Tinción inmunohistoquímica fluorescente multiplexada de cuatro tipos de células inmunes endometriales en aborto espontáneo recurrente

Resumen

A pesar de los avances en inmunohistoquímica multiplex e imágenes multiespectrales, la caracterización de la densidad y la agrupación de las principales células inmunes simultáneamente en el endometrio sigue siendo un desafío. Este artículo describe un protocolo detallado de tinción multiplex e imágenes para la localización simultánea de cuatro tipos de células inmunes en el endometrio.

Resumen

La inmunohistoquímica es el método más utilizado para la identificación y visualización de antígenos tisulares en la investigación biológica y el diagnóstico clínico. Se puede utilizar para caracterizar diversos procesos biológicos o patologías, como la cicatrización de heridas, la respuesta inmune, el rechazo de tejidos y las interacciones tejido-biomaterial. Sin embargo, la visualización y cuantificación de múltiples antígenos (especialmente para las células inmunes) en una sola sección de tejido utilizando tinción inmunohistoquímica convencional (IHC) sigue siendo insatisfactoria. Por lo tanto, las tecnologías multiplexadas se introdujeron en los últimos años para identificar múltiples marcadores biológicos en una sola muestra de tejido o un conjunto de diferentes muestras de tejido.

Estas tecnologías pueden ser especialmente útiles para diferenciar los cambios en las interacciones inmunes de célula a célula dentro del endometrio entre mujeres fértiles y mujeres con abortos espontáneos recurrentes durante la implantación. Este artículo describe un protocolo detallado para la tinción de fluorescencia multiplexada IHC para investigar la densidad y la agrupación de cuatro tipos principales de células inmunes simultáneamente en muestras endometriales cronometradas con precisión durante la implantación embrionaria. El método incluye la preparación de muestras, la optimización multiplex con marcadores para subtipos de células inmunes y el escaneo de las diapositivas, seguido de análisis de datos, con referencia específica a la detección de células inmunes endometriales.

Usando este método, la densidad y la agrupación de cuatro tipos principales de células inmunes en el endometrio se pueden analizar simultáneamente en una sola sección de tejido. Además, este documento discutirá los factores críticos y la solución de problemas para superar la posible interferencia de fluoróforos entre las sondas fluorescentes que se aplican. Es importante destacar que los resultados de esta técnica de tinción multiplex pueden ayudar a proporcionar una comprensión profunda de la interacción inmunológica y la regulación durante la implantación del embrión.

Introducción

El aborto espontáneo recurrente (RM) se puede definir como la pérdida de dos o más embarazos antes de las 24 semanas de gestación¹. Esta condición reproductiva frecuente afecta hasta al 1% de las parejas en todo el mundo^2,3. La fisiopatología es multifactorial y se puede dividir en causas impulsadas embriológicamente (principalmente debido a un cariotipo embrionario anormal) y causas impulsadas por la madre que afectan el endometrio y / o el desarrollo placentario. Esta manifestación puede ser el resultado de anomalías genéticas parentales, anomalías uterinas, afecciones protrombóticas, factores de endocrinología y trastornos inmunológicos⁴.

En los últimos años, la disfunción de las células inmunofectoras se ha implicado en la patogénesis de la pérdida temprana del embarazo⁵. Esto ha inspirado muchas investigaciones para dilucidar las poblaciones específicas de células inmunes en el endometrio durante el ciclo menstrual, la implantación y el embarazo temprano, con funciones específicas en el embarazo temprano. Entre estas células inmunes, las células asesinas naturales uterinas (uNK) juegan un papel crítico durante la implantación embrionaria y el embarazo, particularmente en los procesos de invasión trofoblástica y angiogénesis⁶. Los estudios han demostrado un aumento de la densidad celular uNK en el endometrio de mujeres con RM^7,8,aunque este hallazgo no se asoció con un mayor riesgo de aborto espontáneo⁹. Sin embargo, esto estimuló la investigación que evalúa la densidad de otros tipos de células inmunes (como macrófagos, células dendríticas uterinas) en el endometrio en mujeres con RM^10,11. Sin embargo, sigue siendo incierto si existe una alteración significativa en la densidad de células inmunes en el endometrio periimplantacional en mujeres con RM.

