Tekrarlayan Düşükte Dört Endometriyal İmmün Hücre Tipinin Çok Yönlü Floresan İmmünohistokimyasal Boyanması

Özet

Multipleks immünhistokimya ve multispektral görüntülemedeki gelişmelere rağmen, endometriyumda aynı anda majör immün hücrelerin yoğunluğunu ve kümelenişini karakterize etmek bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu makalede, endometriyumdaki dört immün hücre tipinin eşzamanlı lokalizasyonu için ayrıntılı bir multipleks boyama protokolü ve görüntüleme açıklanmaktadır.

Özet

İmmünohistokimizma, biyolojik araştırma ve klinik tanılarda doku antijenlerinin tanımlanması ve görselleştirilmesinde en sık kullanılan yöntemdir. Yara iyileşmesi, immün yanıt, doku reddi ve doku-biyomalzeme etkileşimleri gibi çeşitli biyolojik süreçleri veya patolojileri karakterize etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, konvansiyonel immünohistokimyasal (IHC) boyama kullanılarak tek bir doku bölümünde birden fazla antijenin (özellikle bağışıklık hücreleri için) görselleştirilmesi ve nicelemesi tatmin edici değildir. Bu nedenle, son yıllarda tek bir doku örneğinde veya farklı doku örneklerinden oluşan bir toplulukta birden fazla biyolojik belirteci tanımlamak için çoklayıcı teknolojiler tanıtıldı.

Bu teknolojiler özellikle implantasyon sırasında tekrarlayan düşükleri olan doğurgan kadınlar ve kadınlar arasında endometriyum içindeki bağışıklık hücresi-hücre etkileşimlerindeki değişiklikleri ayırt etmede yararlı olabilir. Bu makalede, embriyo implantasyonu sırasında tam olarak zamanlanmış endometriyal örneklerde aynı anda dört ana immün hücre tipinin yoğunluğunu ve kümelenmeyi araştırmak için çok faktörlü floresan IHC boyama için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Yöntem, örnek hazırlama, immün hücre alt tipleri için belirteçlerle multipleks optimizasyonu ve endometriyal bağışıklık hücrelerinin tespit edilmesine özel referansla slaytların taranmasını ve ardından veri analizini içerir.

Bu yöntem kullanılarak, endometriyumdaki dört ana immün hücre tipinin yoğunluğu ve kümelenmesi aynı anda tek bir doku bölümünde analiz edilebilir. Buna ek olarak, bu makalede, uygulanan floresan problar arasındaki olası florofor parazitinin üstesinden gelmek için kritik faktörler ve sorun giderme tartışılacaktır. Daha da önemlisi, bu multipleks boyama tekniğinden elde edilen sonuçlar, embriyo implantasyonu sırasında immünolojik etkileşimin ve regülasyonun derinlemesine anlaşılmasına yardımcı olabilir.

Giriş

Tekrarlayan düşük (RM), 24 haftalık gebelik^1'denönce iki veya daha fazla gebenin kaybı olarak tanımlanabilir. Bu sık üreme durumu dünya çapında çiftlerin% 1'ini etkiler^2,3. Patofizyoloji multifaktöriyeldir ve embriyolojik olarak yönlendirilen nedenlere (esas olarak anormal embriyonik karyotip nedeniyle) ve endometrium ve/veya plasenta gelişimini etkileyen doğum odaklı nedenlere ayrılabilir. Bu tezahür ebeveyn genetik anormallikleri, rahim anomalileri, protropombotik durumlar, endokrinoloji faktörleri ve immünolojik bozukluklardan kaynaklanabilir⁴.

