Coloration immunohistochimique fluorescente multiplexée de quatre types de cellules immunitaires de l’endomètre lors d’une fausse couche récurrente

Résumé

Malgré les progrès de l’immunohistochimie multiplexe et de l’imagerie multispectrale, caractériser la densité et le regroupement simultané des principales cellules immunitaires dans l’endomètre reste un défi. Cet article décrit un protocole de coloration multiplex détaillé et une imagerie pour la localisation simultanée de quatre types de cellules immunitaires dans l’endomètre.

Résumé

L’immunohistochimie est la méthode la plus couramment utilisée pour l’identification et la visualisation des antigènes tissulaires dans la recherche biologique et le diagnostic clinique. Il peut être utilisé pour caractériser divers processus biologiques ou pathologies, tels que la cicatrisation des plaies, la réponse immunitaire, le rejet tissulaire et les interactions tissu-biomatériau. Cependant, la visualisation et la quantification de plusieurs antigènes (en particulier pour les cellules immunitaires) dans une seule section de tissu à l’aide d’une coloration immunohistochimique conventionnelle (IHC) restent insatisfaisantes. Par conséquent, des technologies multiplexées ont été introduites ces dernières années pour identifier plusieurs marqueurs biologiques dans un seul échantillon de tissu ou un ensemble d’échantillons de tissus différents.

Ces technologies peuvent être particulièrement utiles pour différencier les changements dans les interactions cellules-à-cellule immunitaires dans l’endomètre entre les femmes fertiles et les femmes ayant des fausses couches récurrentes pendant l’implantation. Cet article décrit un protocole détaillé pour la coloration IHC par fluorescence multiplexée afin d’étudier la densité et le regroupement simultanément de quatre principaux types de cellules immunitaires dans des échantillons d’endomètre chronométrés avec précision lors de l’implantation d’embryons. La méthode comprend la préparation des échantillons, l’optimisation du multiplexe avec des marqueurs pour les sous-types de cellules immunitaires et le balayage des lames, suivi de l’analyse des données, avec une référence spécifique à la détection des cellules immunitaires de l’endomètre.

En utilisant cette méthode, la densité et le regroupement de quatre principaux types de cellules immunitaires dans l’endomètre peuvent être analysés simultanément dans une seule section de tissu. En outre, cet article traitera des facteurs critiques et du dépannage pour surmonter les interférences possibles de fluorophores entre les sondes fluorescentes appliquées. Il est important de noter que les résultats de cette technique de coloration multiplex peuvent aider à fournir une compréhension approfondie de l’interaction immunologique et de la régulation lors de l’implantation embryonnaire.

Introduction

Une fausse couche récurrente (RM) peut être définie comme la perte de deux grossesses ou plus avant 24 semaines de gestation¹. Cette condition de reproduction fréquente affecte jusqu’à 1% des couples dans le monde^2,3. La physiopathologie est multifactorielle et peut être divisée en causes embryologiques (principalement dues à un caryotype embryonnaire anormal) et causes maternelles qui affectent l’endomètre et / ou le développement placentaire. Cette manifestation peut résulter d’anomalies génétiques parentales, d’anomalies utérines, de conditions prothrombotiques, de facteurs endocrinologiques et de troubles immunologiques⁴.

Ces dernières années, un dysfonctionnement des cellules effectrices immunitaires a été impliqué dans la pathogenèse de la perte de grossesse précoce⁵. Cela a inspiré de nombreuses recherches pour élucider les populations spécifiques de cellules immunitaires dans l’endomètre pendant le cycle menstruel, l’implantation et le début de la grossesse, avec des rôles spécifiques en début de grossesse. Parmi ces cellules immunitaires, les cellules tueuses naturelles utérines (uNK) jouent un rôle essentiel lors de l’implantation embryonnaire et de la grossesse, en particulier dans les processus d’invasion trophoblastique et d’angiogenèse^6. Des études ont montré une augmentation de la densité cellulaire uNK dans l’endomètre des femmes atteintes de RM^7,8, bien que cette découverte n’ait pas été associée à un risque accru de fausse couche⁹. Cependant, cela a stimulé la recherche évaluant la densité d’autres types de cellules immunitaires (telles que les macrophages, les cellules dendritiques utérines) dans l’endomètre chez les femmes atteintes de RM^10,11. Néanmoins, il n’est pas certain qu’il y ait une altération significative de la densité des cellules immunitaires dans l’endomètre péri-implantatoire chez les femmes atteintes de RM.

