Préparation de microcapsules multifonctionnelles à base de soie chargées de plasmides d’ADN codant pour des aptamères d’ARN et des riboswitches

Résumé

Le protocole décrit la formation de microcapsules chargées d’ADN robustes et biocompatibles sous forme de biocapteurs in vitro multiplexés capables de suivre plusieurs ligands.

Résumé

Nous introduisons un protocole pour la préparation de microcapsules de fibroïne de soie chargées d’ADN via la méthode d’assemblage couche par couche (LbL) sur des noyaux sphériques sacrificiels. Après l’adsorption d’une couche première et de plasmides d’ADN, la formation de microcapsules robustes a été facilitée par l’induction de feuilles de β dans la structure secondaire de la soie lors de la déshydratation aiguë d’une seule couche de soie. Par conséquent, la stratification s’est produite via de multiples liaisons hydrogène et interactions hydrophobes. Lors de l’adsorption de coquilles multicouches, les structures noyau-coquille peuvent être fonctionnalisées davantage avec des nanoparticules d’or (AuNP) et / ou des anticorps (IgG) à utiliser pour la télédétection et / ou la livraison ciblée. L’ajustement de plusieurs paramètres clés lors du dépôt séquentiel de macromolécules clés sur des noyaux de silice, tels que la présence d’un apprêt polymère, la concentration d’ADN et de protéines de soie, ainsi qu’un certain nombre de couches adsorbées, a abouti à des microcapsules biocompatibles chargées d’ADN avec une perméabilité et des charges d’ADN variables. Lors de la dissolution des noyaux de silice, le protocole a démontré la formation de microcapsules creuses et robustes avec des plasmides d’ADN immobilisés sur la surface interne de la membrane de la capsule. La création d’une membrane biocompatible sélectivement perméable entre les plasmides d’ADN et l’environnement externe a préservé l’ADN pendant le stockage à long terme et a joué un rôle important dans l’amélioration de la réponse de sortie des plasmides confinés dans l’espace. L’activité des modèles d’ADN et leur accessibilité ont été testées lors de réactions de transcription et de traduction in vitro (systèmes acellulaires). Les plasmides d’ADN codant pour les aptamères et les riboswitches d’ARN ont été activés avec succès avec les analytes correspondants, comme cela a été visualisé lors de la localisation de transcrits d’ARN marqués par fluorescence ou de la protéine GFPa1 dans les membranes de la coquille.

Introduction

Le domaine de la biologie synthétique offre des opportunités uniques de développer des capacités de détection en exploitant les mécanismes naturels développés par les micro-organismes pour surveiller leur environnement et les menaces potentielles. Il est important de noter que ces mécanismes de détection sont généralement liés à une réponse qui protège ces micro-organismes contre l’exposition nocive, régulant l’expression des gènes pour atténuer les effets négatifs ou empêcher l’absorption de matières toxiques. Des efforts importants ont été déployés pour concevoir ces microorganismes afin de créer des capteurs de cellules entières tirant parti de ces réponses naturel....

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Protocole

1. Construction du vecteur plasmidique.

1. Construire un vecteur plasmidique (pSALv-RS-GFPa1, 3,4 kb) par amplification de la séquence codante d’un riboswitch théophylline (ThyRS) couplé à GFPa1 à partir du vecteur pJ201:23976-RS-GFPa1 (conçu et créé par DNA2.0) et insertion dans le vecteur d’expression E. coli, pSAL¹³. Utiliser des amorces avant (5'-CGTGGTACCGGTGATACCAGCATCGTCTTGATG-3') et inverse (5'-CGTGCTCAGCTTAAGCCAGCTCGTAG-3') pour amplifier la séquence codante de ThyRS couplée à GFPa1 et effectuer une réaction de PCR dans un volume de 50 μL en utilisant l’ADN polymérase selon le protocole^{du fabricant 14<....}

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Résultats

Ici, l’étude aborde la fonctionnalité des modèles d’ADN codant différents modèles de capteurs (deux types d’éléments de transcription / traduction régulés par l’ARN) après encapsulation dans des capsules de protéines de soie. Les microcapsules ont été préparées au moyen d’un modèle d’assemblage couche par couche (LbL) des composants clés : une couche primaire, des plasmides d’ADN codant pour des conceptions de capteurs et un biopolymère de fibroïne de soie (Figure 2