Son yıllarda, immün efektör hücre disfonksiyonu erken gebelik kaybının patogenezine bulaşmıştır⁵. Bu, adet döngüsü, implantasyon ve erken gebelik sırasında endometriyumdaki spesifik bağışıklık hücrelerinin popülasyonlarını, erken gebelikte belirli rollerle aydınlatıcı birçok araştırmaya ilham vermiştir. Bu bağışıklık hücreleri arasında, uterus doğal öldürücü (uNK) hücreler embriyo implantasyonu ve gebelik sırasında, özellikle trofoblastik invazyon ve anjiogenez süreçlerinde kritik bir rol oynar⁶. Çalışmalar RM^7,8ile kadınların endometriumunda artan bir uNK hücre yoğunluğu göstermiştir , ancak bu bulgu düşük riskinin artmasıyla ilişkili değildi⁹. Bununla birlikte, bu RM^10,11olan kadınlarda endometriyumdaki diğer bağışıklık hücresi türlerinin (makrofajlar, uterus dendritik hücreler gibi) yoğunluğunu değerlendiren araştırmayı teşvik etti. Bununla birlikte, RM'li kadınlarda peri implantasyon endometriyumunda bağışıklık hücre yoğunluğunda önemli bir değişiklik olup olmadığı belirsizliğini korumaktadır.

Belirsizliğin olası bir açıklaması, implantasyon penceresi sırasında endometriyumdaki hızlı değişiklikler nedeniyle endometriyal immün hücre yoğunluğunun değerlendirilmesinin zor olabileceğidir. 24 saat boyunca, endometriyumdaki önemli değişiklikler bağışıklık hücre yoğunluğunu ve sitokin salgısını değiştirir ve bu sonuçlarda bir varyasyon kaynağı¹². Buna ek olarak, çoğu rapor esas olarak aynı doku bölümündeki birden fazla belirteci inceleyemeyen tek hücreli boyamanın (örneğin geleneksel IHC yöntemleri) kullanımına dayanır. Akış sitometrisi tek bir örnekte birden fazla hücre popülasyonunu tespit etmek için kullanılabilse de, gerekli olan büyük miktarda hücre ve zaman alıcı optimizasyon bu yöntemin popülaritesini ve verimliliğini engeller. Bu nedenle, multipleks IHC boyamadaki son gelişme, hücre soyu ve bireysel immün subpopulasyonların histolojik lokalizasyonu da dahil olmak üzere birden fazla parametreyi değerlendirmek için aynı slayttaki birden fazla belirteci immünostaining yaparak bu sorunu çözebilir. Ayrıca, bu teknoloji sınırlı doku kullanılabilirliği durumunda elde edilen bilgileri en üst düzeye çıkarabilir. Sonuçta, bu teknik, doğurgan kadınlar ve RM'li kadınlar arasındaki endometriyumdaki bağışıklık hücresi etkileşimlerindeki farklılıkların aydınlatıcı olmasına yardımcı olabilir.

Prince of Wales Hastanesi'nden doğurgan kontrol kadınları (FC) ve açıklanamayan tekrarlayan düşük (RM) olan kadınlar da dahil olmak üzere iki grup kadın işe alındı. Doğurganlık kontrolü, spontan düşük öyküsü olmadan en az bir canlı doğum yapan kadınlar, RM kadınları ise 20 haftalık gebelikten önce art arda ≥2 düşük öyküsü olanlar olarak tanımlandı. İki gruptan denekler aşağıdaki dahil etme kriterlerini karşılar: (a) 20 ila 42 yaş arası yaş, (b) sigara içmeyen, (c) düzenli adet döngüsü (25-35 gün) ve normal rahim yapısı, (d) Endometriyal biyopsiden önce en az 3 ay hormonal rejim kullanılmaması, (e) histerik-salpingogram ile hidrosalpinks kullanılmaması. Buna ek olarak, işe alınan tüm deneklerde normal karyotiping, normal 3 boyutlu ultrasonografi histerikalpingogram, 2. gün folikül uyarıcı hormon < 10 IU/L, orta luteal progesteron > 30 nmol/L, normal tiroid fonksiyonu vardı ve lupus antikoagülan ve antikardiyolinilin IgG ve IgM antikorları için negatif test edildi.