Une explication possible de l’incertitude est que l’évaluation de la densité des cellules immunitaires de l’endomètre pourrait être difficile en raison des changements rapides dans l’endomètre pendant la fenêtre d’implantation. Au cours de la période de 24 heures, des changements importants dans l’endomètre modifient la densité des cellules immunitaires et la sécrétion de cytokines, introduisant une source de variation dans ces résultats¹². De plus, la plupart des rapports reposent principalement sur l’utilisation de la coloration unicellulaire (p. ex., les méthodes traditionnelles de LSI) qui ne pouvaient pas examiner plusieurs marqueurs sur la même section de tissu. Bien que la cytométrie en flux puisse être utilisée pour détecter plusieurs populations cellulaires dans un seul échantillon, les grandes quantités de cellules nécessaires et l’optimisation fastidieuse entravent la popularité et l’efficacité de cette méthode. Par conséquent, les progrès récents dans la coloration multiplexE de l’IHC pourraient résoudre ce problème en immunocolorant plusieurs marqueurs sur la même diapositive pour évaluer plusieurs paramètres, y compris la lignée cellulaire et la localisation histologique de sous-populations immunitaires individuelles. De plus, cette technologie peut maximiser les informations obtenues en cas de disponibilité limitée des tissus. En fin de compte, cette technique peut aider à élucider les différences dans les interactions des cellules immunitaires dans l’endomètre entre les femmes fertiles et les femmes atteintes de RM.

Deux groupes de femmes ont été recrutés à l’Hôpital Prince of Wales, y compris les femmes témoins fertiles (FC) et les femmes ayant une fausse couche récurrente inexpliquée (RM). Le contrôle fertile a été défini comme les femmes qui avaient au moins une naissance vivante sans antécédents de fausse couche spontanée, et les femmes RM ont été définies comme celles qui avaient des antécédents de ≥2 fausses couches consécutives avant 20 semaines de gestation. Les sujets des deux groupes répondaient aux critères d’inclusion suivants : (a) âge entre 20 et 42 ans, (b) non-fumeur, (c) cycle menstruel régulier (25-35 jours) et structure utérine normale, (d) pas d’utilisation d’un régime hormonal pendant au moins 3 mois avant la biopsie de l’endomètre, (e) pas d’hydrosalpinx par hystéro-salpingogramme. En outre, tous les sujets recrutés avaient un caryotypage normal, une échographie 3 dimensions normale, un hystérosalpingographie en 3 dimensions, une hormone folliculo-stimulante du jour 2 < 10 UI / L, une progestérone mi-lutéale > 30 nmol / L, une fonction thyroïdienne normale et des anticorps anticoagulants lupiques et anticorps IgG et IgM anticardiolipine.

Pour mieux comprendre la base immunologique de la RM, il serait plus souhaitable de quantifier et de localiser simultanément les principaux types de cellules immunitaires présentes dans l’endomètre au moment de l’implantation. Cet article décrit l’ensemble du protocole, de la préparation des échantillons à l’optimisation du multiplexe avec des marqueurs pour les sous-types de cellules immunitaires et au balayage des lames, suivi de l’analyse des données avec une référence spécifique à la détection des cellules immunitaires de l’endomètre. De plus, cet article décrit comment déterminer la densité et le regroupement des types de cellules immunitaires simultanément dans l’endomètre.

Protocole

L’étude a été approuvée par le Comité d’éthique de la recherche clinique du cluster Co chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster. Le consentement éclairé des participants a été obtenu avant de prélever les biopsies de l’endomètre. Reportez-vous à la section d’introduction pour connaître les critères d’inclusion des groupes témoin et RM.