Una posible explicación para la incertidumbre es que la evaluación de la densidad de células inmunes endometriales podría ser difícil debido a los rápidos cambios en el endometrio durante la ventana de implantación. Durante el período de 24 h, cambios significativos en el endometrio alteran la densidad celular inmune y la secreción de citoquinas, introduciendo una fuente de variación en estos resultados¹². Además, la mayoría de los informes se basan principalmente en el uso de tinción unicelular (por ejemplo, métodos tradicionales de IHC) que no pudieron examinar múltiples marcadores en la misma sección de tejido. Aunque la citometría de flujo se puede utilizar para detectar múltiples poblaciones celulares en una sola muestra, las grandes cantidades de células requeridas y la optimización que consume mucho tiempo dificultan la popularidad y la eficiencia de este método. Por lo tanto, el reciente avance en la tinción multiplex IHC podría resolver este problema mediante la inmunotinción de múltiples marcadores en la misma diapositiva para evaluar múltiples parámetros, incluido el linaje celular y la localización histológica de subpoblaciones inmunes individuales. Además, esta tecnología puede maximizar la información obtenida en caso de disponibilidad limitada de tejido. En última instancia, esta técnica puede ayudar a dilucidar las diferencias en las interacciones de las células inmunes en el endometrio entre las mujeres fértiles y las mujeres con RM.

Dos grupos de mujeres fueron reclutadas del Hospital Príncipe de Gales, incluidas las mujeres de control fértil (FC) y las mujeres con aborto espontáneo recurrente inexplicable (RM). El control fértil se definió como las mujeres que tuvieron al menos un nacimiento vivo sin antecedentes de aborto espontáneo, y las mujeres RM se definieron como aquellas que tenían antecedentes de abortos espontáneos consecutivos ≥2 antes de las 20 semanas de gestación. Los sujetos de los dos grupos cumplieron con los siguientes criterios de inclusión: (a) edad entre 20 y 42 años, (b) no fumador, (c) ciclo menstrual regular (25-35 días) y estructura uterina normal, (d) no uso de ningún régimen hormonal durante al menos 3 meses antes de la biopsia endometrial, (e) no hidrosalpinx por histero-salpingograma. Además, todos los sujetos reclutados tenían cariotipo normal, histerosalpingografía tridimensional normal, hormona estimulante del folículo día 2 < 10 UI / L, progesterona lútea media > 30 nmol / L, función tiroidea normal y dieron negativo para anticoagulante lúpico y anticuerpos IgG e IgM anticardiolipina.

Para comprender mejor la base inmunológica de la RM, sería más deseable cuantificar y localizar simultáneamente los principales tipos de células inmunes presentes en el endometrio en el momento de la implantación. Este artículo describe todo el protocolo desde la preparación de la muestra, la optimización multiplex con marcadores para los subtipos de células inmunes y el escaneo de las diapositivas, seguido de un análisis de datos con referencia específica a la detección de células inmunes endometriales. Además, este artículo describe cómo determinar la densidad y la agrupación de los tipos de células inmunes simultáneamente en el endometrio.

Protocolo

El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación Clínica conjunta de la Universidad China de Hong Kong-Nuevos Territorios del Clúster Este. Se obtuvo el consentimiento informado de los participantes antes de recoger las biopsias endometriales. Consulte la sección de introducción para conocer los criterios de inclusión de los grupos de control y RM.