RM'nin immünolojik temelini daha iyi anlamak için, implantasyon sırasında endometriyumda bulunan başlıca immün hücre tiplerinin aynı anda ölçülmesi ve lokalize edilmesi en çok arzu edilir. Bu makalede, numune hazırlamadan tüm protokol, bağışıklık hücresi alt tipleri için belirteçlerle çoklama optimizasyonu ve slaytların taranmasının ardından endometriyal bağışıklık hücrelerinin tespitine özel referanslı veri analizi açıklanmaktadır. Ayrıca, bu makalede endometriyumda aynı anda bağışıklık hücre tiplerinin yoğunluğunun ve kümelenmesi nasıl belirlenecektir.

Protokol

Çalışma, Hong Kong Ortak Çin Üniversitesi-Yeni Bölgeler Doğu Kümesi Klinik Araştırma Etik Komitesi tarafından onaylandı. Endometriyal biyopsiler toplanmadan önce katılımcılardan bilgilendirilmiş onam alındı. Denetim ve RM gruplarının dahil edilme ölçütleri için giriş bölümüne bakın.

1. Numune hazırlama

1. Bu çalışmadaki tüm kadınların yumurtlamayı tespit etmek için luteinize edici hormon (LH) dalgalanmasını tanımlamak için adet döngüsünün 9. gününden itibaren günlük idrar dipstick testinden geçmesini sağlayın ve endometriyal biyopsileri LH dalgalanmasından sonraki^7.
2. Açıklanamayan RM'li doğurgan kadınlardan ve kadınlardan Pipelle örnekleyici veya Pipet Curet kullanarak^0,5 cm 2 endometriyal biyopsi parçası elde edin.
   NOT: Fiksatifin hacmi dokudan 5-10 kat daha fazla olmalıdır.
3. Erimiş parafin balmumuna gömmeden önce, dokuyu bir doku işleme makinesine dehidrasyon için bir kartuşa yerleştirin. Dokuları 58-60 ° C'de parafin içine gömün.
4. Parafin bloğunun oda sıcaklığında gece boyunca soğumasını bekleyin. Parafin bloklarını 3 μm kalınlıkte kırpmak için bir mikrotom kullanın.
   NOT: Damıtılmış su kullanımı, çoklama lekeleme boyunca uygun doku montajında ve yapışmada yardımcı olur.
5. Parafin kurdelesini 30 sn boyunca 40-45 °C'de bir su banyosuna yerleştirin.
6. Bölümleri poli-L-lizin (%0,1 w/v) kaplı mikroskop cam slaytlara monte edin. Slaytları doku yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve gece boyunca 37 °C'de kurumaya bırakın. Slaytları bir slayt kutusunda aşırı sıcaklıklardan uzak bir şekilde bir sonraki kullanıma kadar saklayın.

2. Geleneksel IHC kullanarak multipleks IHC için ideal antikor konsantrasyonunun belirlenmesi.

NOT: Bu, endometrium örneğindeki her bir immün belirtecin ifade düzeyini ve desenini tanımlamak ve her bir belirtecin boyama sırasını ve ilişkili tyramide sinyal amplifikasyonunu (TSA) florofor eşleşmelerini belirlemek için önemlidir.

1. Manuel konvansiyonel IHC¹³kullanarak antikorları multipleks IHC'ye uygunlukları için test edin.
2. Tek antikor testi için endometrium dokuları kullanın.
3. Her antikorun boyama durumunu optimize etmek için pozitif bir kontrol (örneğin dalak) ve negatif kontrol (izotip kontrolü) ekleyin.
4. Antikorun veri sayfası tarafından önerilen seyreltme kullanarak boyamayı gerçekleştirin.
5. 2.3. adımda kullanılan önerilen seyreltmenin üstündeki ve altındaki konsantrasyonları kullanarak ek boyama gerçekleştirin.
   NOT: Bir klinik patolog, antikor problama ve hücresel bütünlüğün lokalizasyonunu doğrulamak için lekeli slaytları körü körüne değerlendirmelidir.

