再発流産における4種類の子宮内膜免疫細胞型の多重化蛍光免疫物質化学的染色

要約

多重免疫体化学とマルチスペクトルイメージングの進歩にもかかわらず、子宮内膜における主要な免疫細胞の密度とクラスタリングを同時に特徴付けるのは依然として課題です。本論文では、子宮内膜における4種類の免疫細胞の同時局在化のための詳細な多重染色プロトコルとイメージングについて述べている。

要約

免疫組織化学は、生体研究や臨床診断における組織抗原の同定と可視化に最も一般的に使用される方法です。創傷治癒、免疫応答、組織拒絶反応、組織生体物質相互作用など、様々な生物学的プロセスや病理を特徴付けるために使用できます。しかし、従来の免疫組織化学(IHC)染色を用いた単一の組織セクションにおける複数の抗原(特に免疫細胞)の可視化および定量は不十分なままである。したがって、多重化された技術は、単一の組織サンプルまたは異なる組織サンプルのアンサンブル内の複数の生物学的マーカーを同定するために、近年導入されました。

これらの技術は、移植中に再発流産した肥沃な女性と女性の子宮内の免疫細胞間相互作用の変化を区別するのに特に有用であり得る。この論文では、多重蛍光IHC染色の詳細なプロトコルを用いて、胚移植中の正確なタイミングの子宮内膜標本における4つの主要な免疫細胞タイプの密度とクラスタリングを同時に調査する。この方法は、サンプル調製、免疫細胞サブタイプのマーカーによる多重最適化、およびスライドのスキャン、続いてデータ分析、子宮内膜免疫細胞の検出に関する具体的な参照を含む。

この方法を用いて、子宮内膜における4つの主要な免疫細胞タイプの密度およびクラスタリングを、単一の組織セクションで同時に解析することができる。さらに、適用される蛍光プローブ間の蛍光性干渉の可能性を克服するための重要な要因とトラブルシューティングについて説明します。重要なことに、この多重染色技術の結果は、胚移植中の免疫学的相互作用および調節の詳細な理解を提供するのに役立つ。

概要

再発流産(RM)は、妊娠²⁴週前の24週前の2回以上の妊娠の喪失と定義することができる。この頻繁な生殖状態は、世界中のカップルの最大1%に影響を及ぼします^2,3.病態生理は多因子的であり、子宮内膜および/または胎盤の発達に影響を与える母体駆動の原因(主に異常な胚核型による)および母体駆動の原因に分けることができる。この症状は、親の遺伝的異常、子宮異常、プロトロンボティック状態、内分泌因子、および免疫障害⁴に起因する可能性がある。

近年、免疫エフェクター細胞機能障害は妊娠初期の病因に関与している^5.これは、月経周期、移植、妊娠初期の子宮内膜中の免疫細胞の特定の集団を、妊娠初期の特定の役割を持つ特定の集団を解明する多くの調査に影響を与えました。これらの免疫細胞の中でも、子宮ナチュラルキラー(uNK)細胞は、特に栄養芽球浸潤と血管新生⁶の過程において、胚移植および妊娠時に重要な役割を果たす。研究は、RM^7,8を有する女性の子宮内膜におけるuNK細胞密度の増加を示しているが、この知見は流産のリスクの増加と関連していなかった^9。しかし、この刺激研究は^、RM10,11を有する女性の子宮内膜における他の免疫細胞型(マクロファージ、子宮樹状細胞など)の密度を評価する研究を刺激した。それにもかかわらず、RMを有する女性の包床注入子宮内膜における免疫細胞密度に有意な変化があるかどうかは不明である。

不確実性の1つの考えられる説明は、子宮内膜免疫細胞密度の評価が、移植の窓の間に子宮内膜の急激な変化のために困難である可能性があることである。24時間の時間枠の間に、子宮内膜の有意な変化は免疫細胞密度およびサイトカイン分泌を変化させ、これらの結果¹²に変動の源を導入する。さらに、ほとんどの報告は、主に同じ組織セクション上の複数のマーカーを調べることができなかった単細胞染色(例えば、従来のIHC法)の使用に依存している。フローサイトメトリーは、1つのサンプルで複数の細胞集団を検出するために使用できますが、大量の細胞が必要で、時間のかかる最適化により、この方法の人気と効率が妨げられています。したがって、近年の多重IHC染色の進歩は、同じスライド上で複数のマーカーを免疫染色して、細胞系統や個々の免疫亜集団の組織学的局在化を含む複数のパラメータを評価することによって、この問題を解決できる。さらに、この技術は、組織の入手可能性が限られている場合に得られる情報を最大限に活用することができる。最終的には、この技術は、RMを有する肥沃な女性と女性の間の子宮内膜における免疫細胞相互作用の違いを解明するのに役立つ。