1. Préparation de l’échantillon

1. Assurez-vous que toutes les femmes de cette étude subissent un test quotidien de jauge d’urine à partir du jour 9 du cycle menstruel pour identifier la poussée d’hormone lutéinisante (LH) afin de détecter l’ovulation et chronométrer les biopsies de l’endomètre précisément le^{7 e} jour après la poussée de LH (LH + 7).
2. Obtenez un fragment de biopsie de l’endomètre de^0,5 cm 2 à l’aide d’un échantillonneur Pipelle ou d’un curet pipet de femmes fertiles et de femmes atteintes de RM inexpliqué. Étiquetez le récipient et placez immédiatement l’échantillon dans du formol tamponné neutre à 10% (pH 7) pour une fixation pendant la nuit à température ambiante.
   REMARQUE: Le volume du fixateur doit être 5 à 10 fois supérieur à celui du tissu.
3. Placez le tissu dans une cartouche pour la déshydratation dans une machine de traitement des tissus avant de l’incorporer dans de la cire de paraffine fondue. Incorporer les tissus dans de la paraffine à 58-60 °C.
4. Laissez le bloc de paraffine refroidir pendant la nuit à température ambiante. Utilisez un microtome pour couper les blocs de paraffine à une épaisseur de 3 μm.
   REMARQUE: L’utilisation d’eau distillée aide au montage et à l’adhérence appropriés des tissus tout au long de la coloration multiplex.
5. Placez le ruban de paraffine dans un bain-marie à 40-45 °C pendant 30 s.
6. Montez les sections sur des lames de verre de microscope revêtues de poly-L-lysine (0,1 % p/v). Placez les lames avec le tissu tourné vers le haut et laissez sécher à 37 °C pendant la nuit. Rangez les diapositives dans une boîte à glissière à l’abri des températures extrêmes jusqu’à ce qu’elles soient utilisées ultérieurement.

2. Déterminer la concentration idéale d’anticorps pour l’IHC multiplex à l’aide de l’IHC conventionnel.

REMARQUE: Ceci est important pour identifier le niveau d’expression et le modèle de chaque marqueur immunitaire dans l’échantillon d’endomètre, et déterminer la séquence de coloration de chaque marqueur ainsi que leurs appariements de fluorophores associés à l’amplification du signal tyramide (TSA).

1. Testez les anticorps pour déterminer s’ils conviennent à l’IHC multiplex en utilisant l’IHC¹³conventionnel manuel.
2. Utilisez des tissus de l’endomètre pour les tests d’anticorps uniques.
3. Inclure un contrôle positif (p. ex., rate) et un contrôle négatif (contrôle de l’isotype) pour optimiser l’état de coloration de chaque anticorps.
4. Effectuez la coloration en utilisant la dilution recommandée par la fiche technique de l’anticorps.
5. Effectuer une coloration supplémentaire en utilisant des concentrations supérieures et inférieures à la dilution recommandée utilisée à l’étape 2.3.
   REMARQUE: Un pathologiste clinique doit évaluer les lames colorées à l’aveugle pour confirmer la localisation du sondage des anticorps et l’intégrité cellulaire.

