Preparación de microcápsulas multifuncionales a base de seda cargadas con plásmidos de ADN que codifican aptámeros y riboswitches de ARN

Resumen

El protocolo describe la formación de microcápsulas robustas y biocompatibles cargadas de ADN como biosensores in vitro multiplexados capaces de rastrear varios ligandos.

Resumen

Introducimos un protocolo para la preparación de microcápsulas de fibroína de seda cargadas de ADN a través del método de ensamblaje capa por capa (LbL) en núcleos esféricos de sacrificio. Después de la adsorción de una capa primaria y plásmidos de ADN, la formación de microcápsulas robustas se facilitó mediante la inducción de hojas de β en la estructura secundaria de seda durante la deshidratación aguda de una sola capa de seda. Por lo tanto, la estratificación se produjo a través de múltiples enlaces de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas. Tras la adsorción de conchas multicapa, las estructuras núcleo-cáscara se pueden funcionalizar aún más con nanopartículas de oro (AuNP) y / o anticuerpos (IgG) para ser utilizados para la teledetección y / o la entrega dirigida. El ajuste de varios parámetros clave durante la deposición secuencial de macromoléculas clave en núcleos de sílice, como la presencia de un cebador de polímero, la concentración de ADN y proteína de seda, así como una serie de capas adsorbidas, dio como resultado microcápsulas biocompatibles y cargadas de ADN con permeabilidad variable y cargas de ADN. Tras la disolución de los núcleos de sílice, el protocolo demostró la formación de microcápsulas huecas y robustas con plásmidos de ADN inmovilizados a la superficie interna de la membrana de la cápsula. La creación de una membrana biocompatible selectivamente permeable entre los plásmidos de ADN y el entorno externo preservó el ADN durante el almacenamiento a largo plazo y desempeñó un papel importante en la respuesta de salida mejorada de plásmidos confinados espacialmente. La actividad de las plantillas de ADN y su accesibilidad se probaron durante la transcripción in vitro y las reacciones de traducción (sistemas libres de células). Los plásmidos de ADN que codifican aptámeros y riboswitches de iluminación de ARN se activaron con éxito con los analitos correspondientes, como se visualizó durante la localización de transcripciones de ARN marcadas con fluorescencia o proteína GFPa1 en las membranas de la cáscara.

Introducción

El campo de la biología sintética ofrece oportunidades únicas para desarrollar capacidades de detección mediante la explotación de mecanismos naturales evolucionados por microorganismos para monitorear su entorno y amenazas potenciales. Es importante destacar que estos mecanismos de detección suelen estar vinculados a una respuesta que protege a estos microorganismos de la exposición dañina, regulando la expresión génica para mitigar los efectos negativos o prevenir la ingesta de materiales tóxicos. Ha habido esfuerzos significativos para diseñar estos microorganismos para crear sensores de células completas aprovechando estas respuestas naturales, pero redirigiéndola....

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Protocolo

1. Construcción del vector plásmido.

1. Construir un vector plásmido (pSALv-RS-GFPa1, 3.4 kb) mediante la amplificación de la secuencia codificante de un riboswitch de teofilina (ThyRS) acoplado con GFPa1 a partir del vector pJ201:23976-RS-GFPa1 (diseñado y creado por DNA2.0) y la inserción en el vector de expresión de E. coli , pSAL¹³. Utilice cebadores hacia adelante (5'-CGTGGTACCGGTGATACCAGCATCGTCTTGATG-3') e inverso (5'-CGTGCTCAGCTTAAGCCAGCTCGTAG-3') para amplificar la secuencia codificante de ThyRS acoplado con GFPa1 y realizar una reacción de PCR en volumen de 50 μL utilizando ADN polimerasa de acuerdo con el protocolo del....

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Resultados

Aquí, el estudio aborda la funcionalidad de las plantillas de ADN que codifican diferentes diseños de sensores (dos tipos de elementos de transcripción / traducción regulados por ARN) después de la encapsulación en cápsulas de proteína de seda. Las microcápsulas se prepararon mediante el ensamblaje capa por capa (LbL) de los componentes clave: una capa principal, plásmidos de ADN que codifican diseños de sensores y biopolímero de fibroína de seda (Figura 2). La deposición de ma.......