3. Multipleks boyama yöntemi

1. Slayt hazırlama ve sabitleme
   1. Slaytları (adım 1.6'dan itibaren) dokuyu bir fırına bakacak şekilde düzleştirin ve en az 1 saat boyunca 60 °C'de pişirin.
   2. Slaytları fırından çıkarın ve dikey bir slayt rafı içine yerleştirmeden önce oda sıcaklığında en az 20 dakika soğumalarını bekleyin.
   3. Formalin sabitlenmiş, parafin gömülü slaytları aşağıdaki adımların her birine 10 dakika tahsis ederek dewax ve rehidratlayın: ksilen (2x), % 100 etanol (2x), % 95 etanol (1x), % 70 etanol (2x) ve damıtılmış su (2x).
   4. Slayt rafını plastik bir slayt kutusuna yerleştirin ve Tris arabelleğe alınmış saline batırın (TBS, pH 7.6).
      NOT: Slaytlar, bu rehidrasyon adımından başlayarak son adımda monte edilene kadar nemli kalmalıdır.
   5. Slaytları karanlıkta 30 dakika boyunca metanol (1:9) ile seyreltilmiş formaldehit karışımı ile dolu plastik bir slayt kutusuna batırarak örnekleri düzeltin.
   6. Slaytları deiyonize suda iki kez 2 dakika yıkayın ve ardından antijen alımına devam edin.
2. Epitop alma
   1. Slayt rafını ısıya dayanıklı bir kutuya yerleştirin ve slaytları örtmek için sitrik asit tamponu (pH 6.0) ile doldurun.
   2. Kutuyu mikrodalga fırına yerleştirin ve aynı sıcaklığı korumak için slaytları % 100 güçte 50 sn ve ardından% 20 güçte 20 dakika ısıtın.
   3. Slaytların oda sıcaklığında yaklaşık 15 dakika soğumasını bekleyin.
   4. Slaytları 2 dakika suda durulayın ve ardından TBS-Tween 20 (TBST) 2 dakika boyunca durulayın.
      NOT: TBST, 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl ve% 0.05 Ara 20'den (v/v) oluşur.
3. Engelleme
   1. Slaytı peroksidaz bloke çözeltisi içeren bir kavanoza batırarak dokudaki endojen peroksidaz aktivitesini engelleyin (Malzeme Tablosunabakınız) 10 dakika boyunca.
   2. Slaytları TBST ile 5 dakika yıkayın.
   3. Slayttaki doku bölümünün etrafındaki bir sınırı işaretlemek için hidrofobik bir bariyer kalemi kullanın.
   4. Doku bölümlerini bir bloke tamponu (bkz. Malzeme Tablosu)veya sığır serum albümini (%5, w/v) ile örtün ve slaytları nemli bir odada 15 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
4. Antikor ve sinyal uygulaması
   1. Engelleme reaktiflerini çıkarın.
   2. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada birincil ilgi antikoru (örneğin, CD3, antikor seyreltmede 1:100seyreltme, bkz. Tablo 1) ile kuluçkaya yatın.
   3. Birincil antikoru çıkarın. Her seferinde 5 dakika BOYUNCA TBST ile 3x yıkayın.
   4. Oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada15dakika boyunca polimer yaban turpu peroksidaz (HRP) etiketli ikincil antikor ( Tablo 1 ) ile kuluçkaya yatırın. Her seferinde 5 dakika BOYUNCA TBST ile 3x yıkayın.
   5. Opal florofor TSA çalışma solüsyonunu (amplifikasyon seyrelticide 1:100) uygulayın ve birincil antikor bağlama bölgelerinde doku örneğine florofor konjugasyonu sağlamak için oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatın. TBST ile her seferinde 5 dakika üç taraflı yıkayın.
5. Mikrodalga bazlı sıyırma
   1. Antijen alma tamponu ile durulayın (sitrat tampon çözeltisi, pH 6.0).
   2. Bir sonraki birincil antikoru (örneğin, CD20) tanıtmak için birincil-ikincil-HRP kompleksini çıkarmak için mikrodalga bazlı sıyırma gerçekleştirin.
   3. Slaytları antijen alma tampona yerleştirin, 50 s için% 100 güçte mikrodalgalayın ve mikrodalga güvenli kaplarda 20 dakika boyunca% 20 güçte pişirin ve oda sıcaklığında 15 dakika soğutun.
   4. Doku örnekleri tüm birincil antikorlarla araştırılana kadar 3.2.4 ile 3.5.2 adımlarını tekrarlayın.
6. Sayaçlar ve montaj
   1. Mikrodalga bazlı sıyırma ve antijen alma tamponunun soğutulması sonrasında, slaytları damıtılmış suda ve TBST'de durulayın.
   2. Oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada 5 dakika boyunca 4', 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) çözeltisi (1,0 μg/mL) ile kuluçkaya yaslayın.
   3. Her seferinde 5 dakika BOYUNCA TBST ile 3x yıkayın. 5 dakika boyunca bir kez suyla yıkayın.
   4. Kaydırağı havayla kurulayın ve uygun montaj ortamıyla monte edin (Bkz. Malzeme Tablosu).
      NOT: Spektral kitaplık geliştirme için kullanılacak çift yönlü slaytlar için karşı koyma gerekmez.

