Coloração imunohistoquímica fluorescente multiplexada de quatro tipos de células imunes endometrial em aborto recorrente

Resumo

Apesar dos avanços na imunohistoquímica multiplex e na imagem multiespectral, caracterizar a densidade e o agrupamento das principais células imunes simultaneamente no endométrio continua sendo um desafio. Este artigo descreve um protocolo detalhado de coloração multiplex e imagens para a localização simultânea de quatro tipos de células imunes no endométrio.

Resumo

A imunohistoquímica é o método mais utilizado para identificação e visualização de antígenos teciduais em pesquisas biológicas e diagnósticos clínicos. Pode ser usado para caracterizar vários processos biológicos ou patologias, como cicatrização de feridas, resposta imune, rejeição tecidual e interações tecido-biomateriais. No entanto, a visualização e quantificação de múltiplos antígenos (especialmente para células imunes) em uma única seção tecidual usando a coloração imunohistoquímica convencional (IHC) permanece insatisfatória. Assim, tecnologias multiplexadas foram introduzidas nos últimos anos para identificar múltiplos marcadores biológicos em uma única amostra de tecido ou um conjunto de diferentes amostras de tecido.

Essas tecnologias podem ser especialmente úteis para diferenciar as mudanças nas interações célula-imune dentro do endométrio entre mulheres férteis e mulheres com abortos recorrentes durante a implantação. Este artigo descreve um protocolo detalhado para coloração de fluorescência multiplexada do IHC para investigar a densidade e o agrupamento de quatro tipos principais de células imunes simultaneamente em amostras endometrial precisamente cronometradas durante a implantação de embriões. O método inclui preparação amostral, otimização multiplex com marcadores para subtipos de células imunes e a varredura dos slides, seguido pela análise de dados, com referência específica à detecção de células imunes endometrial.

Usando este método, a densidade e o agrupamento de quatro tipos principais de células imunes no endométrio podem ser analisados simultaneamente em uma única seção tecidual. Além disso, este artigo discutirá os fatores críticos e a solução de problemas para superar possíveis interferências fluorforais entre as sondas fluorescentes que estão sendo aplicadas. É importante ressaltar que os resultados desta técnica de coloração multiplex podem ajudar a fornecer uma compreensão aprofundada da interação e regulação imunológica durante a implantação de embriões.

Introdução

Aborto recorrente (RM) pode ser definido como a perda de duas ou mais gestações antes das 24 semanas de gestação¹. Esta condição reprodutiva frequente afeta até 1% dos casais em todo o mundo^2,3. A fisiopatologia é multifatorial e pode ser dividida em causas embriológicas (principalmente devido a um karyótipo embrionário anormal) e causas maternamente orientadas que afetam o desenvolvimento endométrio e/ou placentário. Essa manifestação pode resultar de anormalidades genéticas parentais, anomalias uterinas, condições protombolíticas, fatores de endocrinologia e distúrbios imunológicos⁴.

Nos últimos anos, a disfunção celular com efeito imunológico tem sido implicada na patogênese da perda precoce da gravidez⁵. Isso inspirou muitas investigações sobre a elucidação das populações específicas de células imunes no endométrio durante o ciclo menstrual, implantação e gravidez precoce, com papéis específicos no início da gravidez. Entre essas células imunes, as células assassinas naturais uterinas (uNK) desempenham um papel crítico durante a implantação e gravidez de embriões, particularmente nos processos de invasão trofoblástica e angiogênese⁶. Estudos têm mostrado um aumento da densidade celular uNK no endométrio de mulheres com RM^7,8, embora este achado não tenha sido associado a um risco aumentado de aborto⁹. No entanto, isso estimulou pesquisas avaliando a densidade de outros tipos de células imunes (como macrófagos, células dendríticas uterinas) no endométrio em mulheres com RM^10,11. No entanto, permanece incerto se há uma alteração significativa na densidade das células imunes no endométrio de peri-implantação em mulheres com RM.

