تلطيخ الفلورسنت المناعي متعدد الخلايا المناعية من أربعة أنواع من الخلايا المناعية بطانة الرحم في الإجهاض المتكرر

Yiwei Zhao; Gene Chi Wai Man; Loucia Kit Ying Chan; Xi Guo; Yingyu Liu; Tao Zhang; Joseph Kwong; Chi Chiu Wang; Xiaoyan Chen; Tin Chiu Li

doi:10.3791/62931

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

على الرغم من التقدم في الكيمياء المناعية المتعددة والتصوير متعدد الأطياف ، فإن توصيف كثافة وتتجمع الخلايا المناعية الرئيسية في وقت واحد في بطانة الرحم لا يزال يشكل تحديا. تصف هذه الورقة بروتوكول تلطيخ متعدد المضاعفات مفصل وتصوير للتوطين المتزامن لأربعة أنواع من الخلايا المناعية في بطانة الرحم.

Abstract

الكيمياء المناعية هي الطريقة الأكثر استخداما لتحديد وتصور مستضدات الأنسجة في البحوث البيولوجية والتشخيص السريري. ويمكن استخدامه لوصف العمليات البيولوجية المختلفة أو الأمراض، مثل التئام الجروح، والاستجابة المناعية، ورفض الأنسجة، والتفاعلات بين الأنسجة والمواد الحيوية. ومع ذلك، فإن تصور وتكميم المستضدات المتعددة (خاصة للخلايا المناعية) في قسم واحد من الأنسجة باستخدام تلطيخ المناعة الكيميائية التقليدية (IHC) لا يزال غير مرض. ومن ثم، تم إدخال تقنيات متعددة العينات في السنوات الأخيرة لتحديد علامات بيولوجية متعددة في عينة نسيج واحدة أو مجموعة من عينات الأنسجة المختلفة.

يمكن أن تكون هذه التقنيات مفيدة بشكل خاص في التفريق بين التغيرات في التفاعلات بين الخلايا المناعية داخل بطانة الرحم بين النساء الخصبات والنساء اللواتي يجهضن المتكررة أثناء الزرع. تصف هذه الورقة بروتوكولا مفصلا لتلطيخ IHC الفلوري المتعدد الفلور للتحقيق في كثافة وتتجمع أربعة أنواع رئيسية من الخلايا المناعية في وقت واحد في عينات بطانة الرحم في الوقت المحدد بدقة أثناء زرع الجنين. تتضمن الطريقة إعداد العينة ، وتحسين تعدد المضاعفات مع علامات للأنواع الفرعية للخلايا المناعية ، ومسح الشرائح ، تليها تحليل البيانات ، مع إشارة محددة إلى الكشف عن الخلايا المناعية بطانة الرحم.

باستخدام هذه الطريقة، يمكن تحليل كثافة وتتجمع أربعة أنواع رئيسية من الخلايا المناعية في بطانة الرحم في وقت واحد في قسم واحد من الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك، ستناقش هذه الورقة العوامل الحرجة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها للتغلب على التداخل المحتمل للفلوروفور بين المسابير الفلورية التي يتم تطبيقها. والأهم من ذلك، يمكن أن تساعد نتائج تقنية تلطيخ متعددة المضاعفات هذه في توفير فهم متعمق للتفاعل المناعي والتنظيم أثناء زرع الجنين.

Introduction

يمكن تعريف الإجهاض المتكرر (RM) بأنه فقدان حملين أو أكثر قبل 24 أسبوعا من الحمل^1. هذه الحالة الإنجابية المتكررة تؤثر على ما يصل إلى 1٪ من الأزواج في جميع أنحاء العالم²^،³. الفيزيولوجيا المرضية متعددة العوامل ويمكن تقسيمها إلى أسباب مدفوعة جنينيا (ويرجع ذلك أساسا إلى النمط الكاريوتيبي الجنيني غير طبيعي) والأسباب المدفوعة الأمهات التي تؤثر على بطانة الرحم و / أو نمو المشيمة. يمكن أن ينتج هذا المظهر عن التشوهات الوراثية الأبوية ، شذوذ الرحم ، الظروف البروتيمبوتيكية ، عوامل الغدد الصماء ، والاضطرابات المناعية⁴.