3. Méthode de coloration multiplex

1. Préparation et fixation des diapositives
   1. Déposer les lames (à partir de l’étape 1.6) à plat avec le tissu tourné vers le haut dans un four et cuire au four à 60 °C pendant au moins 1 h.
   2. Retirez les glissières du four et laissez-les refroidir pendant au moins 20 minutes à température ambiante avant de les placer dans une grille à glissière verticale.
   3. Déparaffinez et réhydratez les lames fixées au formol et incorporées à la paraffine avec 10 min allouées à chacune des étapes suivantes : xylène (2x), éthanol à 100 % (2x), éthanol à 95 % (1x), éthanol à 70 % (2x) et eau distillée (2x).
   4. Placez le rack de diapositives dans une boîte à glissière en plastique et immergez-les dans une solution saline tamponnée Tris (TBS, pH 7,6).
      REMARQUE: Les lames doivent rester humides à partir de cette étape de réhydratation jusqu’au montage dans la dernière étape.
   5. Fixez les échantillons en immergeant les lames dans une boîte à lames en plastique remplie d’un mélange de formaldéhyde dilué dans du méthanol (1:9) pendant 30 min dans l’obscurité.
   6. Lavez les lames deux fois dans de l’eau désionisée pendant 2 minutes, puis procédez à la récupération de l’antigène.
2. Récupération d’épitopes
   1. Placez le rack de lames dans une boîte résistante à la chaleur et remplissez-le de tampon d’acide citrique (pH 6,0) pour couvrir les lames.
   2. Placez la boîte au micro-ondes et chauffez les lames pendant 50 s à 100 % de puissance, puis 20 min à 20 % de puissance pour maintenir la même température.
   3. Laissez refroidir les glissières pendant environ 15 minutes à température ambiante.
   4. Rincez les lames à l’eau pendant 2 min, puis TBS-Tween 20 (TBST) pendant 2 min.
      REMARQUE : Le TBST est composé de 25 mM de Tris-HCl (pH 7,5), de 150 mM de NaCl et de 0,05 % de Tween 20 (v/v).
3. Bloquant
   1. Bloquer l’activité endogène de la peroxydase dans les tissus en immergeant la lame sur un pot contenant une solution bloquant la peroxydase (voir la table des matériaux)pendant 10 min.
   2. Lavez les diapositives avec TBST pendant 5 min.
   3. Utilisez un stylo barrière hydrophobe pour marquer une limite autour de la section de tissu sur la diapositive.
   4. Couvrir les coupes de tissus avec un tampon bloquant (voir le tableau des matériaux)ou de l’albumine sérique bovine (5%, p /v), et incuber les lames dans une chambre humidifiée pendant 15 min.
4. Application d’anticorps et de signaux
   1. Retirez les réactifs bloquants.
   2. Incuber avec l’anticorps primaire d’intérêt (p. ex. CD3, dilution 1:100 dans le diluant d’anticorps, voir tableau 1) dans une chambre humidifiée à température ambiante pendant 30 min.
   3. Retirez l’anticorps primaire. Laver 3x avec TBST pendant 5 min à chaque fois.
   4. Incuber avec l’anticorps secondaire marqué au polymère peroxydase de raifort (HRP)(tableau 1)pendant 15 min dans une chambre humidifiée à température ambiante. Laver 3x avec TBST pendant 5 min à chaque fois.
   5. Appliquer la solution de travail Opal fluorophore TSA (1:100 dans le diluant d’amplification) et incuber à température ambiante pendant 10 min pour permettre la conjugaison du fluorophore à l’échantillon de tissu aux sites primaires de liaison des anticorps. Laver avec TBST en triple exemplaire pendant 5 minutes à chaque fois.
5. Décapage à base de micro-ondes
   1. Rincer avec le tampon de récupération d’antigène (solution tampon de citrate, pH 6,0).
   2. Effectuer un décapage à base de micro-ondes pour éliminer le complexe primaire-secondaire-RRH afin d’introduire l’anticorps primaire suivant (p. ex., CD20).
   3. Placez les lames dans un tampon de récupération d’antigène, mettez-les au micro-ondes à 100% de puissance pendant 50 s, puis 20% de puissance pendant 20 minutes dans des récipients allant au micro-ondes et refroidissez-les à température ambiante pendant 15 minutes.
   4. Répétez les étapes 3.2.4 à 3.5.2 jusqu’à ce que les échantillons de tissus aient été sondés avec tous les anticorps primaires.
6. Contre-tache et montage
   1. Après le décapage et le refroidissement par micro-ondes du tampon de récupération de l’antigène, rincez les lames à l’eau distillée et au TBST.
   2. Incuber avec une solution de 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (1,0 μg/mL) pendant 5 min dans une chambre humidifiée à température ambiante.
   3. Laver 3x avec TBST pendant 5 min à chaque fois. Laver à l’eau une fois pendant 5 min.
   4. Séchez la glissière à l’air libre et montez-la avec le support de montage approprié (voir le Tableau des matériaux).
      REMARQUE : Le contre-maintien ne sera pas nécessaire pour que les diapositives monoplex soient utilisées pour le développement de bibliothèques spectrales.