女性の2つのグループは、肥沃な制御女性(FC)と原因不明の再発流産(RM)を持つ女性を含むプリンス・オブ・ウェールズ病院から募集されました。肥沃なコントロールは、自発的流産の既往歴のない少なくとも1人の出生を持つ女性と定義され、RM女性は妊娠20週前に≥2回連続流産の既往歴を持つ女性と定義された。2つのグループの被験者は、(a)20歳から42歳までの年齢、(b)非喫煙者、(c)定期的な月経周期(25〜35日)および正常子宮構造、(d)子宮内膜生検の前に少なくとも3ヶ月間ホルモン療法を使用しない、(e)ヒステラによるヒドロサルピンスの使用なし。さらに、募集されたすべての被験者は、正常な核作法、正常な3次元超音波超音波ヒステロスピンゴグラム、10 IU/L<2日目の卵胞刺激ホルモン、30nmol/L>中黄体プロゲステロン、正常甲状腺機能、およびα性抗凝固剤および抗心リジンIgGおよびIgM抗体に対して陰性を試験した。

RMの免疫学的基礎をよりよく理解するためには、移植時に子宮内膜に存在する主要な免疫細胞タイプを同時に定量化し、局在させることが最も望ましいであろう。本論文では、サンプル調製のプロトコル全体、免疫細胞サブタイプのマーカーによる多重最適化、スライドのスキャン、子宮内膜免疫細胞の検出に関する具体的なデータ分析について説明する。さらに、この論文では、子宮内膜における免疫細胞タイプの密度とクラスタリングを同時に決定する方法について述べる。

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プロトコル

この研究は、香港新準地域東方位クラスター臨床研究倫理委員会の中国合同大学によって承認されました。インフォームドコンセントは、子宮内膜生検を収集する前に参加者から得られました。制御グループおよびRMグループの包含基準については、「概要」セクションを参照してください。

1. サンプル準備

1. この研究のすべての女性が排卵を検出するために黄体形成ホルモン(LH)サージを同定するために月経周期の9日目以降に毎日尿ディップスティック検査を受けることを確認し、LHサージ(LH+7)の7^日目 に子宮内膜生検を正確に行う。
2. 原因不明のRMを有する肥沃な女性および女性からピペルサンプラーまたはピペットキュレットを使用して子宮内膜生検の0.5cm² 断片を得る。
   注: 固定剤の体積は、組織の5〜10倍にする必要があります。
3. 組織処理機の脱水用カートリッジに組織を入れ、溶融パラフィンワックスに埋め込みます。58-60°Cでパラフィンに組織を埋め込む。
4. パラフィンブロックを室温で一晩冷却します。ミクロトームを使用して、パラフィンブロックを厚さ3μmにトリミングします。
   注:蒸留水の使用は、多重染色全体にわたって適切な組織の取り付けと付着に役立ちます。
5. パラフィンリボンを水浴に40~45°Cで30s入れます。
6. ポリL-リジン(0.1%w/v)コーティングされた顕微鏡ガラススライドにセクションを取り付けます。組織を上向きにしてスライドを置き、一晩で37°Cで乾燥させます。さらに使用するまで極端な温度から離れたスライドボックスにスライドを保管してください。

2. 従来のIHCを用いて多重IHCの抗体の理想的な濃度を決定する。

注:これは、子宮内膜サンプル内の各免疫マーカーの発現レベルとパターンを特定し、各マーカーの染色配列と関連するチラミドシグナル増幅(TSA)フルオロフォアの組み合わせを決定するために重要です。

1. 手動の従来のIHC¹³を使用して、多重IHCに対する抗体の適合性をテストします。
2. 単一抗体検査には子宮内膜組織を使用します。
3. 各抗体の染色条件を最適化するための陽性対照(例えば、脾臓)および陰性対照(アイソタイプ制御)を含む。
4. 抗体のデータシートで推奨される希釈液を使用して染色を行います。
5. ステップ2.3で使用される推奨希釈液の上下の濃度を使用して追加の染色を行います。
   注:臨床病理学者は、抗体プローブと細胞の完全性の局在を確認するために、染色されたスライドを盲目的に評価する必要があります。