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Discusión

Las microcápsulas de hidrogel selectivamente permeables cargadas con varios tipos de diseños de sensores codificados por ADN se pueden preparar siguiendo este protocolo. Una de las características distintivas del enfoque LbL es la capacidad de adaptar la complejidad de las microcápsulas durante el ensamblaje ascendente, que generalmente comienza con la adsorción de especies moleculares en plantillas de sacrificio. Ajustando cuidadosamente las concentraciones de los componentes iniciales, las condiciones de pH y el n.......

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
(Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T)	Lucerna	DFHBI-1T
5x T4 DNA Ligase Buffer	ThermoFisher Scientific	46300-018
6x Blue Gel Loading Dye	New England BioLabs	B7021S
96-well plates, black circular	Corning	3601
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	BioReagent, for molecular biology, low EEO
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A0166	powder or crystals, BioReagent, suitable for cell culture
BlpI restriction enzymes	New England BioLabs	R0585S
Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems	FisherScientific	09-761-1
Dimethyl sulfoxide, DMSO	Sigma-Aldrich	472301	ACS reagent, ≥99.9%
DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Broccoli (5.4 kb), BrocApt.	Addgene	Plasmid #66788
DyLightTM550 Antibody Labeling kit (Invitrogen)	ThermoFisher Scientific	84530
E. coli S30 extract system for circular DNA	Promega	L1020
Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL	FisherScientific	14-959-53A
Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL		14-432-22
Fisherbrand Microcentrifuge tubes, 1.5 mL	FisherScientific	05-408-129
Hydrofluoric acid, HF	Sigma-Aldrich	695068	ACS reagent, 48%
Kanamycin sulfate	Sigma-Aldrich	60615	mixture of Kanamycin A (main component) and Kanamycin B and C
KpnI restriction enzymes	New England BioLabs	R0142S
LB agar plate supplemented with 100 µg/mL ampicillin	Sigma-Aldrich	L5667	pre-poured agar plates with 100 µg/mL ampicillin
LB agar plate supplemented with 50 µg/mL kanamycin	Sigma-Aldrich	L0543	pre-poured agar plates with 50 µg/mL kanamycin
LB broth (Lennox grade)	Sigma-Aldrich	L3022
Lithium bromide, LiBr	Sigma-Aldrich	213225	ReagentPlus, ≥99%
Max Efficiency DH5-α competent E. coli strain	ThermoFisher Scientific	18258012
Methanol	MilliporeSigma	322415	anhydrous, 99.8%
MilliQ-water	EMD MilliPore		Milli-Q Reference Water Purification System
MinElute PCR Purification Kit	Qiagen	28004
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC	Sigma-Aldrich	E1769
PBS (phosphate buffered saline)	ThermoFisher Scientific	10010023	1x PBS, pH 7.4
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S
Polyethylenimine, branched	Sigma-Aldrich	408727	average Mw ~25,000
PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit	New England BioLabs	E6800S
QIAEX II Gel Extraction Kit	Qiagen	20021
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0.1-10.0 kb)	New England BioLabs	N0469S
SiO? silica microspheres, 4.0 µm	Polysciences, Inc.	24331-15	10% aqueous solution
Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 15 mL	ThermoFisher Scientific	87724
Sodium carbonate, Na?CO?	Sigma-Aldrich	222321	ACS reagent, anhydrous, ≥99.5%, powder
Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysis Devices	FisherScientific	08-607-008	Spectrum G235058
SYBR Safe DNA gel stain	ThermoFisher Scientific	S33102
T4 DNA Ligase (5 U/µL)	ThermoFisher Scientific	EL0011
Theophylline	Sigma-Aldrich	T1633	anhydrous, ≥99%, powder
Tris Acetate-EDTA buffer (TAE buffer)	Sigma-Aldrich	T6025	Contains 40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA, pH 8.3.
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	FisherScientific	10-977-023
ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit	ZymoResearch	D4202