4. Image et analyse

1. Préparation des diapositives de la bibliothèque spectrale
   1. Créez des diapositives de bibliothèque (images de référence à tache unique) pour chaque fluorophore, DAPI et autofluorescence avec le même tissu de contrôle pour l’analyse d’images multispectrales.
   2. À l’aide des lames des échantillons de biopsie de l’endomètre provenant de femmes atteintes de RM et de femmes fertiles, effectuez les étapes 1.1 à 3.6.4 pour la détection d’anticorps uniques pour chaque lame (sans ajout d’anticorps ou de fluorophores).
   3. Pour chaque détection d’anticorps, colorez l’une des lames avec DAPI (comme à l’étape 3.6.2) et laissez une lame non colorée pour la détection de toute autofluorescence tissulaire possible dans le spectre.
   4. Utilisez les filtres appropriés dans le poste de travail pour obtenir l’image de cet ensemble de diapositives pour chaque anticorps et téléchargez-les dans la bibliothèque d’analyse d’images (comme décrit à l’étape 4.2).
   5. Une fois l’image capturée, sélectionnez inForm comme source de bibliothèque spectrale et créez la bibliothèque spectrale.
   6. Lorsque des fluorophores sont utilisés, sélectionnez Stains/Fluors... dans le menu.
   7. Lors du choix des taches ou des fluorophores, affinez les choix en sélectionnant un ou plusieurs groupes. Sélectionnez Tout pour afficher tous les spectres compatibles avec les images.
2. Imagerie spectrale
   REMARQUE: Les images ont été capturées à l’aide de la station de travail Mantra avec la bibliothèque spectrale établie à l’aide du logiciel inForm Image Analysis.
   1. Capturez l’image des lames colorées à un seul anticorps à l’aide des filtres d’épifluorescérance appropriés, comme proposé dans le tableau 2 (p. ex., DAPI, isothiocyanate de fluorescéine [FITC], CY3, Texas Red et CY5) à l’aide du poste de travail.
      REMARQUE: Les filtres recommandés pour les fluorophores spécifiques utilisés dans ce protocole sont présentés dans le tableau 2.
   2. Identifiez un temps d’exposition approprié pour un signal optimal en examinant chaque marqueur dans son canal de fluorescence correspondant.
      REMARQUE: Le signal optimal est déterminé en fonction de la référence sur la positivité et la localisation obtenues dans la coloration d’anticorps unique.
   3. Déterminer un temps d’exposition fixe pour chaque analyte (combinaison anticorps-fluorophore) afin de normaliser une comparaison entre échantillons.
      NOTE: La détermination de l’exposition fixe dépend de l’intensité dans l’échantillon d’intérêts.
   4. Scannez les diapositives colorées multiplex dans le mode de numérisation approprié avec l’algorithme de mise au point automatique intégré.
      REMARQUE: La bibliothèque spectrale établie serait utilisée pour différencier le cube d’image multispectral en composants individuels uniques (démélange spectral). Cela permettrait de traiter l’identification basée sur la couleur de tous les marqueurs d’intérêt en utilisant les deux étapes principales suivantes: session de formation et session d’analyse d’images.
3. Analyse d’images
   1. Comptage cellulaire de types de cellules immunitaires sélectionnés dans l’endomètre
   2. Capturez un minimum de 10 champs pour une analyse sous un grossissement de 200x.
      REMARQUE: Les champs ont été capturés en scannant toute la section sans aucune sélection. Cela peut assurer la capture simultanée de tous les composants cellulaires de l’endomètre, par exemple, la bordure épithéliale luminale, le stroma et les glandes.
   3. Pour compter les cellules, cliquez sur le bouton Compter les objets dans la barre d’étapes pour afficher le panneau Paramètres de comptage des objets.
   4. Cochez la case Ignorer l’objet si vous touchez un bord pour exclure tout objet touchant le bord de l’image, de la région de traitement ou de la région de tissu.
   5. Si le tissu a été segmenté, sélectionnez la catégorie de tissu dans laquelle les objets se trouvent. Ne comptez pas les objets en dehors de la catégorie de tissu sélectionnée.
   6. Sélectionnez l’approche souhaitée pour identifier les objets : Basé sur les objets ou basé sur les pixels (Seuil).
      REMARQUE: L’approche basée sur les pixels (seuil) doit être sélectionnée dans le cas d’une tache fiable ou cohérente pour laquelle l’application d’un seuil simple donnera les pixels de l’objet. L’approche basée sur les objets est recommandée lorsque des approches plus avancées basées sur la morphométrie sont nécessaires en cas de manque de cohérence et de spécificité de la coloration des objets.
   7. Sélectionnez la mise à l’échelle du signalsouhaitée : Mise à l’échelle automatique ou Échelle fixe.
      REMARQUE : Le choix de l’échelle automatique entraînera une mise à l’échelle automatique de chaque plan de composant avant d’effectuer la segmentation d’objet. L’option Échelle fixe est recommandée lorsque de meilleures performances de segmentation sont requises et que les signaux de coloration sont cohérents et fiables.
   8. Sélectionnez le composant principal pour la segmentation des objets dans la liste déroulante.
   9. Ajustez la valeur du signal minimum pour le composant principal à la valeur de seuil souhaitée.
   10. Pour remplir automatiquement les trous dans les objets, sélectionnez Remplir les trous.
   11. Pour détecter les objets qui touchent d’autres objets en tant qu’objets individuels, plutôt qu’en tant qu’objet, activez la case à cocher Affiner le fractionnement après avoir activé la case à cocher Taille maximale (pixels).
   12. Pour exclure des objets en fonction de l’arrondi de l’objet, cochez la case Arrondi et spécifiez la circularité minimalesouhaitée .
   13. Compter toutes les cellules stromales (CD3⁻/CD20⁻/CD68⁻/CD56⁻, et DAPI⁺), y compris les cellules entourant les vaisseaux sanguins.
   14. Compter les cellules immunitaires séparément, y compris les cellules T (CD3⁺ et DAPI^+),les cellules B (CD20⁺ et DAPI^+),les macrophages (CD68⁺ et DAPI⁺) et les cellules uNK (CD56⁺ et DAPI^+).
   15. Exprimez les données sous forme de pourcentages de cellules immunitaires par rapport au nombre total de cellules stromales pour chaque image capturée et indiquez le nombre final de cellules en moyenne de tous les champs.
   16. Utilisez l’éditeur de vue pour afficher les tables de données résultantes après le traitement. Exportez la table Count Data.
   17. Quantification de la distribution spatiale des cellules immunitaires de l’endomètre
   18. Sous un grossissement de 200x, estimer la fonction L à l’aide du programme R pour une plage de 0-20 μm considérée comme une distance maximale de contact cellule-cellule¹⁴.
       REMARQUE: La boîte à outils de langage R 'spatstat' a été utilisée pour mesurer la fonction L.
       1. Indique le niveau de regroupement de différentes paires de cellules immunitaires en fonction de l’aire sous la courbe (ASC) de leur fonction L.