3. 多重染色法

1. スライドの準備と固定
   1. スライドを平らにして(ステップ1.6から)平らにし、組織をオーブンで上向きにし、60°Cで少なくとも1時間焼きます。
   2. スライドをオーブンから取り出し、室温で少なくとも20分間冷却してから、垂直スライドラックに入れます。
   3. デワックスおよび水分補給 10 分を使用して、ホルマリン固定、パラフィン埋め込みスライドを次の手順のそれぞれに割り当てる: キシレン (2x), 100% エタノール (2x), 95% エタノール (1x), 70% エタノール (2x), 蒸留水 (2x).
   4. スライドのラックをプラスチック製のスライドボックスに入れ、トリスバッファ状の生理液(TBS、pH 7.6)に浸します。
      注: スライドは、この再水和ステップから最後のステップで取り付けるまで、湿った状態を保つ必要があります。
   5. メタノール(1:9)で希釈したホルムアルデヒドを混ぜたプラスチック製のスライドボックスに、暗闇の中で30分間、スライドを沈めてサンプルを固定します。
   6. 2分間、脱イオン水でスライドを2回洗浄し、抗原の取り出しに進みます。
2. エピトープ検索
   1. スライドのラックを耐熱ボックスに入れ、クエン酸バッファー(pH 6.0)で充填してスライドを覆います。
   2. 電子レンジに箱を入れ、50 sのスライドを100%の電力で加熱し、20%の電力で20分加熱して同じ温度を維持します。
   3. スライドを室温で約15分間冷却します。
   4. スライドを水で2分間リンスし、その後TBS-トゥイーン20(TBST)を2分間リンスします。
      注: TBST は 25 mM トリス-HCl (pH 7.5)、150 mM NaCl、および 0.05% トゥイーン 20 (v/v) で構成されています。
3. ブロッキング
   1. ペルオキシダーゼ遮断溶液を含む瓶にスライドを浸漬することにより、組織中の内因性ペルオキシダーゼ活性をブロック( 材料表参照)10分間。
   2. スライドをTBSTで5分間洗います。
   3. 疎水性バリアペンを使用して、スライド上の組織セクションの周囲の境界をマークします。
   4. 組織切片をブロッキングバッファー( 材料表参照)またはウシ血清アルブミン(5%、w/v)で覆い、加湿チャンバーでスライドを15分間インキュベートします。
4. 抗体およびシグナル応用
   1. ブロッキング試薬を取り除く。
   2. 目的の一次抗体(例えば、CD3、抗体希釈液中の1:100希釈)を用いてインキュベートし、室温で30分間加湿したチャンバー内で 表1を参照)。
   3. 一次抗体を除去します。TBSTで3倍の洗浄を毎回5分間洗います。
   4. ポリマー西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識二次抗体(表1)を室温で加湿したチャンバーに15分間インキュベートする。TBSTで3倍の洗浄を毎回5分間洗います。
   5. オパールフルオロフォア TSA 作業溶液 (1:100 増幅希釈液) を適用し、10 分間室温でインキュベートして、一次抗体結合部位の組織サンプルにフルオロフォアを結合させます。TBSTで3回洗うたびに5分間洗います。
5. マイクロ波ベースストリッピング
   1. 抗原の検索バッファー (クエン酸緩衝液, pH 6.0) でリンスします。
   2. マイクロ波ベースのストリッピングを行い、次の一次抗体(例えば、CD20)を導入するために一次-二次HRP複合体を除去する。
   3. スライドを抗原検索バッファーに入れ、50 s の場合は 100% の電力でマイクロ波にし、マイクロ波安全容器で 20 分間 20% の電力を 20% にし、室温で 15 分間冷却します。
   4. 組織サンプルがすべての一次抗体でプローブされるまで、ステップ3.2.4~3.5.2を繰り返します。
6. カウンターステインおよび取り付け
   1. マイクロ波ベースの抗原検索バッファーの剥離および冷却後、蒸留水およびTBSTでスライドをすすいでください。
   2. 4'、6-ジミディノ-2-フェニリンドール(DAPI)溶液(1.0 μg/mL)を室温で加湿したチャンバーに5分間インキュベート。
   3. TBSTで3倍の洗浄を毎回5分間洗います。水で5分間洗います。
   4. スライドをエアドライし、適切な取り付け媒体で取り付けます( 材料表を参照)。
      注: スペクトルライブラリの開発にモノプレックススライドを使用する場合、カウンターステインは必要ありません。