4. Görüntü ve analiz

1. Spektral kütüphane slaytlarının hazırlanması
   1. Multispektral görüntü analizi için aynı kontrol dokusuna sahip her florofor, DAPI ve otomatik floresan için kitaplık slaytları (tek lekeli referans görüntüleri) oluşturun.
   2. RM'li ve doğurgan kadınlardan alınan endometriyal biyopsi örneklerinin slaytlarını kullanarak, her slayt için tek antikor tespiti için 1.1 ila 3.6.4 adımlarını gerçekleştirin (daha fazla antikor veya florofor ilavesi olmadan).
   3. Her antikor tespiti için, slaytlardan birini DAPI ile lekeleyin (adım 3.6.2'de olduğu gibi) ve spektrumdaki olası doku otomatik floresanlarının tespiti için bir slaytı lekesiz bırakın.
   4. Her antikor için bu slayt kümesinin görüntüsünü elde etmek ve bunları görüntü analizi kitaplığına yüklemek için iş istasyonundaki uygun filtreleri kullanın (adım 4.2'de açıklandığı gibi).
   5. Görüntü yakalandıktan sonra, Spectral Kitaplığı Kaynağı olarak InForm'u seçin ve spektral kitaplığı oluşturun.
   6. Floroforlar kullanılırken, menüden Lekeler/Florlar... öğesini seçin.
   7. Lekeleri veya floroforları seçerken, bir veya daha fazla Grup seçerek seçenekleri daraltın. Görüntülerle uyumlu tüm spektrumları göstermek için Tümü'yü seçin.
2. Spektral görüntüleme
   NOT: Görüntüler, inForm Image Analysis yazılımı kullanılarak kurulan spektral kütüphane ile Mantra İş İstasyonu kullanılarak yakalandı.
   1. İş istasyonunu kullanarak Tablo 2'de (örneğin, DAPI, floresan izotiyosiyanat [FITC], CY3, Texas Red ve CY5) önerildiği gibi uygun epi-floresan filtrelerle tek antikor lekeli slaytların görüntüsünü yakalayın.
      NOT: Bu protokolde kullanılan belirli floroforlar için önerilen filtreler Tablo 2'de gösterilmiştir.
   2. İlgili floresan kanalındaki her bir işaretleyiciyi inceleyerek optimum sinyal için uygun bir pozlama süresi belirleyin.
      NOT: Tek antikor lekelemede elde edilen pozitiflik ve lokalizasyon referanslarına göre en uygun sinyal belirlenir.
   3. Çapraz numune karşılaştırmasını standartlaştırmak için her bir anallit (antikor-florofor kombinasyonu) için sabit bir maruz kalma süresi belirleyin.
      NOT: Sabit pozlamanın belirlenmesi, ilgi alanlarının örneğindeki yoğunluğa bağlıdır.
   4. Katıştırılmış otomatik netleme algoritması ile çoklamalı lekeli slaytları uygun tarama modunda tarayın.
      NOT: Kurulan spektral kütüphane, multispektral görüntü küpünü tek tek bileşenlere (spektral karıştırma) ayırt etmek için kullanılır. Bu, tüm ilgi çekici işaretler için renk tabanlı tanımlamanın aşağıdaki iki ana adım kullanılarak işlenmesine izin verir: eğitim oturumu ve görüntü analizi oturumu.
3. Görüntü analizi
   1. Endometriyumda seçilen immün hücre tiplerinin hücre sayımı
   2. 200x büyütme altında analiz için en az 10 alan yakalayın.
      NOT: Alanlar herhangi bir seçim yapılmadan tüm bölüm taranarak yakalandı. Bu, endometriumun tüm hücre bileşenlerinin, örneğin ışıksal epitel kenarlığının, stromanın ve bezlerin aynı anda yakalanmasını sağlayabilir.