Uma possível explicação para a incerteza é que a avaliação da densidade das células imunes endometrial pode ser difícil devido às rápidas mudanças no endométrio durante a janela de implantação. Durante o período de 24 horas, mudanças significativas no endométrio alteram a densidade das células imunes e a secreção de citocinas, introduzindo uma fonte de variação nesses resultados¹². Além disso, a maioria dos relatórios depende principalmente do uso de coloração unicelular (por exemplo, métodos tradicionais de IHC) que não puderam examinar vários marcadores na mesma seção tecidual. Embora a citometria de fluxo possa ser usada para detectar múltiplas populações celulares em uma única amostra, as grandes quantidades de células necessárias e a otimização demorada dificultam a popularidade e eficiência deste método. Assim, o recente avanço na coloração multiplex IHC poderia resolver esse problema imunossumando múltiplos marcadores no mesmo slide para avaliar vários parâmetros, incluindo linhagem celular e localização histológica de subpopulações imunomunes individuais. Além disso, essa tecnologia pode maximizar as informações obtidas em caso de disponibilidade limitada de tecidos. Em última análise, essa técnica pode ajudar a elucidar as diferenças nas interações de células imunes no endométrio entre mulheres férteis e mulheres com RM.

Dois grupos de mulheres foram recrutados do Hospital Prince of Wales, incluindo mulheres de controle fértil (FC) e mulheres com aborto recorrente inexplicável (RM). O controle fértil foi definido como mulheres que tiveram pelo menos um parto vivo sem histórico de aborto espontâneo, e as mulheres RM foram definidas como aquelas que tiveram um histórico de abortos consecutivos ≥2 antes das 20 semanas de gestação. Os sujeitos dos dois grupos atenderam aos seguintes critérios de inclusão: (a) idade entre 20 e 42 anos, (b) não fumante, (c) ciclo menstrual regular (25-35 dias) e estrutura uterina normal, (d) não utilização de qualquer regime hormonal por pelo menos 3 meses antes da biópsia endometrial, (e) no hidrosalpinx por hytero-salpingograma. Além disso, todos os sujeitos recrutados tinham kariotipagem normal, ultrassonografia 3-dimensional normal histerosalpingograma, hormônio estimulante do folículo dia 2 < 10 UI/L, progesterona mid-luteal > 30 nmol/L, função tireoide normal, e testado negativo para lúpus anticoagulante e anticardolipina IgG e IgMbodies.

Para entender melhor a base imunológica da RM, seria mais desejável quantificar e localizar simultaneamente os principais tipos de células imunes presentes no endométrio no momento da implantação. Este artigo descreve todo o protocolo desde a preparação da amostra, a otimização multiplex com marcadores para subtipos de células imunes e a varredura dos slides, seguido pela análise de dados com referência específica à detecção de células imunes endometrial. Além disso, este artigo descreve como determinar a densidade e o agrupamento dos tipos de células imunes simultaneamente no endométrio.

Protocolo

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Clínica da Universidade Conjunta Chinesa de Hong Kong-Novos Territórios do Leste. O consentimento informado foi obtido dos participantes antes da coleta das biópsias endometrial. Consulte a seção de introdução para critérios de inclusão dos grupos de controle e RM.

1. Preparação da amostra

1. Certifique-se de que todas as mulheres deste estudo se submetam a um teste diário de vareta de urina a partir do dia 9 do ciclo menstrual em diante para identificar o surto do hormônio luteinizador (LH) para detectar a ovulação, e cronometrar as biópsias endometrial precisamente no^7º dia após o surto de LH (LH+7).
2. Obtenha um fragmento de^0,5 cm 2 de biópsia endometrial usando um sampler Pipelle ou Pipet Curet de mulheres férteis e mulheres com RM inexplicável. Rotular o recipiente e colocar a amostra imediatamente em formalina tamponada neutra de 10% (pH 7) para fixação durante a noite à temperatura ambiente.
   NOTA: O volume do fixador deve ser de 5 a 10 vezes o do tecido.
3. Coloque o tecido em um cartucho para desidratação em uma máquina de processamento de tecidos antes de incorporá-lo em cera de parafina derretida. Incorpore os tecidos em parafina a 58-60 °C.
4. Deixe o bloco de parafina esfriar durante a noite à temperatura ambiente. Use um microtome para aparar os blocos de parafina a uma espessura de 3 μm.
   NOTA: O uso de água destilada auxilia na montagem e adesão adequada do tecido ao longo da coloração multiplex.
5. Coloque a fita de parafina em um banho de água a 40-45 °C para 30 s.
6. Monte as seções em lâminas de vidro de microscópio revestidas de poli-L (0,1% w/v). Coloque as lâminas com o tecido voltado para cima e deixe secar a 37 °C durante a noite. Armazene os slides em uma caixa de slides longe de temperaturas extremas até que use mais.