1. Preparación de la muestra

1. Asegúrese de que todas las mujeres en este estudio se sometan a una prueba diaria de tira reactiva de orina a partir del día 9 del ciclo menstrual en adelante para identificar el aumento de la hormona luteinizante (LH) para detectar la ovulación, y cronometrar las biopsias endometriales precisamente en el día⁷ después del aumento de LH (LH + 7).
2. Obtenga un fragmento de^0,5 cm 2 de biopsia endometrial utilizando un muestreador pipelle o Pipet Curet de mujeres fértiles y mujeres con RM inexplicable. Etiquete el recipiente y coloque la muestra inmediatamente en formalina tamponada neutra al 10% (pH 7) para la fijación durante la noche a temperatura ambiente.
   NOTA: El volumen del fijador debe ser de 5 a 10 veces el del tejido.
3. Coloque el pañuelo en un cartucho para deshidratación en una máquina de procesamiento de tejidos antes de incrustarlo en cera de parafina fundida. Incrustar los tejidos en parafina a 58-60 °C.
4. Deje que el bloque de parafina se enfríe durante la noche a temperatura ambiente. Utilice un microtomo para recortar los bloques de parafina a un grosor de 3 μm.
   NOTA: El uso de agua destilada ayuda en el montaje adecuado del tejido y la adherencia a lo largo de la tinción multiplex.
5. Coloque la cinta de parafina en un baño de agua a 40-45 °C durante 30 s.
6. Monte las secciones en portaobjetos de vidrio recubiertos de poli-L-lisina (0,1% p/v). Coloque los portaobjetos con el tejido hacia arriba y deje secar a 37 °C durante la noche. Guarde los portaobjetos en una caja de diapositivas lejos de temperaturas extremas hasta su uso posterior.

2. Determinar la concentración ideal de anticuerpos para la IHC multiplex utilizando la IHC convencional.

NOTA: Esto es importante para identificar el nivel de expresión y el patrón de cada marcador inmune en la muestra de endometrio, y determinar la secuencia de tinción de cada marcador, así como sus emparejamientos de fluoróforos de amplificación de señal de tiramida (TSA) asociados.

1. Pruebe los anticuerpos para determinar su idoneidad para la IHC multiplex mediante el uso manual convencional de IHC^13.
2. Use tejidos de endometrio para pruebas de anticuerpos únicos.
3. Incluya un control positivo (por ejemplo, bazo) y un control negativo (control de isotipos) para optimizar la condición de tinción de cada anticuerpo.
4. Realice la tinción utilizando la dilución recomendada por la hoja de datos del anticuerpo.
5. Realice tinciones adicionales utilizando concentraciones por encima y por debajo de la dilución recomendada utilizada en el paso 2.3.
   NOTA: Un patólogo clínico debe evaluar los portaobjetos teñidos a ciegas para confirmar la localización del sondeo de anticuerpos y la integridad celular.