في السنوات الأخيرة، وقد تورط ضعف الخلايا المناعية التأثير في الإمراض من فقدان الحمل المبكر⁵. وقد ألهم هذا العديد من التحقيقات في توضيح مجموعات محددة من الخلايا المناعية في بطانة الرحم خلال الدورة الشهرية، والزرع، والحمل المبكر، مع أدوار محددة في الحمل المبكر. من بين هذه الخلايا المناعية، تلعب خلايا القاتل الطبيعي الرحمي (uNK) دورا حاسما أثناء زرع الجنين والحمل، لا سيما في عمليات الغزو الأرومي الترموغي وتولد الأوعية^6. وقد أظهرت الدراسات زيادة كثافة خلايا UNK في بطانة الرحم للنساء مع RM 7^,⁸, على^الرغممن أن هذه النتيجة لم تكن مرتبطة بزيادة خطر الإجهاض⁹. ومع ذلك، حفز هذا البحث تقييم كثافة أنواع الخلايا المناعية الأخرى (مثل الضامة، والخلايا التغصن الرحمي) في بطانة الرحم في النساء مع RM¹⁰^،¹¹. ومع ذلك، فإنه لا يزال من غير المؤكد ما إذا كان هناك تغيير كبير في كثافة الخلايا المناعية في بطانة الرحم المحيطة بالزرع في النساء المصابات بجمهورية مقدونيا.

أحد التفسيرات المحتملة لعدم اليقين هو أن تقييم كثافة الخلايا المناعية بطانة الرحم قد يكون صعبا بسبب التغيرات السريعة في بطانة الرحم أثناء نافذة الزرع. خلال الإطار الزمني 24 ساعة, تغييرات كبيرة في بطانة الرحم تغيير كثافة الخلايا المناعية وإفراز السيتوكين, إدخال مصدر الاختلاف في هذه النتائج¹². وبالإضافة إلى ذلك، تعتمد معظم التقارير أساسا على استخدام تلطيخ خلية واحدة (مثل الطرق التقليدية للHHC) التي لا يمكن فحص علامات متعددة على نفس القسم الأنسجة. على الرغم من أن قياس التدفق الخلوي يمكن استخدامه للكشف عن مجموعات خلايا متعددة في عينة واحدة ، إلا أن الكميات الكبيرة من الخلايا المطلوبة والتحسين الذي يستغرق وقتا طويلا يعيق شعبية وكفاءة هذه الطريقة. وبالتالي ، فإن التقدم الأخير في تلطيخ IHC متعددة يمكن أن يحل هذه المشكلة عن طريق وضع علامات متعددة على نفس الشريحة لتقييم معلمات متعددة ، بما في ذلك نسب الخلايا والتوطين النسيجي للتجمعات الفرعية المناعية الفردية. وعلاوة على ذلك، يمكن لهذه التكنولوجيا تعظيم المعلومات التي تم الحصول عليها في حالة محدودية توافر الأنسجة. في نهاية المطاف، يمكن أن تساعد هذه التقنية في توضيح الاختلافات في تفاعلات الخلايا المناعية في بطانة الرحم بين النساء الخصبات والنساء المصابات بجمهورية مقدونيا.