2. Determine a concentração ideal de anticorpos para multiplex IHC usando IHC convencional.

NOTA: Isso é importante para identificar o nível de expressão e o padrão de cada marcador imunológico na amostra de endométrio, e determinar a sequência de coloração de cada marcador, bem como seus pares associados de amplificação de sinal de tiraside (TSA).

1. Teste os anticorpos para sua adequação para multiplex IHC usando o Manual Convencional IHC¹³.
2. Use tecidos de endométrio para testes de anticorpos únicos.
3. Inclua um controle positivo (por exemplo, baço) e controle negativo (controle de isótipo) para otimizar a condição de coloração de cada anticorpo.
4. Realize a coloração utilizando a diluição recomendada pela folha de dados do anticorpo.
5. Realizar coloração adicional utilizando concentrações acima e abaixo da diluição recomendada utilizada na etapa 2.3.
   NOTA: Um patologista clínico deve avaliar os slides manchados cegamente para confirmar a localização da sondagem de anticorpos e integridade celular.

3. Método de coloração multiplex

1. Preparação e fixação de slides
   1. Coloque os slides (a partir da etapa 1.6) plano com o tecido voltado para cima em um forno e asse a 60 °C por pelo menos 1h.
   2. Remova os slides do forno e deixe esfriar por pelo menos 20 minutos em temperatura ambiente antes de colocá-las em um rack de slides vertical.
   3. De cera e reidratar os slides formadolin-fixos, embutidos em parafina com 10 min alocados em cada um dos seguintes passos: xileno (2x), 100% etanol (2x), 95% de etanol (1x), 70% de etanol (2x) e água destilada (2x).
   4. Coloque o rack de slides em uma caixa de slides de plástico e submerse-os em soro fisiológico tris (TBS, pH 7.6).
      NOTA: Os slides devem permanecer úmidos a partir desta etapa de reidratação até a montagem na etapa final.
   5. Fixar as amostras submergindo os slides em uma caixa de slides de plástico cheia de uma mistura de formaldeído diluído em metanol (1:9) por 30 min no escuro.
   6. Lave os slides duas vezes em água deionizada por 2 minutos e, em seguida, proceda à recuperação de antígenos.
2. Recuperação de epitope
   1. Coloque o rack de slides em uma caixa resistente ao calor e preencha-o com tampão de ácido cítrico (pH 6.0) para cobrir os slides.
   2. Coloque a caixa no micro-ondas, e aqueça os slides por 50 s a 100% de potência seguido de 20 min com 20% de potência para manter a mesma temperatura.
   3. Deixe os slides esfriarem por aproximadamente 15 minutos à temperatura ambiente.
   4. Enxágüe os slides na água por 2 min seguidos por TBS-Tween 20 (TBST) por 2 min.
      NOTA: O TBST é composto por 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl e 0,05% Tween 20 (v/v).
3. Bloqueio
   1. Bloqueie a atividade de peroxidase endógena no tecido, imergindo o slide em um frasco contendo solução de bloqueio de peroxidase (ver a Tabela de Materiais) por 10 minutos.
   2. Lave os slides com TBST por 5 minutos.
   3. Use uma caneta de barreira hidrofóbica para marcar um limite ao redor da seção tecidual na lâmina.
   4. Cubra as seções de tecido com um tampão de bloqueio (ver a Tabela de Materiais) ou albumina de soro bovino (5%, w/v), e incuba os slides em uma câmara umidificada por 15 minutos.
4. Aplicação de anticorpos e sinais
   1. Remova os reagentes de bloqueio.
   2. Incubar com o anticorpo primário de interesse (por exemplo, CD3, diluição de 1:100 em diluente de anticorpos, ver Tabela 1) em uma câmara umidificada à temperatura ambiente por 30 minutos.
   3. Remova o anticorpo primário. Lave 3x com TBST por 5 minutos cada vez.
   4. Incubar com o anticorpo secundário de rabanete de polímero (HRP)(Tabela 1) por 15 minutos em uma câmara umidificada à temperatura ambiente. Lave 3x com TBST por 5 minutos cada vez.
   5. Aplique a solução de trabalho opal fluorophore TSA (1:100 em diluente de amplificação) e incubar à temperatura ambiente por 10 minutos para permitir a conjugação de fluorforeiro à amostra de tecido em locais primários de ligação de anticorpos. Lave com TBST em triplicado por 5 minutos cada vez.
5. Descascamento à base de micro-ondas
   1. Enxágüe com o tampão de recuperação de antígeno (solução tampão citrato, pH 6.0).
   2. Realize a desmontagem baseada em micro-ondas para remover o complexo hrp primário-secundário para introduzir o próximo anticorpo primário (por exemplo, CD20).
   3. Coloque os slides no tampão de recuperação de antígeno, microondas-los a 100% de potência para 50 s seguido de 20% de potência por 20 minutos em recipientes seguros para micro-ondas, e esfriá-los em temperatura ambiente por 15 minutos.
   4. Repetir passos 3.2.4 a 3.5.2 até que as amostras de tecido tenham sido sondadas com todos os anticorpos primários.
6. Contra-mancha e montagem
   1. Após a desmontagem e resfriamento do tampão de recuperação de antígeno à base de micro-ondas, enxágue os slides em água destilada e TBST.
   2. Incubar com solução de 4', 6-diamidino-2-fenildole (DAPI) (1,0 μg/mL) por 5 min em uma câmara umidificada à temperatura ambiente.
   3. Lave 3x com TBST por 5 minutos cada vez. Lave com água uma vez por 5 minutos.
   4. Seque o escorregador e monte com o meio de montagem apropriado (veja a tabela de materiais).
      NOTA: A contratenção não será necessária para que slides monoplex sejam usados para o desenvolvimento da biblioteca espectral.