4. 画像と解析

1. スペクトルライブラリスライドの作成
   1. マルチスペクトル画像解析用に、同じコントロール組織を使用して、フルオロフォア、DAPI、自動蛍光ごとにライブラリスライド(単染色参照画像)を作成します。
   2. RMと肥沃な女性を持つ女性からの子宮内膜生検サンプルのスライドを使用して、各スライドの単一抗体検出のためにステップ1.1〜3.6.4を実行する(さらなる抗体またはフルオロフォア添加なし)。
   3. 各抗体検出について、スライドの1つをDAPI(ステップ3.6.2のように)で染色し、スペクトル内の任意の可能な組織の自動検出のために1つのスライドを染色しません。
   4. ワークステーションで適切なフィルタを使用して、各抗体のこのスライドセットの画像を取得し、画像解析ライブラリにアップロードします(ステップ 4.2 で説明)。
   5. イメージがキャプチャされたら、 スペクトル ライブラリ ソースとして inForm を選択し、スペクトル ライブラリを構築します。
   6. 蛍光体を使用する場合は、メニューから ステイン/フルーターを 選択します。
   7. 汚れや蛍光体を選択しながら、1つ以上のグループを選択して選択肢を絞り込みます。[ すべて]を 選択すると、画像と互換性のあるすべてのスペクトルが表示されます。
2. スペクトルイメージング
   メモ:画像は、inForm画像解析ソフトウェアを使用して確立されたスペクトルライブラリを備えたMantraワークステーションを使用してキャプチャされました。
   1. 表2に提案されている適切なエピ蛍光フィルター(例えば、DAPI、フルオレセイン・イソチオシアネート[FITC]、CY3、テキサスレッド、およびCY5)を用いて、単一抗体染色スライドの画像をキャプチャする。
      注: このプロトコルで使用される特定の蛍光素に推奨されるフィルタを 表 2に示します。
   2. 対応する蛍光チャネルの各マーカーを調べることにより、最適な信号に適した露光時間を特定します。
      注:最適なシグナルは、単一抗体染色で得られた陽性と局在性に関する基準に従って決定されます。
   3. 各検体(抗体-フルオロフォアの組み合わせ)の固定露光時間を決定し、クロスサンプル比較を標準化します。
      注:固定露出の決定は、興味のサンプルの強度に依存します。
   4. 組み込みの自動焦点アルゴリズムを使用して、適切なスキャンモードで多重染色スライドをスキャンします。
      注: 確立されたスペクトル ライブラリは、マルチスペクトルイメージ キューブを個別のコンポーネント (スペクトルアンミックス) に区別するために使用されます。これにより、トレーニング セッションと画像解析セッションの 2 つの主要な手順を使用して、対象となるすべてのマーカーの色ベースの識別を処理できます。
3. 画像解析
   1. 子宮内膜における選択免疫細胞タイプの細胞カウント
   2. 200倍の拡大率で分析するために、最低10フィールドをキャプチャします。
      注: フィールドは、セクション全体を何も選択せずにスキャンすることでキャプチャされました。これにより、子宮内膜のすべての細胞成分、例えば、光上皮境界、間質、および腺の同時捕捉を確実にすることができる。
   3. セルをカウントするには、ステップバーの 「オブジェクト数をカウント 」ボタンをクリックして、「 オブジェクト数の設定」 パネルを表示します。
   4. 画像、プロセス領域、または組織領域のエッジに接触するオブジェクトを除外するには、[ エッジに触れる場合にオブジェクトを破棄 ]ボックスをオンにします。
   5. 組織がセグメント化されている場合は、オブジェクトが見つかる 組織カテゴリ を選択します。選択した組織カテゴリの外側にあるオブジェクトをカウントしないでください。
   6. オブジェクトを識別する 方法 を選択します: オブジェクトベース または ピクセルベース (しきい値)。
      注:ピクセルベース(閾値)アプローチは、単純なしきい値の適用がオブジェクトピクセルを生成する信頼性のある、または一貫した汚れの場合に選択する必要があります。オブジェクトベースのアプローチは、オブジェクトの染色の一貫性と特異性が欠如している場合に、より高度なモーホメトリーベースのアプローチが必要な場合に推奨されます。
   7. 目的の シグナルスケーリングを選択します: 自動スケール または 固定スケール.
      注: [自動スケール] を選択すると、オブジェクトのセグメンテーションを実行する前に、各コンポーネントプレーンが自動的にスケーリングされます。セグメンテーション性能が向上し、染色信号が一貫して信頼性の高い場合は、[ 固定スケール ]オプションをお勧めします。
   8. ドロップダウン リストからオブジェクト セグメンテーションの プライマリ コンポーネントを選択します。
   9. プライマリコンポーネントの [最小信号] の値を希望のしきい値に調整します。
   10. オブジェクトの穴を自動的に塗りつぶす場合は、[ 穴を埋める]を選択します。
   11. 1 つのオブジェクトとしてではなく、個別のオブジェクトとして他のオブジェクトに触れるオブジェクトを検出するには、[最大サイズ (ピクセル)]チェック ボックスをオンにした後で、[分割を調整] チェック ボックスをオンにします。
   12. オブジェクトの丸みを基準にしてオブジェクトを除外するには、[ 丸み] ボックスをオンにして、目的の [最小円度]を指定します。
   13. すべての間質細胞(CD3^-/CD20^-/CD68^-/CD56^-、およびDAPI⁺⁾を数えます。
   14. T細胞^(CD3+およびDAPI+)、B細胞(CD20+およびDAPI+)、マクロファージ(CD68+およびDAPI+)、およびuNK細胞(CD56+およびDAPI+)を含む免疫細胞を別々に数える。
   15. キャプチャされた各画像の全体の間質細胞の数に対する免疫細胞の割合としてデータを表現し、最終的な細胞数を全フィールドの平均として報告します。
   16. ビュー エディタ を使用して、結果のデータ テーブルのポスト処理を表示します。 データ数テーブルをエクスポートします。
   17. 子宮内膜免疫細胞空間分布の定量化
   18. 200倍倍率の下で、セルセルコンタクト最大距離¹⁴と考えられる0〜20 μmの範囲に対してRプログラムを使用してL関数を推定する。
       メモ: R 言語ツールボックスの「spatstat」は、L関数を測定するために使用されました。
       1. L機能の曲線下領域(AUC)に基づいて、異なる免疫細胞のペアのクラスタリングのレベルを示します。