   3. Hücreleri saymak için, Nesne Sayma Ayarları panelini görüntülemek üzere adım çubuğundaki Nesneleri Say düğmesini tıklatın.
   4. Görüntünün, işlem bölgesinin veya doku bölgesinin kenarına dokunan nesnelerin dışlanması için Kenara Dokunuyorsa Nesneyi At kutusunu işaretleyin.
   5. Doku parçalanmışsa, nesnelerin bulunacağı Doku Kategorisi'ni seçin. Seçili doku kategorisinin dışındaki nesneleri sayma.
   6. Nesneleri tanımlamak için istediğiniz Yaklaşımı seçin: Nesne Tabanlı veya Piksel Tabanlı (Eşik).
      NOT: Basit bir eşik uygulamasının nesne piksellerini vereceği güvenilir veya tutarlı bir leke olması durumunda Piksel Tabanlı (Eşik) yaklaşım seçilmelidir. Nesnelerin tutarlılığı ve özgüllüğü olmaması durumunda daha gelişmiş morfometri tabanlı yaklaşımlar gerektiğinde Nesne Tabanlı yaklaşım önerilir.
   7. İstediğiniz Sinyal Ölçeklendirme : Otomatik Ölçekleme veya Sabit Ölçek'i seçin.
      NOT: Otomatik Ölçek'in seçilmesi, nesne segmentasyonunu gerçekleştirmeden önce her bileşen düzleminin otomatik olarak ölçeklendirmesine neden olur. Daha iyi segmentasyon performansı gerektiğinde ve leke sinyalleri tutarlı ve güvenilir olduğunda Sabit Ölçek seçeneği önerilir.
   8. Açılan listeden nesne segmentasyonu için Birincil bileşeni seçin.
   9. Birincil bileşen için Minimum Sinyal değerini istenen eşik değerine ayarlayın.
   10. Nesnelerdeki delikleri otomatik olarak doldurmak için Delikleri Doldur 'useçin.
   11. Diğer nesnelere dokunan nesneleri tek bir nesne olarak değil, tek bir nesne olarak algılamak için, En Büyük Boyut (piksel) onay kutusunu seçtikten sonra Bölmeyi İyileştir onay kutusunu seçin.
   12. Nesnenin yuvarlaklığına göre nesneleri dışlamak için Yuvarlaklık kutusunu işaretleyin ve istediğiniz Minimum Döngüselliğibelirtin.
   13. Kan damarlarını çevreleyen hücrelerde dahil olmak üzere tüm stromal hücreleri (CD3 − /CD20⁻/CD68 − /CD56⁻ve DAPI⁺) sayın.
   14. Bağışıklık hücrelerini T hücreleri (CD3 + ve^DAPI+ ), B hücreleri (CD20⁺ ve DAPI⁺), makrofajlar (CD68⁺ ve DAPI⁺) ve uNK hücreleri (CD56⁺ ve DAPI⁺) dahil olmak üzere ayrı ayrı sayın.
   15. Yakalanan her görüntü için toplam stromal hücre sayısına göre bağışıklık hücrelerinin yüzdeleri olarak verileri ifade edin ve son hücre sayısını tüm alanların ortalaması olarak bildirin.
   16. İşlem sonrası elde edilen veri tablolarını görüntülemek için Görünüm Düzenleyicisi'ni kullanın. Count Data tablosunuverin.
   17. Endometriyal immün hücre mekansal dağılımının nicelleştirilmesi
   18. 200x büyütme altında, bir hücre hücresi teması maksimum mesafe¹⁴olarak kabul edilen 0-20 μm aralığı için R programını kullanarak L işlevini tahmin edin.
       NOT: R dili araç kutusu 'spatstat' L işlevini ölçmek için kullanıldı.
       1. L fonksiyonlarının eğrisi (AUC) altındaki alana göre farklı bağışıklık hücrelerinin kümelenme düzeyini gösterir.