4. Imagem e análise

1. Preparação de slides da biblioteca espectral
   1. Crie slides de biblioteca (imagens de referência de uma única mancha) para cada fluoróforo, DAPI e auto-fluorescência com o mesmo tecido de controle para análise de imagem multiespectral.
   2. Utilizando os slides das amostras de biópsia endometrial de mulheres com RM e mulheres férteis, realize etapas de 1,1 a 3,6,4 para detecção de anticorpos únicos para cada lâmina (sem maiores anticorpos ou adição de fluoróforos).
   3. Para cada detecção de anticorpos, colorir um dos slides com DAPI (como na etapa 3.6.2) e deixar um slide sem manutenção para a detecção de qualquer possível auto-fluorescência tecidual no espectro.
   4. Use os filtros apropriados na estação de trabalho para obter a imagem para este conjunto de slides para cada anticorpo e carretá-los na biblioteca de análise de imagens (conforme descrito na etapa 4.2).
   5. Uma vez que a imagem seja capturada, selecione inForm como a Fonte da Biblioteca Espectral e construa a biblioteca espectral.
   6. À medida que os fluoroforos são usados, selecione Manchas/Fluores... do menu.
   7. Ao escolher as manchas ou fluoroforos, reduza as opções selecionando um ou mais Grupos. Selecione Tudo para mostrar todos os espectros compatíveis com as imagens.
2. Imagem espectral
   NOTA: As imagens foram capturadas usando a Estação de Trabalho Mantra com a biblioteca espectral estabelecida usando o software inForm Image Analysis.
   1. Capture a imagem dos slides de um único anticorpo com os filtros de epi-fluorescência apropriados, conforme proposto na Tabela 2 (por exemplo, DAPI, isothiocyanato de fluoresceína [FITC], CY3, Texas Red e CY5) usando a estação de trabalho.
      NOTA: Os filtros recomendados para os fluoroforos específicos utilizados neste protocolo são mostrados na Tabela 2.
   2. Identifique um tempo de exposição adequado para um sinal ideal examinando cada marcador em seu canal de fluorescência correspondente.
      NOTA: O sinal ideal é determinado de acordo com a referência sobre a positividade e localização obtida na coloração de anticorpos únicos.
   3. Determine um tempo fixo de exposição para cada analito (combinação anticorpo-fluorohore) para padronizar uma comparação entre amostras.
      NOTA: A determinação da exposição fixa depende da intensidade na amostra de interesses.
   4. Escaneie os slides manchados de multiplex no modo de varredura apropriado com o algoritmo de foco automático incorporado.
      NOTA: A biblioteca espectral estabelecida seria usada para diferenciar o cubo de imagem multiespectral em componentes individuais únicos (descompração espectral). Isso permitiria que a identificação baseada em cores para todos os marcadores de interesse fosse processada usando as duas etapas principais: sessão de treinamento e sessão de análise de imagens.
3. Análise de imagem
   1. Contagem celular de tipos de células imunes selecionadas no endométrio
   2. Capture um mínimo de 10 campos para análise sob ampliação de 200x.
      NOTA: Os campos foram capturados digitalizando toda a seção sem qualquer seleção. Isso pode garantir a captura simultânea de todos os componentes celulares do endométrio, por exemplo, a fronteira epitelial luminal, estroma e glândulas.