وتم تعيين مجموعتين من النساء من مستشفى أمير ويلز، بما في ذلك نساء مراقبة الخصوبة ونساء أجهضن بشكل متكرر غير مبرر. وعرفت السيطرة على الخصوبة بأنها النساء اللاتي أنجبن ولادة حية واحدة على الأقل دون أي تاريخ من الإجهاض التلقائي، وعرفت نساء جمهورية مقدونيا بأنهن أولئك اللاتي سبقهن أن أجهضن ≥2 حالة متتالية قبل الأسبوع العشرين من الحمل. واستوفيت المواد من المجموعتين معايير الإدراج التالية: (أ) العمر بين 20 و 42 سنة، (ب) غير المدخن، (ج) الدورة الشهرية العادية (25-35 يوما) وبنية الرحم العادية، (د) عدم استخدام أي نظام هرموني لمدة 3 أشهر على الأقل قبل خزعة بطانة الرحم، (ه) عدم وجود هيدروسالبينك عن طريق الهستيرو-سالبينجوغرام. وبالإضافة إلى ذلك، كان جميع المواضيع المعينة karyotyping العادي، طبيعي 3 الأبعاد السونوغرافيا الفائقة hysterosalpingogram، اليوم 2 هرمون تحفيز الجريب < 10 وحدة دولية / لتر، البروجسترون منتصف luteal > 30 نانومول / لتر، وظيفة الغدة الدرقية العادية، واختبار سلبي للذئبة المضادة للتخثر ومضادات الإيغ ديسيلبين IgG وIgM.

لفهم أفضل لأساس المناعة من RM، سيكون من المرغوب فيه للغاية لتحديد وترجمة أنواع الخلايا المناعية الرئيسية الموجودة في بطانة الرحم في وقت الزرع في وقت واحد. تصف هذه الورقة البروتوكول بأكمله من إعداد العينة ، وتحسين تعدد المضاعفات مع علامات للأنواع الفرعية للخلايا المناعية ، ومسح الشرائح ، يليه تحليل البيانات مع إشارة محددة إلى الكشف عن الخلايا المناعية بطانة الرحم. وعلاوة على ذلك، تصف هذه الورقة كيفية تحديد كثافة وتتجمع أنواع الخلايا المناعية في وقت واحد في بطانة الرحم.

Protocol

وقد وافقت على الدراسة الجامعة الصينية المشتركة بين هونغ كونغ والأقاليم الجديدة لجنة أخلاقيات البحوث السريرية للمجموعة الشرقية. تم الحصول على موافقة مستنيرة من المشاركين قبل جمع خزعات بطانة الرحم. راجع قسم المقدمة لمعايير تضمين مجموعات التحكم و RM.

1. إعداد العينة

تأكد من أن جميع النساء في هذه الدراسة يخضعن لاختبار عصا تراجع البول اليومية من اليوم 9 من الدورة الشهرية فصاعدا لتحديد ارتفاع هرمون اللوتين (LH) للكشف عن الإباضة، والوقت خزعات بطانة الرحم على وجه التحديد في اليوم⁷ بعد ارتفاع LH (LH +7).
الحصول على 0.5 سم² جزء من خزعة بطانة الرحم باستخدام عينة Pipelle أو بايب ترياق من النساء الخصبات والنساء مع RM غير المبررة. تسمية الحاوية ووضع العينة على الفور في 10٪ محايدة العازلة الفورفورمين (درجة الحموضة 7) لتثبيت بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: يجب أن يكون حجم المثبت 5-10 أضعاف حجم الأنسجة.
ضع الأنسجة في خرطوشة للجفاف في آلة معالجة الأنسجة قبل تضمينها في شمع البارافين المنصهر. تضمين الأنسجة في البارافين في 58-60 درجة مئوية.
السماح للكتلة البارافين لتبرد بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. استخدام microtome لتقليم كتل البارافين إلى سمك 3 ميكرومتر.
ملاحظة: استخدام الماء المقطر الإيدز في تركيب الأنسجة السليم والالتزام في جميع أنحاء تلطيخ متعددة.
ضع شريط البارافين في حمام مائي عند 40-45 درجة مئوية لمدة 30 s.
قم بتركيب المقاطع على شرائح زجاجية مجهرية مغلفة ببولي-إل-ليسين (0.1٪ ث/v). ضع الشرائح مع الأنسجة التي تواجه صعودا والسماح لتجف في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. تخزين الشرائح في مربع الشرائح بعيدا عن درجات الحرارة القصوى حتى مزيد من الاستخدام.