Résultats

Le processus schématique global d’exécution d’un test multiplex à 4 couleurs pour la détection de 4 types de cellules immunitaires de l’endomètre est illustré à la figure 1. En bref, le protocole pour cette coloration par immunofluorescence multiplex nécessitait 8 étapes clés: 1. Préparation des lames, 2. Récupération de l’épitope, 3. Blocage, 4. Application d’anticorps primaires, 5. Application d’anticorps secondaires, 6. Amplification du signal, 7. Retrait de l’...

Discussion

Étapes critiques du protocole
Il est important de noter que la coloration multiplex nécessite une optimisation diligente. La récupération d’antigènes, à l’aide de la technologie du tampon de citrate et des micro-ondes, nécessite une optimisation pour assurer un décapage complet des anticorps et maintenir la viabilité des tissus. Comme les réactifs de la TSA se lient de manière covalente aux sites entourant l’antigène, ils peuvent potentiellement inhiber la liaison d’un anticorps pr...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplification Diluent	Perkin Elmer	FP1498	Fluorophore diluent buffer
Antibody diluent	Perkin Elmer	ARD1001EA	Diluting the antibody
CD3	Spring Bioscience	M3072	Primary antibody
CD20	Biocare Medical	CM004B	Primary antibody
CD56	Leica	NCL-CD56-504	Primary antibody
CD68	Spring Bioscience	M5510	Primary antibody
Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x)	Abcam	AB64214	Antigen retrieval solution
EMSURE Xylene (isomeric mixture)	Merck	108297	Dewaxing
Ethanol absolute	Merck	107017	Ethyl alcohol for rehydration
HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome	Leica	RM2125RTS	Sectioning of paraffin-embedded tissue
inForm Advanced Image Analysis Software	Perkin Elmer	inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0)	Data Analysis software
Mantra® Workstation	Akoya Biosciences	CLS140089	Spectral imaging
Microwave	Panasonic	Inverter	Microwave stripping
Opal 520	Perkin Elmer	FP1487A	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal 620	Perkin Elmer	FP1495A	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal 650	Perkin Elmer	FP1496A	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal 690	Perkin Elmer	FP1497A	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Oven	Memmert	U10	Dewaxing
Peroxidase Blocking Solution	DAKO	S2023	Removal of tissue peroxidase activities
Poly-L-lysine coated slide	FISHER SCIENTIFIC	120-550-15	Slide for routine histological use
PolyHRP Broad Spectrum	Perkin Elmer	ARH1001EA	Secondary antibody
ProLong™ Gold Antifade Mountant	ThemoFisher Scientific	P36930	Mounting
Spatstat	/	Version 2.1-0	Spatial point pattern analysis
Spectral DAPI	Perkin Elmer	FP1490A	Nucleic acid staining
Tissue Processor	Thermo Fischer	Excelsior ES	Tissue processing for dehydration and paraffination
Tris Buffer Saline (TBS), 10x	Cell Signaling Technology	12498S	Washing solution
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1370-1L	Nonionic detergent