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結果

4色の多重化アッセイを行う全体的な概略法を4種類の子宮内膜免疫細胞タイプの検出に用いた図1に示す。簡単に言えば、この多重免疫蛍光染色のためのプロトコルは、8つの重要なステップを必要としました:1.スライド調製、2.エピトープ検索、3.ブロッキング、4.一次抗体アプリケーション、5.二次抗体アプリケーション、6.シグナル増幅、7.反染色およびマウント。次に...

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ディスカッション

プロトコル内の重要なステップ
多重染色には、勤勉な最適化が必要であることに注意することが重要です。クエン酸緩衝液およびマイクロ波技術を用いた抗原検索では、完全な抗体ストリッピングを確保し、組織の生存率を維持するための最適化が必要です。TSA試薬は抗原を取り巻く部位に共有結合するので、立体障害(「アンブレラ効果」とも呼ばれる)を介して、その後の?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplification Diluent	Perkin Elmer	FP1498	Fluorophore diluent buffer
Antibody diluent	Perkin Elmer	ARD1001EA	Diluting the antibody
CD3	Spring Bioscience	M3072	Primary antibody
CD20	Biocare Medical	CM004B	Primary antibody
CD56	Leica	NCL-CD56-504	Primary antibody
CD68	Spring Bioscience	M5510	Primary antibody
Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x)	Abcam	AB64214	Antigen retrieval solution
EMSURE Xylene (isomeric mixture)	Merck	108297	Dewaxing
Ethanol absolute	Merck	107017	Ethyl alcohol for rehydration
HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome	Leica	RM2125RTS	Sectioning of paraffin-embedded tissue
inForm Advanced Image Analysis Software	Perkin Elmer	inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0)	Data Analysis software
Mantra® Workstation	Akoya Biosciences	CLS140089	Spectral imaging
Microwave	Panasonic	Inverter	Microwave stripping
Opal 520	Perkin Elmer	FP1487A	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal 620	Perkin Elmer	FP1495A	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal 650	Perkin Elmer	FP1496A	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal 690	Perkin Elmer	FP1497A	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Oven	Memmert	U10	Dewaxing
Peroxidase Blocking Solution	DAKO	S2023	Removal of tissue peroxidase activities
Poly-L-lysine coated slide	FISHER SCIENTIFIC	120-550-15	Slide for routine histological use
PolyHRP Broad Spectrum	Perkin Elmer	ARH1001EA	Secondary antibody
ProLong™ Gold Antifade Mountant	ThemoFisher Scientific	P36930	Mounting
Spatstat	/	Version 2.1-0	Spatial point pattern analysis
Spectral DAPI	Perkin Elmer	FP1490A	Nucleic acid staining
Tissue Processor	Thermo Fischer	Excelsior ES	Tissue processing for dehydration and paraffination
Tris Buffer Saline (TBS), 10x	Cell Signaling Technology	12498S	Washing solution
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1370-1L	Nonionic detergent