2. تحديد التركيز المثالي للأجسام المضادة لتعدد IHC باستخدام IHC التقليدية.

ملاحظة: هذا مهم لتحديد مستوى التعبير ونمط كل علامة مناعية في عينة بطانة الرحم، وتحديد تسلسل تلطيخ كل علامة وكذلك تضخيم إشارة التيراميد المرتبطة بها (TSA) أزواج الفلوروفور.

اختبار الأجسام المضادة لملاءمتها لتعدد IHC باستخدام دليل IHC^{التقليدية 13}.
استخدم أنسجة بطانة الرحم لاختبار الأجسام المضادة المفردة.
قم بتضمين عنصر تحكم إيجابي (مثل الطحال) والتحكم السلبي (التحكم في النمط المتساوي) لتحسين حالة تلطيخ كل جهاز مضاد.
قم بإجراء التلطيخ باستخدام التخفيف الموصى به من قبل ورقة بيانات الأجسام المضادة.
إجراء تلطيخ إضافية باستخدام تركيزات فوق وتحت تخفيف الموصى بها المستخدمة في الخطوة 2.3.
ملاحظة: يجب على أخصائي علم الأمراض السريري تقييم الشرائح الملطخة بشكل أعمى لتأكيد توطين فحص الأجسام المضادة وسلامة الخلية.

