, war 2019 weltweit der bedeutendste Killer für Infektionskrankheiten¹. Um der Abwehr des Wirts zu entgehen, untergräbt Mtb die mykobakterizide Aktivität von angeborenen Immunzellen wie Makrophagen und dendritischen Zellen (DCs), so dass es intrazellulär persistieren und replizieren^{kann 2}. Das Fehlen eines wirksamen Impfstoffs zur Vorbeugung der Lungentuberkulose bei Erwachsenen und das zunehmende Auftreten arzneimittelresistenter Stämme unterstreichen den dringenden Bedarf an neuen Therapien.

Adjunktive wirtsgerichtete Ther....

Protokoll

Die in diesem Protokoll beschriebenen Experimente wurden mit dem abgeschwächten H37Ra-Stamm von Mtb durchgeführt, der in einem Containment Level 2-Labor gehandhabt werden kann. Alle Manipulationen an lebenden Mykobakterien wurden in einer biologischen Sicherheitswerkbank der Klasse II (BSC) durchgeführt. Experimentelle Verfahren wurden entwickelt, um die Erzeugung von Aerosolen zu minimieren. Eukaryotische Zellkultur (THP-1-Zellen) wurde ebenfalls in einer BSC der Klasse II durchgeführt. Das Labor führte eine Risikobewertung durch und stellte sicher, dass alle Verfahren in Übereinstimmung mit den institutionellen und nationalen biologischen Sicherheitsvorschriften dur....

Ergebnisse

Das in dieser Studie verwendete automatisierte Flüssigkulturgerät überwacht alle 10 min den CO₂ -Gehalt. Eine Farbänderung im Sensor am Boden der Instrumentenflasche wird farbmetrisch gemessen und als Reflexionseinheiten ausgedrückt. Die Gerätesoftware wendet dann Detektionsalgorithmen an, um die Zeit bis zur Positivität (TTP) zu berechnen, d. H. Die Anzahl der Tage von der Inokulation bis zur Markierung der Kulturen als positiv (Abbildung 1A). Eine umgekehrte Beziehung zwi.......

Diskussion

Die Autoren haben die in diesem Protokoll beschriebene Flüssigkulturmethode verwendet, um das Mtb-Wachstum in Monozyten-abgeleiteten Makrophagen und Alveolarmakrophagen und THP-1-Zellen zu überwachen, die mit PMA^11,16,17 differenziert sind. Diese Technik kann auch für die Verwendung mit nicht adhärenten Zellen^{modifiziert werden 12}. In jüngerer Zeit wurde das Instrument auch in präklinischen Studien .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
IX51 Fluorescent Microscope	Olympus, Japan	N/A	AFB detection and imaging
2 mL microtube, flat bottom, screw cap, sterile	Sarstedt, North Carolina, USA	72.694.006	Mtb infection of macropahges
5 mL syringe, Luer lock	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	SZR-150-031K	Mtb infection of macropahges/CFU
50 mL tube, sterile	Sarstedt, North Carolina, USA	62.547.254	Mtb infection of macropahges
all-trans-Retinoic Acid (ATRA) ≥98% (HPLC)	Sigma Aldrich, Missouri, USA	R2625	Host directed therapy candidate
BacT/ALERT 3D Microbial Detection System	Biomerieux ( Hampshire, UK)	247001	Broth-based colormetric detection system
BACT/ALERT MP  BACT/ALERT MP Nutrient Supplement	Biomerieux ( Hampshire, UK)	414997	Broth-based colormetric detection assay
BACT/ALERT MP culture bottles	Biomerieux ( Hampshire, UK)	419744	Broth-based colormetric detection assay
BD BBL Middlebrook ADC Enrichment, 20 mL	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	M0553	Mycobacterium liquid culture
BD BBL Middlebrook OADC Enrichment, 20mL	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	M0678	Colony Forming Units
Cell scraper, 25 cm	Sarstedt, North Carolina, USA	83.1830	Harvest of lmacrophage lysates
Corning Syringe Filter, 0.2 µm	Corning Incorporated, Germany	431219	Sterilization of lysis buffer
Cover glass (borosilicate), 24 x 50 mm, #1.5 thickness	VWR International Limited	631 - 0147
Cycloheximide, from microbial	Sigma Aldrich, Missouri, USA	C7698	Colony Forming Units
Dako Fluorescent Mounting Medium	Agilent Technologies Ireland Limited	S3023	Antifade mounting medium
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich, Missouri, USA	D8537	Mtb infection of macropahges
Fetal Bovine Serum, Gibco	Thermo Fisher, Massachusetts, USA	10270106	Macrophage cell culture
Glycerol, Difco	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	228220	Colony Forming Units
Hoescht 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride)	Sigma Aldrich, Missouri, USA	B2261	Nuclear stain
IFNγ, recombinant human	R&D Systems Inc, Minnesota, USA	285-IF	Host directed therapy candidate
Labtek 2-well chamber slide, sterile, Nunc	Thermo Fisher, Massachusetts, USA	TKT-210-150R	Mtb infection of macropahges
L-Asparagine, anhydrous	Sigma Aldrich, Missouri, USA	A4159	Colony Forming Units
Linezolid	Sigma Aldrich, Missouri, USA	PZ0014	Antibiotic
Microlance Hypodermic Needle 25 G	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	300400	Mtb infection of macropahges/CFU
Middlebrook 7H10 Agar Base	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	M0303	Colony Forming Units
Middlebrook 7H9 Broth Base	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	M0178	Mycobacterium liquid culture
Modified Auramine O Stain and Decolourizer	Scientific Device Laboratory, IL, USA	345-250	AFB stain
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich, Missouri, USA	158127	Mtb infection of macropahges
Petri dishes, 92 x 16mm (20/bag)	Sarstedt, North Carolina, USA	82.1473.001	Colony Forming Units
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma Aldrich, Missouri, USA	P8139	Macrophage cell culture
Polysorbate 80, Difco	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	231181	Mycobacterium liquid culture
RPMI-1640, Gibco	Thermo Fisher, Massachusetts, USA	52400025	Macrophage cell culture
Sterile Cell Spreader, L-Shaped	Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA	RB-44103	Colony Forming Units
T25 TC flask, angled neck, filter cap, sterile, Nunc	Thermo Fisher, Massachusetts, USA	156367	Mycobacterium liquid culture
THP-1 cell line	ATCC, Virginia, USA	ATCC TIB-202	Macrophage cell culture