3. Método de tinción multiplex

1. Preparación y fijación de diapositivas
   1. Coloque los portaobjetos (a partir del paso 1.6) planos con el tejido hacia arriba en un horno y hornee a 60 ° C durante al menos 1 h.
   2. Retire los portaobjetos del horno y déjelos enfriar durante al menos 20 minutos a temperatura ambiente antes de colocarlos en una rejilla deslizante vertical.
   3. Desparasabilice y rehidrate los portaobjetos fijos en formalina e incrustados en parafina con 10 minutos asignados a cada uno de los siguientes pasos: xileno (2x), 100% etanol (2x), 95% etanol (1x), 70% etanol (2x) y agua destilada (2x).
   4. Coloque el estante de portaobjetos en una caja de diapositivas de plástico y sumérjalos en solución salina tamponada Tris (TBS, pH 7.6).
      NOTA: Los portaobjetos deben permanecer húmedos desde este paso de rehidratación hasta el montaje en el paso final.
   5. Fije las muestras sumergiendo las diapositivas en una caja de diapositivas de plástico llena de una mezcla de formaldehído diluido en metanol (1:9) durante 30 minutos en la oscuridad.
   6. Lave los portaobjetos dos veces en agua desionizada durante 2 minutos y luego proceda a la recuperación de antígenos.
2. Recuperación de epítopos
   1. Coloque el estante de portaobjetos en una caja resistente al calor y llénelo con tampón de ácido cítrico (pH 6.0) para cubrir los portaobjetos.
   2. Coloque la caja en el microondas y caliente las diapositivas durante 50 s al 100% de potencia, seguida de 20 minutos al 20% de potencia para mantener la misma temperatura.
   3. Deje que los toboganes se enfríen durante aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente.
   4. Enjuague los toboganes en agua durante 2 minutos seguido de TBS-Tween 20 (TBST) durante 2 minutos.
      NOTA: TBST se compone de 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl y 0.05% Tween 20 (v / v).
3. Bloqueante
   1. Bloquee la actividad endógena de la peroxidasa en el tejido sumergiendo el portaobjetos en un frasco que contenga solución de bloqueo de peroxidasa (consulte la Tabla de materiales)durante 10 min.
   2. Lave los portaobjetos con TBST durante 5 min.
   3. Use una pluma de barrera hidrofóbica para marcar un límite alrededor de la sección de tejido en la diapositiva.
   4. Cubra las secciones de tejido con un tampón de bloqueo (ver la Tabla de Materiales)o albúmina sérica bovina (5%, p/v), e incube los portaobjetos en una cámara humidificada durante 15 min.
4. Aplicación de anticuerpos y señales
   1. Retire los reactivos de bloqueo.
   2. Incubar con el anticuerpo primario de interés (p. ej., CD3, dilución 1:100 en diluyente de anticuerpos, ver Tabla 1)en una cámara humidificada a temperatura ambiente durante 30 min.
   3. Retire el anticuerpo primario. Lavar 3x con TBST durante 5 min cada vez.
   4. Incubar con el anticuerpo secundario marcado con el polímero de rábano picante peroxidasa (HRP)(Tabla 1)durante 15 min en una cámara humidificada a temperatura ambiente. Lavar 3x con TBST durante 5 min cada vez.
   5. Aplique la solución de trabajo TSA de fluoróforo opal (1:100 en diluyente de amplificación) e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos para permitir la conjugación de fluoróforos a la muestra de tejido en los sitios primarios de unión de anticuerpos. Lavar con TBST por triplicado durante 5 min cada vez.
5. Pelado a base de microondas
   1. Enjuague con el tampón de recuperación de antígenos (solución tampón de citrato, pH 6.0).
   2. Realice una extracción basada en microondas para eliminar el complejo primario-secundario-HRP para introducir el siguiente anticuerpo primario (por ejemplo, CD20).
   3. Coloque las diapositivas en el búfer de recuperación de antígenos, microondas al 100% de potencia durante 50 s seguidas de una potencia del 20% durante 20 minutos en recipientes aptos para microondas y enfríelas a temperatura ambiente durante 15 minutos.
   4. Repita los pasos 3.2.4 a 3.5.2 hasta que las muestras de tejido hayan sido sondeadas con todos los anticuerpos primarios.
6. Contratinción y montaje
   1. Después de la extracción y el enfriamiento a base de microondas del tampón de recuperación de antígenos, enjuague las diapositivas en agua destilada y TBST.
   2. Incubar con solución de 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1,0 μg/ml) durante 5 min en una cámara humidificada a temperatura ambiente.
   3. Lavar 3x con TBST durante 5 min cada vez. Lavar con agua una vez durante 5 min.
   4. Seque al aire la corredera y monte con el medio de montaje adecuado (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: No se requerirá contratinción para las diapositivas monoplex que se utilizarán para el desarrollo de bibliotecas espectrales.