3. طريقة تلطيخ متعددة

إعداد الشريحة والتثبيت
1. وضع الشرائح (من الخطوة 1.6) شقة مع الأنسجة التي تواجه صعودا في الفرن وخبز في 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل.
2. إزالة الشرائح من الفرن والسماح لهم لتبرد لمدة 20 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة قبل وضعها في رف الشريحة العمودية.
3. Dewax وإعادة ترطيب الفورمالين الثابتة ، والشرائح البارافين جزءا لا يتجزأ مع 10 دقيقة المخصصة لكل من الخطوات التالية : xylene (2x) ، 100 ٪ الايثانول (2x) ، 95 ٪ الايثانول (1x) ، 70 ٪ الايثانول (2x) ، والمياه المقطرة (2x).
4. ضع حامل الشرائح في صندوق شرائح بلاستيكي واغمرها في محلول ملحي مخزن ب Tris (TBS، درجة الحموضة 7.6).
  ملاحظة: يجب أن تظل الشرائح رطبة بدءا من خطوة الإماهة هذه حتى تتصاعد في الخطوة الأخيرة.
5. إصلاح العينات عن طريق غمر الشرائح في مربع الشريحة البلاستيكية مليئة خليط من الفورمالديهايد المخفف في الميثانول (1:9) لمدة 30 دقيقة في الظلام.
6. غسل الشرائح مرتين في الماء deionized لمدة 2 دقيقة ثم انتقل إلى مستضد استرجاع.
استرجاع Epitope
1. ضع حامل الشرائح في صندوق مقاوم للحرارة واملأه بحاجز حمض الستريك (درجة الحموضة 6.0) لتغطية الشرائح.
2. ضع الصندوق في الميكروويف، وسخن الشرائح لمدة 50 s في طاقة 100٪ تليها 20 دقيقة في 20٪ من الطاقة للحفاظ على نفس درجة الحرارة.
3. السماح للشرائح لتبرد لمدة 15 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة.
4. شطف الشرائح في الماء لمدة 2 دقيقة تليها TBS-توين 20 (TBST) لمدة 2 دقيقة.
  ملاحظة: TBST يتكون من 25 mM تريس-HCl (pH 7.5) و 150 mM NaCl و 0.05٪ توين 20 (v/v).
حظر
1. منع نشاط البيروكسيديز الذاتية في الأنسجة عن طريق غمر الشريحة على جرة تحتوي على محلول حجب البيروكسيداز (انظر جدول المواد)لمدة 10 دقائق.
2. اغسل الشرائح باستخدام TBST لمدة 5 دقائق.
3. استخدم قلم حاجز مسعور لوضع علامة على حدود حول قسم الأنسجة على الشريحة.
4. تغطية أقسام الأنسجة مع عازلة حجب (انظر جدول المواد)أو الألبومين مصل البقري (5٪، ث / الخامس)، واحتضان الشرائح في غرفة رطبة لمدة 15 دقيقة.
الأجسام المضادة وتطبيق الإشارة
1. إزالة الكواشف الحجب.
2. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية ذات الفائدة (على سبيل المثال، CD3، 1:100 تخفيف في مخفف الأجسام المضادة، انظر الجدول 1)في غرفة رطبة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
3. إزالة الأجسام المضادة الأساسية. اغسل 3x مع TBST لمدة 5 دقائق في كل مرة.
4. احتضان مع البوليمر الفجل peroxidase (HRP) المسمى الأجسام المضادة الثانوية (الجدول 1) لمدة 15 دقيقة في غرفة رطبة في درجة حرارة الغرفة. اغسل 3x مع TBST لمدة 5 دقائق في كل مرة.
5. تطبيق محلول العمل أوبال فلوروفور TSA (1:100 في التضخيم الذوبان) واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة للسماح اقتران الفلوروفوري لعينة الأنسجة في المواقع الأساسية ملزمة الأجسام المضادة. يغسل مع TBST في ثلاثة ملاعق لمدة 5 دقائق في كل مرة.
تجريد قائم على الميكروويف
1. شطف مع المخزن المؤقت استرداد مستضد (محلول العازلة سيترات، pH 6.0).
2. إجراء تجريد قائم على الميكروويف لإزالة مجمع HRP الثانوي الأولي لإدخال الأجسام المضادة الأولية التالية (على سبيل المثال، CD20).
3. ضع الشرائح في مخزن استرجاع المستضد ، وميكروويفها في طاقة 100٪ لمدة 50 s تليها طاقة 20٪ لمدة 20 دقيقة في حاويات آمنة بالميكروويف ، وتبريدها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
4. كرر الخطوات 3.2.4 إلى 3.5.2 حتى يتم فحص عينات الأنسجة مع جميع الأجسام المضادة الأولية.
مكافحةوstain وتصاعد
1. بعد تجريد الميكروويف والتبريد من العازلة استرجاع مستضد، شطف الشرائح في الماء المقطر وTBST.
2. احتضان مع 4'، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) حل (1.0 ميكروغرام / مل) لمدة 5 دقائق في غرفة رطبة في درجة حرارة الغرفة.
3. اغسل 3x مع TBST لمدة 5 دقائق في كل مرة. يغسل بالماء مرة واحدة لمدة 5 دقائق.
4. الهواء الجاف الشريحة وجبل مع المتوسطة تركيب المناسبة (انظر جدول المواد).
  ملاحظة: لن تكون مطلوبة مكافحة الاحتواء لشرائح أحادية اللون لاستخدامها لتطوير مكتبة الطيفية.