   3. Para contar as células, clique no botão Objetos de Contagem na barra de passo para exibir o painel Configurações de contagem de objetos.
   4. Verifique o objeto descarte se tocar em uma caixa de borda para obter a exclusão de quaisquer objetos que toquem na borda da imagem, região do processo ou região do tecido.
   5. Se o tecido tiver sido segmentado, selecione a categoria de tecido na qual os objetos devem ser encontrados. Não conte objetos fora da categoria de tecido selecionado.
   6. Selecione a abordagem desejada para identificar objetos: Base de objeto ou pixel (limiar).
      NOTA: A abordagem baseada em Pixel (Threshold) deve ser selecionada em caso de uma mancha confiável ou consistente para a qual a aplicação de um simples limiar produzirá os pixels do objeto. A abordagem baseada em objeto é recomendada quando abordagens mais avançadas baseadas em morfometria são necessárias em caso de falta de consistência e especificidade da coloração de objetos.
   7. Selecione a escala de sinaldesejada: escala automática ou escala fixa.
      NOTA: A escolha da escala automática resultará em dimensionamento automático de cada plano componente antes de realizar a segmentação do objeto. A opção Escala Fixa é recomendada quando é necessário melhor desempenho de segmentação e os sinais de manchas são consistentes e confiáveis.
   8. Selecione o componente Principal para segmentação de objetos na lista de retirada.
   9. Ajuste o valor do sinal mínimo para o componente primário ao valor limiar desejado.
   10. Para preencher automaticamente os orifícios nos objetos, selecione Preencher buracos.
   11. Para detectar objetos que tocam em outros objetos como objetos individuais, em vez de como um objeto, selecione a caixa de seleção De divisão de refinar depois de selecionar a caixa de seleção de tamanho máximo (pixels).
   12. Para excluir objetos com base na arredondamento do objeto, verifique a caixa De arredondamento e especifique a Circularidade Mínimadesejada .
   13. Conte todas as células estromas (CD3⁻/CD20⁻/CD68⁻/CD56⁻, e DAPI⁺), incluindo as células ao redor dos vasos sanguíneos.
   14. Conte as células imunes separadamente, incluindo células T (CD3⁺ e DAPI⁺), células B (CD20⁺ e DAPI⁺), macrófagos (CD68⁺ e DAPI⁺), e células uNK (CD56⁺ e DAPI⁺).
   15. Expresse os dados como as porcentagens das células imunes em relação ao número total de células estromal para cada imagem capturada, e reporte a contagem final de células como uma média de todos os campos.
   16. Use o Editor de exibição para visualizar o pós processamento de tabelas de dados resultantes. Exportar a tabela Dados de Contagem.
   17. Quantificação da distribuição espacial de células imunes endometrial
   18. Sob ampliação de 200x, estime a função L utilizando o programa R para uma faixa de 0-20 μm considerada uma distância máxima de contato celular¹⁴.
       NOTA: A caixa de ferramentas de idioma R 'spatstat' foi usada para medir a função L.
       1. Denotar o nível de agrupamento de diferentes pares de células imunes com base na área sob a curva (AUC) de sua função L.