Sonuçlar

4 endometriyal immün hücre tipinin tespiti için 4 renkli multipleks test gerçekleştirmenin genel şematik süreci Şekil 1'de gösterilmiştir. Kısacası, bu multipleks immünofluoresans boyama protokolü 8 temel adım gerektiriyordu: 1. Slayt hazırlama, 2. Epitope alma, 3. Engelleme, 4. Birincil antikor uygulaması, 5. İkincil antikor uygulaması, 6. Sinyal amplifikasyonu, 7. Antikorun çıkarılması ve 8. Karşıtlık ve montaj. Görüntü işleme ve analiz daha sonra endometrium ...

Tartışmalar

Protokol içinde kritik adımlar
Multipleks boyamanın gayretli optimizasyon gerektirdiğini belirtmek önemlidir. Sitrat tampon ve mikrodalga teknolojisini kullanan antijen alımı, tam antikor sıyırmasını sağlamak ve doku canlılığını korumak için optimizasyon gerektirir. TSA reaktifleri antijeni çevreleyen bölgelere kovalent olarak bağladıklarından, sterik engel ("şemsiye etkisi" olarak da bilinir) yoluyla sonraki primer antikorun bağlanmasını potansiyel olarak engelleyebilirler....

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplification Diluent	Perkin Elmer	FP1498	Fluorophore diluent buffer
Antibody diluent	Perkin Elmer	ARD1001EA	Diluting the antibody
CD3	Spring Bioscience	M3072	Primary antibody
CD20	Biocare Medical	CM004B	Primary antibody
CD56	Leica	NCL-CD56-504	Primary antibody
CD68	Spring Bioscience	M5510	Primary antibody
Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x)	Abcam	AB64214	Antigen retrieval solution
EMSURE Xylene (isomeric mixture)	Merck	108297	Dewaxing
Ethanol absolute	Merck	107017	Ethyl alcohol for rehydration
HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome	Leica	RM2125RTS	Sectioning of paraffin-embedded tissue
inForm Advanced Image Analysis Software	Perkin Elmer	inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0)	Data Analysis software
Mantra® Workstation	Akoya Biosciences	CLS140089	Spectral imaging
Microwave	Panasonic	Inverter	Microwave stripping
Opal 520	Perkin Elmer	FP1487A	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal 620	Perkin Elmer	FP1495A	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal 650	Perkin Elmer	FP1496A	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal 690	Perkin Elmer	FP1497A	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Oven	Memmert	U10	Dewaxing
Peroxidase Blocking Solution	DAKO	S2023	Removal of tissue peroxidase activities
Poly-L-lysine coated slide	FISHER SCIENTIFIC	120-550-15	Slide for routine histological use
PolyHRP Broad Spectrum	Perkin Elmer	ARH1001EA	Secondary antibody
ProLong™ Gold Antifade Mountant	ThemoFisher Scientific	P36930	Mounting
Spatstat	/	Version 2.1-0	Spatial point pattern analysis
Spectral DAPI	Perkin Elmer	FP1490A	Nucleic acid staining
Tissue Processor	Thermo Fischer	Excelsior ES	Tissue processing for dehydration and paraffination
Tris Buffer Saline (TBS), 10x	Cell Signaling Technology	12498S	Washing solution
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1370-1L	Nonionic detergent