4. الصورة والتحليل

إعداد شرائح المكتبة الطيفية
1. إنشاء شرائح المكتبة (صور مرجعية أحادية البقعة) لكل مضان، DAPI، وفلورسينس التلقائي مع نفس نسيج التحكم لتحليل الصور متعددة الأطياف.
2. باستخدام الشرائح من عينات خزعة بطانة الرحم من النساء مع جمهورية مقدونيا والنساء الخصبة، وتنفيذ الخطوات 1.1 إلى 3.6.4 للكشف عن الأجسام المضادة واحد لكل شريحة (دون مزيد من الأجسام المضادة أو إضافة الفلوروفور).
3. لكل اكتشاف الأجسام المضادة، وصمة عار واحدة من الشرائح مع DAPI (كما هو الحال في الخطوة 3.6.2) وترك شريحة واحدة غير ملطخة للكشف عن أي أنسجة ممكنة السيارات مضان في الطيف.
4. استخدم عوامل التصفية المناسبة في محطة العمل للحصول على صورة لهذه المجموعة من الشرائح لكل جهاز مضاد وتحميلها في مكتبة تحليل الصور (كما هو موضح في الخطوة 4.2).
5. بمجرد التقاط الصورة، حدد inForm كمصدر مكتبة طيفية وبناء المكتبة الطيفية.
6. كما يتم استخدام الفلوروفوريس، حدد البقع / الفلور... من القائمة.
7. أثناء اختيار البقع أو الفلوروفوريس، قم بتضييق الخيارات عن طريق اختيار مجموعة واحدة أو أكثر. حدد الكل لإظهار جميع الأطياف المتوافقة مع الصور.
التصوير الطيفي
ملاحظة: تم التقاط الصور باستخدام محطة عمل Mantra مع مكتبة طيفية تم إنشاؤها باستخدام برنامج inForm Image Analysis.
1. التقط صورة الشرائح ذات اللون الواحد الملون بالأجسام المضادة باستخدام مرشحات الفلورسينس المناسبة كما هو مقترح في الجدول 2 (على سبيل المثال، DAPI وفلوريسسين إيزوثيوسيانات [FITC] وCY3 وتكساس ريد وCY5) باستخدام محطة العمل.
  ملاحظة: يتم عرض الفلاتر الموصى بها للفلوروفوريس المحدد المستخدم في هذا البروتوكول في الجدول 2.
2. تحديد وقت التعرض المناسب للإشارة المثلى من خلال فحص كل علامة في قناة الفلورسينس المقابلة لها.
  ملاحظة: يتم تحديد الإشارة المثلى وفقا للرجوع إلى الإيجابية والتوطين التي تم الحصول عليها في تلطيخ الأجسام المضادة المفردة.
3. تحديد وقت التعرض الثابت لكل تحليل (تركيبة الفلوروفور المضادة) لتوحيد المقارنة بين العينة.
  ملاحظة: يعتمد تحديد التعرض الثابت على كثافة عينة المصالح.
4. مسح الشرائح الملون متعددة في وضع المسح الضوئي المناسب باستخدام خوارزمية التركيز البؤري التلقائي المضمنة.
  ملاحظة: ستستخدم المكتبة الطيفية المنشأة لتمييز مكعب الصور متعدد الأطياف إلى مكونات فردية واحدة (الطيز الطيفي). وهذا من شأنه أن يسمح بمعالجة التعريف المستند إلى اللون لجميع العلامات ذات الأهمية باستخدام الخطوتين الرئيسيتين التاليتين: دورة تدريبية وجلسة تحليل للصور.
تحليل الصور
1. عد الخلايا لأنواع مختارة من الخلايا المناعية في بطانة الرحم
2. التقاط ما لا يقل عن 10 حقول للتحليل تحت التكبير 200x.