Resultados

O processo esquemático global de realização de um ensaio multiplex de 4 cores para a detecção de 4 tipos de células imunes endometrial é mostrado na Figura 1. Resumindo, o protocolo para esta coloração de imunofluorescência multiplex exigiu 8 passos-chave: 1. Preparação de slides, 2. Recuperação de epitope, 3. Bloqueio, aplicação de anticorpos primários, 5. aplicação de anticorpos secundários, 6. Amplificação de sinal, 7. Remoção de anticorpos e 8. Contrastain e monta...

Discussão

Passos críticos dentro do protocolo
É importante notar que a coloração multiplex requer otimização diligente. A recuperação de antígenos, usando a tecnologia de tampão citrato e micro-ondas, requer otimização para garantir a remoção completa de anticorpos e manter a viabilidade do tecido. Como os reagentes da TSA se ligam covalentemente aos locais ao redor do antígeno, eles podem potencialmente inibir a ligação de um anticorpo primário subsequente através de obstáculos estéricos (...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplification Diluent	Perkin Elmer	FP1498	Fluorophore diluent buffer
Antibody diluent	Perkin Elmer	ARD1001EA	Diluting the antibody
CD3	Spring Bioscience	M3072	Primary antibody
CD20	Biocare Medical	CM004B	Primary antibody
CD56	Leica	NCL-CD56-504	Primary antibody
CD68	Spring Bioscience	M5510	Primary antibody
Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x)	Abcam	AB64214	Antigen retrieval solution
EMSURE Xylene (isomeric mixture)	Merck	108297	Dewaxing
Ethanol absolute	Merck	107017	Ethyl alcohol for rehydration
HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome	Leica	RM2125RTS	Sectioning of paraffin-embedded tissue
inForm Advanced Image Analysis Software	Perkin Elmer	inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0)	Data Analysis software
Mantra® Workstation	Akoya Biosciences	CLS140089	Spectral imaging
Microwave	Panasonic	Inverter	Microwave stripping
Opal 520	Perkin Elmer	FP1487A	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal 620	Perkin Elmer	FP1495A	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal 650	Perkin Elmer	FP1496A	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal 690	Perkin Elmer	FP1497A	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Oven	Memmert	U10	Dewaxing
Peroxidase Blocking Solution	DAKO	S2023	Removal of tissue peroxidase activities
Poly-L-lysine coated slide	FISHER SCIENTIFIC	120-550-15	Slide for routine histological use
PolyHRP Broad Spectrum	Perkin Elmer	ARH1001EA	Secondary antibody
ProLong™ Gold Antifade Mountant	ThemoFisher Scientific	P36930	Mounting
Spatstat	/	Version 2.1-0	Spatial point pattern analysis
Spectral DAPI	Perkin Elmer	FP1490A	Nucleic acid staining
Tissue Processor	Thermo Fischer	Excelsior ES	Tissue processing for dehydration and paraffination
Tris Buffer Saline (TBS), 10x	Cell Signaling Technology	12498S	Washing solution
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1370-1L	Nonionic detergent