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Discussion

Des microcapsules d’hydrogel sélectivement perméables chargées de différents types de conceptions de capteurs codés par l’ADN peuvent être préparées en suivant ce protocole. L’une des caractéristiques distinctives de l’approche LbL est la capacité d’adapter la complexité des microcapsules lors de l’assemblage ascendant, qui commence généralement par l’adsorption d’espèces moléculaires sur des modèles sacrificiels. En ajustant soigneusement les concentrations des composants initiaux, les co.......

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
(Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T)	Lucerna	DFHBI-1T
5x T4 DNA Ligase Buffer	ThermoFisher Scientific	46300-018
6x Blue Gel Loading Dye	New England BioLabs	B7021S
96-well plates, black circular	Corning	3601
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	BioReagent, for molecular biology, low EEO
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A0166	powder or crystals, BioReagent, suitable for cell culture
BlpI restriction enzymes	New England BioLabs	R0585S
Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems	FisherScientific	09-761-1
Dimethyl sulfoxide, DMSO	Sigma-Aldrich	472301	ACS reagent, ≥99.9%
DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Broccoli (5.4 kb), BrocApt.	Addgene	Plasmid #66788
DyLightTM550 Antibody Labeling kit (Invitrogen)	ThermoFisher Scientific	84530
E. coli S30 extract system for circular DNA	Promega	L1020
Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL	FisherScientific	14-959-53A
Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL		14-432-22
Fisherbrand Microcentrifuge tubes, 1.5 mL	FisherScientific	05-408-129
Hydrofluoric acid, HF	Sigma-Aldrich	695068	ACS reagent, 48%
Kanamycin sulfate	Sigma-Aldrich	60615	mixture of Kanamycin A (main component) and Kanamycin B and C
KpnI restriction enzymes	New England BioLabs	R0142S
LB agar plate supplemented with 100 µg/mL ampicillin	Sigma-Aldrich	L5667	pre-poured agar plates with 100 µg/mL ampicillin
LB agar plate supplemented with 50 µg/mL kanamycin	Sigma-Aldrich	L0543	pre-poured agar plates with 50 µg/mL kanamycin
LB broth (Lennox grade)	Sigma-Aldrich	L3022
Lithium bromide, LiBr	Sigma-Aldrich	213225	ReagentPlus, ≥99%
Max Efficiency DH5-α competent E. coli strain	ThermoFisher Scientific	18258012
Methanol	MilliporeSigma	322415	anhydrous, 99.8%
MilliQ-water	EMD MilliPore		Milli-Q Reference Water Purification System
MinElute PCR Purification Kit	Qiagen	28004
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC	Sigma-Aldrich	E1769
PBS (phosphate buffered saline)	ThermoFisher Scientific	10010023	1x PBS, pH 7.4
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S
Polyethylenimine, branched	Sigma-Aldrich	408727	average Mw ~25,000
PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit	New England BioLabs	E6800S
QIAEX II Gel Extraction Kit	Qiagen	20021
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0.1-10.0 kb)	New England BioLabs	N0469S
SiO? silica microspheres, 4.0 µm	Polysciences, Inc.	24331-15	10% aqueous solution
Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 15 mL	ThermoFisher Scientific	87724
Sodium carbonate, Na?CO?	Sigma-Aldrich	222321	ACS reagent, anhydrous, ≥99.5%, powder
Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysis Devices	FisherScientific	08-607-008	Spectrum G235058
SYBR Safe DNA gel stain	ThermoFisher Scientific	S33102
T4 DNA Ligase (5 U/µL)	ThermoFisher Scientific	EL0011
Theophylline	Sigma-Aldrich	T1633	anhydrous, ≥99%, powder
Tris Acetate-EDTA buffer (TAE buffer)	Sigma-Aldrich	T6025	Contains 40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA, pH 8.3.
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	FisherScientific	10-977-023
ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit	ZymoResearch	D4202