  ملاحظة: تم التقاط الحقول بواسطة مسح المقطع بأكمله دون أي تحديد. وهذا يمكن أن يضمن التقاط المتزامنة لجميع مكونات الخلية من بطانة الرحم, على سبيل المثال, الحدود الظهارية مضيئة, ستروما, والغدد.
3. لحساب الخلايا، انقر فوق الزر عدد الكائنات في شريط الخطوات لعرض لوحة إعدادات عد الكائنات.
4. تحقق من المربع تجاهل الكائن إذا لمس حافة لاستبعاد أي كائنات لمس حافة الصورة أو منطقة العملية أو منطقة الأنسجة.
5. إذا تم تقسيم الأنسجة، حدد فئة الأنسجة التي توجد فيها الكائنات. لا تحسب الكائنات خارج فئة الأنسجة المحددة.
6. حدد النهج المطلوب لتعريف الكائنات: كائن-يستند أو بكسل-أساس (عتبة).
  ملاحظة: يجب تحديد نهج المستندة إلى بكسل (عتبة) في حالة وصمة عار موثوقة أو متناسقة لتطبيق عتبة بسيطة سوف تسفر عن بكسل الكائن. يوصى بالنهج القائم على الكائن عندما تكون هناك حاجة إلى نهج أكثر تقدما تستند إلى علم المورفوميتريا في حالة عدم الاتساق وخصوصية تلطيخ الكائنات.
7. حدد تحجيم الإشارةالمطلوب: مقياس تلقائي أو مقياس ثابت.
  ملاحظة: سيؤدي اختيار المقياس التلقائي إلى التحجيم التلقائي لكل مستوى مكون قبل إجراء تجزئة الكائن. يوصى بخيار المقياس الثابت عند الحاجة إلى أداء تجزئة أفضل، كما أن إشارات البقع متسقة وموثوقة.
8. حدد المكون الأساسي لتقسيم الكائن من القائمة المنسدلة.
9. ضبط قيمة الإشارة الدنيا للمكون الأساسي إلى قيمة العتبة المطلوبة.
10. لملء الثقوب تلقائيا في الكائنات، حدد ملء الثقوب.
11. للكشف عن الكائنات التي تلمس كائنات أخرى ككائنات فردية، بدلا من كائن واحد، حدد خانة الاختيار تحسين التقسيم بعد تحديد خانة الاختيار الحد الأقصى للحجم (بكسل).
12. لاستبعاد الكائنات استنادا إلى استدارة الكائن، تحقق من المربع Roundness وحدد الحد الأدنىالمطلوب من التعميم .
13. عد جميع الخلايا السترومالية (CD3^-/ CD20^-/ CD68^-/ CD56^-، وDAPI⁺) ، بما في ذلك الخلايا المحيطة بالأوعية الدموية.
14. عد الخلايا المناعية بشكل منفصل، بما في ذلك الخلايا التائية (CD3⁺ و DAPI⁺)، الخلايا B (CD20⁺ و DAPI⁺)، الضامة (CD68⁺ و DAPI⁺)، وخلايا UNK (CD56⁺ و DAPI⁺).
15. التعبير عن البيانات كنسب مئوية من الخلايا المناعية بالنسبة إلى العدد الإجمالي للخلايا سترومال لكل صورة تم التقاطها، والإبلاغ عن عدد الخلايا النهائي كمتوسط لجميع المجالات.
16. استخدم محرر طريقة العرض لعرض معالجة ترحيل جداول البيانات الناتجة. تصدير جدول "بيانات العد".
17. القياس الكمي للتوزيع المكاني للخلايا المناعية بطانة الرحم
18. تحت التكبير 200x، وتقدير وظيفة L باستخدام برنامج R لنطاق من 0-20 ميكرومتر تعتبر اتصال الخلية الخلية القصوى المسافة¹⁴.
  ملاحظة: تم استخدام مربع أدوات اللغة R 'spatstat' لقياس الدالة L.
  1. تشير إلى مستوى تجمع أزواج مختلفة من الخلايا المناعية على أساس المنطقة تحت منحنى (AUC) من وظيفة L بهم.