4. Imagen y análisis

1. Preparación de diapositivas de la biblioteca espectral
   1. Cree diapositivas de biblioteca (imágenes de referencia de una sola mancha) para cada fluoróforo, DAPI y autofluorescencia con el mismo tejido de control para el análisis de imágenes multiespectrales.
   2. Usando las diapositivas de las muestras de biopsia endometrial de mujeres con RM y mujeres fértiles, realice los pasos 1.1 a 3.6.4 para la detección de anticuerpo único para cada diapositiva (sin más adición de anticuerpos o fluoróforos).
   3. Para cada detección de anticuerpos, manche una de las diapositivas con DAPI (como en el paso 3.6.2) y deje una diapositiva sin teñir para la detección de cualquier posible autofluorescencia tisular en el espectro.
   4. Utilice los filtros adecuados en la estación de trabajo para obtener la imagen de este conjunto de diapositivas para cada anticuerpo y cargarlas en la biblioteca de análisis de imágenes (como se describe en el paso 4.2).
   5. Una vez capturada la imagen, seleccione inForm como Spectral Library Source y cree la biblioteca espectral.
   6. A medida que se utilizan fluoróforos, seleccione Manchas/Fluores... en el menú.
   7. Al elegir las manchas o fluoróforos, reduzca las opciones seleccionando uno o más grupos. Seleccione Todo para mostrar todos los espectros compatibles con las imágenes.
2. Imágenes espectrales
   NOTA: Las imágenes se capturaron utilizando la estación de trabajo Mantra con la biblioteca espectral establecida utilizando el software inForm Image Analysis.
   1. Capture la imagen de las diapositivas teñidas de un solo anticuerpo con los filtros de epifluorescencia apropiados como se propone en la Tabla 2 (por ejemplo, DAPI, isotiocianato de fluoresceína [FITC], CY3, Texas Red y CY5) utilizando la estación de trabajo.
      NOTA: Los filtros recomendados para los fluoróforos específicos utilizados en este protocolo se muestran en la Tabla 2.
   2. Identifique un tiempo de exposición adecuado para una señal óptima examinando cada marcador en su canal de fluorescencia correspondiente.
      NOTA: La señal óptima se determina de acuerdo con la referencia sobre la positividad y localización obtenida en la tinción de anticuerpo único.
   3. Determinar un tiempo de exposición fijo para cada analito (combinación anticuerpo-fluoróforo) para estandarizar una comparación entre muestras.
      NOTA: La determinación de la exposición fija depende de la intensidad en la muestra de intereses.
   4. Escanee las diapositivas teñidas de multiplex en el modo de escaneo apropiado con el algoritmo de enfoque automático integrado.
      NOTA: La biblioteca espectral establecida se utilizaría para diferenciar el cubo de imagen multiespectral en componentes individuales individuales (desmezcla espectral). Esto permitiría procesar la identificación basada en el color de todos los marcadores de interés utilizando los siguientes dos pasos principales: sesión de capacitación y sesión de análisis de imágenes.
3. Análisis de imágenes
   1. Recuento celular de tipos seleccionados de células inmunitarias en el endometrio
   2. Capture un mínimo de 10 campos para su análisis con un aumento de 200x.
      NOTA: Los campos se capturaron escaneando toda la sección sin ninguna selección. Esto puede garantizar la captura simultánea de todos los componentes celulares del endometrio, por ejemplo, el borde epitelial luminal, el estroma y las glándulas.
   3. Para contar las celdas, haga clic en el botón Contar objetos en la barra de pasos para mostrar el panel Configuración de recuento de objetos.
   4. Marque la casilla Descartar objeto si toca un borde para la exclusión de cualquier objeto que toque el borde de la imagen, la región de proceso o la región de tejido.
   5. Si el tejido se ha segmentado, seleccione la categoría de tejido en la que se encuentran los objetos. No cuente objetos fuera de la categoría de tejido seleccionada.
   6. Seleccione el enfoque deseado para identificar objetos: basado en objetos o basado en píxeles (umbral).
      NOTA: El enfoque basado en píxeles (umbral) debe seleccionarse en caso de una mancha confiable o consistente para la cual la aplicación de un umbral simple producirá los píxeles del objeto. El enfoque basado en objetos se recomienda cuando se requieren enfoques más avanzados basados en morfometría en caso de falta de consistencia y especificidad de tinción de objetos.
   7. Seleccione la escalade señal deseada: Escala automática o Escala fija.
      NOTA: Si se elige Escala automática, se escalará automáticamente cada plano de componente antes de realizar la segmentación de objetos. La opción de escala fija se recomienda cuando se requiere un mejor rendimiento de segmentación y las señales de tinción son consistentes y confiables.
   8. Seleccione el componente principal para la segmentación de objetos en la lista desplegable.
   9. Ajuste el valor de señal mínima para el componente principal al valor de umbral deseado.
   10. Para rellenar automáticamente los taladros de los objetos, seleccione Rellenar taladros.
   11. Para detectar objetos que tocan otros objetos como objetos individuales, en lugar de como un solo objeto, active la casilla Refinar división después de activar la casilla Tamaño máximo (píxeles).
   12. Para excluir objetos en función de la redondez del objeto, marque la casilla Redondez y especifique la circularidad mínimadeseada.
   13. Contar todas las células del estroma (CD3⁻/CD20⁻/CD68⁻/CD56⁻y DAPI^+),incluidas las células que rodean los vasos sanguíneos.
   14. Contar las células inmunitarias por separado,incluyendo linfocitos T (CD3+^y DAPI+), células B (CD20+^y DAPI+), macrófagos (CD68+ y DAPI+), y células uNK (CD56+ y DAPI+).
   15. Exprese los datos como los porcentajes de las células inmunes en relación con el número total de células estromales para cada imagen capturada, e informe el recuento final de células como un promedio de todos los campos.
   16. Utilice el Editor de vistas para ver las tablas de datos resultantes después del procesamiento. Exporte la tabla Contar datos.
   17. Cuantificación de la distribución espacial de las células inmunes endometriales
   18. Bajo un aumento de 200x, estime la función L utilizando el programa R para un rango de 0-20 μm considerado una distancia máxima de contacto célula-célula¹⁴.
       NOTA: Se utilizó la caja de herramientas del lenguaje R 'spatstat' para medir la función L.
       1. Denota el nivel de agrupamiento de diferentes pares de células inmunes en función del área bajo la curva (AUC) de su función L.

Resultados

El proceso esquemático general de realizar un ensayo multiplex de 4 colores para la detección de 4 tipos de células inmunes endometriales se muestra en la Figura 1. En resumen, el protocolo para esta tinción de inmunofluorescencia multiplex requirió 8 pasos clave: 1. Preparación de diapositivas, 2. Recuperación de epítopos, 3. Bloqueo, 4. Aplicación de anticuerpos primarios, 5. Aplicación secundaria de anticuerpos, 6. Amplificación de señales, 7. Eliminación de anticuerpos y 8. ...

Discusión

Pasos críticos dentro del protocolo
Es importante tener en cuenta que la tinción multiplex requiere una optimización diligente. La recuperación de antígenos, utilizando tampón de citrato y tecnología de microondas, requiere optimización para garantizar la extracción completa de anticuerpos y mantener la viabilidad del tejido. A medida que los reactivos TSA se unen covalentemente a los sitios que rodean el antígeno, pueden inhibir potencialmente la unión de un anticuerpo primario posterior a...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplification Diluent	Perkin Elmer	FP1498	Fluorophore diluent buffer
Antibody diluent	Perkin Elmer	ARD1001EA	Diluting the antibody
CD3	Spring Bioscience	M3072	Primary antibody
CD20	Biocare Medical	CM004B	Primary antibody
CD56	Leica	NCL-CD56-504	Primary antibody
CD68	Spring Bioscience	M5510	Primary antibody
Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x)	Abcam	AB64214	Antigen retrieval solution
EMSURE Xylene (isomeric mixture)	Merck	108297	Dewaxing
Ethanol absolute	Merck	107017	Ethyl alcohol for rehydration
HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome	Leica	RM2125RTS	Sectioning of paraffin-embedded tissue
inForm Advanced Image Analysis Software	Perkin Elmer	inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0)	Data Analysis software
Mantra® Workstation	Akoya Biosciences	CLS140089	Spectral imaging
Microwave	Panasonic	Inverter	Microwave stripping
Opal 520	Perkin Elmer	FP1487A	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal 620	Perkin Elmer	FP1495A	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal 650	Perkin Elmer	FP1496A	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal 690	Perkin Elmer	FP1497A	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Oven	Memmert	U10	Dewaxing
Peroxidase Blocking Solution	DAKO	S2023	Removal of tissue peroxidase activities
Poly-L-lysine coated slide	FISHER SCIENTIFIC	120-550-15	Slide for routine histological use
PolyHRP Broad Spectrum	Perkin Elmer	ARH1001EA	Secondary antibody
ProLong™ Gold Antifade Mountant	ThemoFisher Scientific	P36930	Mounting
Spatstat	/	Version 2.1-0	Spatial point pattern analysis
Spectral DAPI	Perkin Elmer	FP1490A	Nucleic acid staining
Tissue Processor	Thermo Fischer	Excelsior ES	Tissue processing for dehydration and paraffination
Tris Buffer Saline (TBS), 10x	Cell Signaling Technology	12498S	Washing solution
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1370-1L	Nonionic detergent