النتائج

تظهر العملية التخطيطية الشاملة لإجراء فحص متعدد الألوان من 4 ألوان للكشف عن 4 أنواع من الخلايا المناعية بطانة الرحم في الشكل 1. باختصار، يتطلب بروتوكول تلطيخ المناعة المتعدد هذا 8 خطوات رئيسية: 1. إعداد الشريحة، 2. استرجاع Epitope، 3. الحجب، 4. تطبيق الأجسام المضادة الأولية، 5. تطبي...

Discussion

الخطوات الهامة داخل البروتوكول
من المهم ملاحظة أن تلطيخ متعددة يتطلب التحسين الدؤوب. يتطلب استرجاع المستضد ، باستخدام تقنية التخزين المؤقت والميكروويف ، التحسين لضمان تجريد الأجسام المضادة الكاملة والحفاظ على صلاحية الأنسجة. كما الكواشف TSA ربط بشكل متناقض إلى المواقع المحيطة...

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما تضارب في المصالح يكشفان عنه.

Acknowledgements

وقد دعم هذه الدراسة الصندوق الاستئماني لأمراض النساء والتوليد في هونغ كونغ في عام 2018 وصندوق هونغ كونغ للصحة والبحوث الطبية (06170186، 07180226).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplification Diluent	Perkin Elmer	FP1498	Fluorophore diluent buffer
Antibody diluent	Perkin Elmer	ARD1001EA	Diluting the antibody
CD3	Spring Bioscience	M3072	Primary antibody
CD20	Biocare Medical	CM004B	Primary antibody
CD56	Leica	NCL-CD56-504	Primary antibody
CD68	Spring Bioscience	M5510	Primary antibody
Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x)	Abcam	AB64214	Antigen retrieval solution
EMSURE Xylene (isomeric mixture)	Merck	108297	Dewaxing
Ethanol absolute	Merck	107017	Ethyl alcohol for rehydration
HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome	Leica	RM2125RTS	Sectioning of paraffin-embedded tissue
inForm Advanced Image Analysis Software	Perkin Elmer	inForm^® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0)	Data Analysis software
Mantra^® Workstation	Akoya Biosciences	CLS140089	Spectral imaging
Microwave	Panasonic	Inverter	Microwave stripping
Opal 520	Perkin Elmer	FP1487A	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal 620	Perkin Elmer	FP1495A	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal 650	Perkin Elmer	FP1496A	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal 690	Perkin Elmer	FP1497A	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Oven	Memmert	U10	Dewaxing
Peroxidase Blocking Solution	DAKO	S2023	Removal of tissue peroxidase activities
Poly-L-lysine coated slide	FISHER SCIENTIFIC	120-550-15	Slide for routine histological use
PolyHRP Broad Spectrum	Perkin Elmer	ARH1001EA	Secondary antibody
ProLong™ Gold Antifade Mountant	ThemoFisher Scientific	P36930	Mounting
Spatstat	/	Version 2.1-0	Spatial point pattern analysis
Spectral DAPI	Perkin Elmer	FP1490A	Nucleic acid staining
Tissue Processor	Thermo Fischer	Excelsior ES	Tissue processing for dehydration and paraffination
Tris Buffer Saline (TBS), 10x	Cell Signaling Technology	12498S	Washing solution
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1370-1L	Nonionic detergent

References

ESHRE Guideline Group on RPL et al. ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss. Human Reproduction Open. 2018 (2), 004 (2018).
Stirrat, G. M. Recurrent miscarriage. Lancet. 336 (8716), 673-675 (1990).
Rai, R., Regan, L. Recurrent miscarriage. Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).
Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage. Green-top Guideline No. 17. Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. , (2011).
King, A. Uterine leukocytes and decidualization. Human Reproduction Update. 6 (1), 28-36 (2000).
Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. Human NK cells in pregnant uterus: why there. American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).
Lash, G. E., et al. Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure. Journal of Reproductive Immunology. 116, 50-59 (2016).
Yang, Y., et al. HOXA-10 and E-cadherin expression in the endometrium of women with recurrent implantation failure and recurrent miscarriage. Fertility and Sterility. 107 (1), 136-143 (2017).
Tuckerman, E., Laird, S. M., Prakash, A., Li, T. C. Prognostic value of the measurement of uterine natural killer cells in the endometrium of women with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 22 (8), 2208-2213 (2007).
Jasper, M. J., et al. Macrophage-derived LIF and IL1B regulate alpha(1,2)fucosyltransferase 2 (Fut2) expression in mouse uterine epithelial cells during early pregnancy. Biology of Reproduction. 84 (1), 179-188 (2011).
Kopcow, H. D., et al. T cell apoptosis at the maternal-fetal interface in early human pregnancy, involvement of galectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18472-18477 (2008).
Johnson, P. M., Christmas, S. E., Vince, G. S. Immunological aspects of implantation and implantation failure. Human Reproduction. 14, 26-36 (1999).
Hong, G., et al. Multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58711 (2019).
Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
Zhao, Y., et al. The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

174

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: