Colorazione immunoistochimica fluorescente multiplexata di quattro tipi di cellule immunitarie endometriali in aborto spontaneo ricorrente

Riepilogo

Nonostante i progressi nell'immunoistochimica multiplex e nell'imaging multispettrale, caratterizzare la densità e il raggruppamento delle principali cellule immunitarie contemporaneamente nell'endometrio rimane una sfida. Questo documento descrive un protocollo dettagliato di colorazione multiplex e l'imaging per la localizzazione simultanea di quattro tipi di cellule immunitarie nell'endometrio.

Abstract

L'immunoistochimica è il metodo più comunemente usato per l'identificazione e la visualizzazione degli antigeni tissutali nella ricerca biologica e nella diagnostica clinica. Può essere utilizzato per caratterizzare vari processi biologici o patologie, come la guarigione delle ferite, la risposta immunitaria, il rigetto dei tessuti e le interazioni tessuto-biomateriale. Tuttavia, la visualizzazione e la quantificazione di più antigeni (specialmente per le cellule immunitarie) in una singola sezione di tessuto utilizzando la colorazione immunoistochimica convenzionale (IHC) rimane insoddisfacente. Pertanto, negli ultimi anni sono state introdotte tecnologie multiplexed per identificare più marcatori biologici in un singolo campione di tessuto o in un insieme di diversi campioni di tessuto.

Queste tecnologie possono essere particolarmente utili per differenziare i cambiamenti nelle interazioni immuno cellula-cellula all'interno dell'endometrio tra donne fertili e donne con aborti ricorrenti durante l'impianto. Questo documento descrive un protocollo dettagliato per la colorazione IHC a fluorescenza multiplexata per studiare la densità e il raggruppamento di quattro principali tipi di cellule immunitarie contemporaneamente in campioni endometriali temporizzati con precisione durante l'impianto dell'embrione. Il metodo prevede la preparazione del campione, l'ottimizzazione multiplex con marcatori per i sottotipi di cellule immunitarie e la scansione dei vetrini, seguita dall'analisi dei dati, con specifico riferimento alla rilevazione delle cellule immunitarie endometriali.

Utilizzando questo metodo, la densità e il raggruppamento di quattro principali tipi di cellule immunitarie nell'endometrio possono essere analizzati simultaneamente in una singola sezione di tessuto. Inoltre, questo documento discuterà i fattori critici e la risoluzione dei problemi per superare possibili interferenze fluoroforiche tra le sonde fluorescenti applicate. È importante sottolineare che i risultati di questa tecnica di colorazione multiplex possono aiutare a fornire una comprensione approfondita dell'interazione immunologica e della regolazione durante l'impianto dell'embrione.

Introduzione

L'aborto spontaneo ricorrente (RM) può essere definito come la perdita di due o più gravidanze prima delle 24 settimane di^{gestazione 1}. Questa condizione riproduttiva frequente colpisce fino all'1% delle coppie in tutto il mondo^2,3. La fisiopatologia è multifattoriale e può essere suddivisa in cause embriologicamente guidate (principalmente a causa di un cariotipo embrionale anormale) e cause guidate dalla madre che influenzano lo sviluppo dell'endometrio e / o della placenta. Questa manifestazione può derivare da anomalie genetiche parentali, anomalie uterine, condizioni protrombotiche, fattori endocrinologici e disturbi immunologici⁴.

Negli ultimi anni, la disfunzione delle cellule effettrici immunitarie è stata implicata nella patogenesi della perdita precoce della gravidanza⁵. Ciò ha ispirato molte indagini per chiarire le popolazioni specifiche di cellule immunitarie nell'endometrio durante il ciclo mestruale, l'impianto e la gravidanza precoce, con ruoli specifici all'inizio della gravidanza. Tra queste cellule immunitarie, le cellule natural killer uterine (uNK) svolgono un ruolo fondamentale durante l'impianto dell'embrione e la gravidanza, in particolare nei processi di invasione trofoblastica e angiogenesi⁶. Gli studi hanno dimostrato un aumento della densità delle cellule uNK nell'endometrio delle donne con RM^7,8, anche se questo risultato non è stato associato ad un aumentato rischio di aborto spontaneo⁹. Tuttavia, questo ha stimolato la ricerca valutando la densità di altri tipi di cellule immunitarie (come macrofagi, cellule dendritiche uterine) nell'endometrio nelle donne con RM^10,11. Tuttavia, rimane incerto se vi sia un'alterazione significativa della densità delle cellule immunitarie nell'endometrio perimpianto nelle donne con RM.

Una possibile spiegazione per l'incertezza è che la valutazione della densità delle cellule immunitarie endometriali potrebbe essere difficile a causa dei rapidi cambiamenti nell'endometrio durante la finestra di impianto. Durante il lasso di tempo di 24 ore, cambiamenti significativi nell'endometrio alterano la densità delle cellule immunitarie e la secrezione di citochine, introducendo una fonte di variazione in questi risultati¹². Inoltre, la maggior parte dei rapporti si basa principalmente sull'uso della colorazione a singola cellula (ad esempio, metodi IHC tradizionali) che non potrebbero esaminare più marcatori sulla stessa sezione di tessuto. Sebbene la citometria a flusso possa essere utilizzata per rilevare più popolazioni cellulari in un singolo campione, le grandi quantità di cellule richieste e l'ottimizzazione dispendiosa in termini di tempo ostacolano la popolarità e l'efficienza di questo metodo. Quindi, il recente progresso nella colorazione IHC multiplex potrebbe risolvere questo problema immunocolorando più marcatori sullo stesso vetrino per valutare più parametri, tra cui il lignaggio cellulare e la localizzazione istologica delle singole sottopopolazioni immunitarie. Inoltre, questa tecnologia può massimizzare le informazioni ottenute in caso di limitata disponibilità di tessuti. In definitiva, questa tecnica può aiutare a chiarire le differenze nelle interazioni delle cellule immunitarie nell'endometrio tra donne fertili e donne con RM.

Due gruppi di donne sono stati reclutati dal Prince of Wales Hospital, tra cui donne fertili di controllo (FC) e donne con aborto spontaneo ricorrente inspiegabile (RM). Il controllo fertile è stato definito come le donne che hanno avuto almeno un parto vivo senza alcuna storia di aborto spontaneo, e le donne RM sono state definite come quelle che hanno avuto una storia di ≥2 aborti consecutivi prima di 20 settimane di gestazione. I soggetti dei due gruppi soddisfacevano i seguenti criteri di inclusione: (a) età compresa tra 20 e 42 anni, (b) non fumatore, (c) ciclo mestruale regolare (25-35 giorni) e struttura uterina normale, (d) nessun uso di alcun regime ormonale per almeno 3 mesi prima della biopsia endometriale, (e) nessun idrosalpinx mediante istero-salpingogramma. Inoltre, tutti i soggetti reclutati avevano cariotipo normale, isterosalpingogramma ecografico a 3 dimensioni normale, ormone follicolo-stimolante del giorno 2 < 10 UI / L, progesterone medio-luteale > 30 nmol / L, normale funzione tiroidea e risultati negativi per gli anticorpi anticoagulante lupus e anticardiolipinA IgG e IgM.

Per comprendere meglio le basi immunologiche della RM, sarebbe più auspicabile quantificare e localizzare contemporaneamente i principali tipi di cellule immunitarie presenti nell'endometrio al momento dell'impianto. Questo articolo descrive l'intero protocollo dalla preparazione del campione, l'ottimizzazione multiplex con marcatori per sottotipi di cellule immunitarie e la scansione dei vetrini, seguita dall'analisi dei dati con specifico riferimento alla rilevazione delle cellule immunitarie endometriali. Inoltre, questo documento descrive come determinare la densità e il raggruppamento dei tipi di cellule immunitarie contemporaneamente nell'endometrio.

Protocollo

Lo studio è stato approvato dal Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee. Il consenso informato è stato ottenuto dai partecipanti prima di raccogliere le biopsie endometriali. Fare riferimento alla sezione introduttiva per i criteri di inclusione dei gruppi di controllo e RM.

1. Preparazione del campione

1. Assicurarsi che tutte le donne in questo studio siano sottoposte a un test giornaliero dell'astina delle urine dal giorno 9 del ciclo mestruale in poi per identificare l'aumento dell'ormone luteinizzante (LH) per rilevare l'ovulazione e cronometrare le biopsie endometriali precisamente il 7^° giorno dopo l'aumento di LH (LH + 7).
2. Ottenere un frammento di biopsia endometriale di^0,5 cm 2 utilizzando un campionatore Pipelle o Pipet Curet da donne fertili e donne con RM inspiegabile. Etichettare il contenitore e posizionare immediatamente il campione in formalina tamponata neutra al 10% (pH 7) per la fissazione notturna a temperatura ambiente.
   NOTA: Il volume del fissativo dovrebbe essere 5-10 volte quello del tessuto.
3. Posizionare il tessuto in una cartuccia per la disidratazione in una macchina per la lavorazione dei tessuti prima di incorporarlo in cera di paraffina fusa. Incorporare i tessuti in paraffina a 58-60 °C.
4. Lasciare raffreddare il blocco di paraffina durante la notte a temperatura ambiente. Utilizzare un microtomo per tagliare i blocchi di paraffina ad uno spessore di 3 μm.
   NOTA: L'uso di acqua distillata aiuta nel corretto montaggio dei tessuti e nell'aderenza durante la colorazione multiplex.
5. Mettere il nastro di paraffina a bagnomaria a 40-45 °C per 30 s.
6. Montare le sezioni su vetrini per microscopio rivestiti in poli-L-lisina (0,1% p/v). Posizionare i vetrini con il tessuto rivolto verso l'alto e lasciare asciugare a 37 °C durante la notte. Conservare le diapositive in una scatola di scorrimento lontano da temperature estreme fino a nuovo utilizzo.

2. Determinare la concentrazione ideale di anticorpi per multiplex IHC utilizzando IHC convenzionale.

NOTA: Questo è importante per identificare il livello di espressione e il modello di ciascun marcatore immunitario nel campione di endometrio e determinare la sequenza di colorazione di ciascun marcatore e i loro associati accoppiamenti fluoroforici di amplificazione del segnale di tiroamide (TSA).

1. Testare gli anticorpi per la loro idoneità per multiplex IHC utilizzando manuale convenzionale IHC¹³.
2. Utilizzare tessuti endometriali per il test di singoli anticorpi.
3. Includere un controllo positivo (ad esempio, la milza) e un controllo negativo (controllo dell'isotipo) per ottimizzare la condizione di colorazione di ciascun anticorpo.
4. Eseguire la colorazione utilizzando la diluizione raccomandata dalla scheda tecnica dell'anticorpo.
5. Eseguire una colorazione aggiuntiva utilizzando concentrazioni superiori e inferiori alla diluizione raccomandata utilizzata nel passaggio 2.3.
   NOTA: Un patologo clinico dovrebbe valutare ciecamente i vetrini colorati per confermare la localizzazione del sondaggio anticorpale e l'integrità cellulare.

3. Metodo di colorazione multiplex

1. Preparazione e fissaggio delle diapositive
   1. Stendere i vetrini (dal punto 1.6) in piano con il fazzoletto rivolto verso l'alto in un forno e cuocere a 60 °C per almeno 1 ora.
   2. Togliere le diapositive dal forno e lasciarle raffreddare per almeno 20 minuti a temperatura ambiente prima di metterle in una griglia verticale.
   3. Deceratare e reidratare i vetrini fissati in formalina e incorporati in paraffina con 10 minuti assegnati a ciascuno dei seguenti passaggi: xilene (2x), 100% etanolo (2x), 95% etanolo (1x), 70% etanolo (2x) e acqua distillata (2x).
   4. Posizionare il rack di vetrini in una scatola di plastica e immergerli in soluzione salina tamponata tris (TBS, pH 7,6).
      NOTA: Le diapositive devono rimanere umide a partire da questa fase di reidratazione fino al montaggio nella fase finale.
   5. Fissare i campioni immergendo i vetrini in una scatola di plastica riempita con una miscela di formaldeide diluita in metanolo (1:9) per 30 minuti al buio.
   6. Lavare i vetrini due volte in acqua deionizzata per 2 minuti e quindi procedere al recupero dell'antigene.
2. Recupero dell'epitopo
   1. Posizionare il rack di vetrini in una scatola resistente al calore e riempirlo con tampone di acido citrico (pH 6.0) per coprire i vetrini.
   2. Posizionare la scatola nel microonde e riscaldare i vetrini per 50 s al 100% di potenza seguita da 20 minuti al 20% di potenza per mantenere la stessa temperatura.
   3. Lasciare raffreddare le diapositive per circa 15 minuti a temperatura ambiente.
   4. Risciacquare i vetrini in acqua per 2 minuti seguiti da TBS-Tween 20 (TBST) per 2 minuti.
      NOTA: TBST è composto da 25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl e 0,05% Tween 20 (v/v).
3. Inceppamento
   1. Bloccare l'attività della perossidasi endogena nel tessuto immergendo il vetrino su un barattolo contenente soluzione bloccante la perossidasi (vedi tabella dei materiali)per 10 min.
   2. Lavare le diapositive con TBST per 5 min.
   3. Utilizzare una penna barriera idrofoba per segnare un limite attorno alla sezione del tessuto sul vetrino.
   4. Coprire le sezioni di tessuto con un tampone bloccante (vedi tabella dei materiali)o albumina sierica bovina (5%, p/v), e incubare i vetrini in una camera umidificata per 15 min.
4. Applicazione di anticorpi e segnali
   1. Rimuovere i reagenti bloccanti.
   2. Incubare con l'anticorpo primario di interesse (ad esempio, CD3, diluizione 1:100 in diluente anticorpale, vedere Tabella 1) in una camera umidificata a temperatura ambiente per 30 min.
   3. Rimuovere l'anticorpo primario. Lavare 3 volte con TBST per 5 minuti ogni volta.
   4. Incubare con l'anticorpo secondario marcato con perossidasi di rafano (HRP) polimerico(Tabella 1)per 15 minuti in una camera umidificata a temperatura ambiente. Lavare 3 volte con TBST per 5 minuti ogni volta.
   5. Applicare la soluzione di lavoro TSA al fluoroforo opalino (1:100 nel diluente di amplificazione) e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti per consentire la coniugazione del fluoroforo al campione di tessuto nei siti primari di legame degli anticorpi. Lavare con TBST in triplice copia per 5 minuti ogni volta.
5. Stripping a base di microonde
   1. Risciacquare con il tampone di recupero dell'antigene (soluzione tampone di citrato, pH 6,0).
   2. Eseguire lo stripping a base di microonde per rimuovere il complesso primario-secondario-HRP per introdurre il prossimo anticorpo primario (ad esempio, CD20).
   3. Posizionare i vetrini nel tampone di recupero dell'antigene, cuocerli a microonde al 100% di potenza per 50 s seguiti dal 20% di potenza per 20 minuti in contenitori sicuri per microonde e raffreddarli a temperatura ambiente per 15 minuti.
   4. Ripetere i passaggi da 3.2.4 a 3.5.2 fino a quando i campioni di tessuto non sono stati sondati con tutti gli anticorpi primari.
6. Controsuperazione e montaggio
   1. Dopo lo stripping a microonde e il raffreddamento del tampone di recupero dell'antigene, sciacquare i vetrini in acqua distillata e TBST.
   2. Incubare con 4', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) soluzione (1,0 μg/mL) per 5 minuti in una camera umidificata a temperatura ambiente.
   3. Lavare 3 volte con TBST per 5 minuti ogni volta. Lavare con acqua una volta per 5 minuti.
   4. Asciugare all'aria la slitta e montarla con il mezzo di montaggio appropriato (vedere la Tabella dei materiali).
      NOTA: la controcolorazione non sarà necessaria per le diapositive monoplex da utilizzare per lo sviluppo di librerie spettrali.

4. Immagine e analisi

1. Preparazione di diapositive della libreria Spectral
   1. Crea diapositive di libreria (immagini di riferimento a macchia singola) per ogni fluoroforo, DAPI e autofluorescenza con lo stesso tessuto di controllo per l'analisi di immagini multispettrali.
   2. Utilizzando i vetrini dei campioni di biopsia endometriale di donne con RM e donne fertili, eseguire i passaggi da 1.1 a 3.6.4 per il rilevamento di singoli anticorpi per ogni vetrino (senza ulteriore aggiunta di anticorpi o fluorofori).
   3. Per ogni rilevazione di anticorpi, colorare uno dei vetrini con DAPI (come nel passaggio 3.6.2) e lasciare un vetrino non macchiato per il rilevamento di qualsiasi possibile autofluorescenza tissutale nello spettro.
   4. Utilizzare i filtri appropriati nella workstation per ottenere l'immagine per questo set di diapositive per ciascun anticorpo e caricarli nella libreria di analisi delle immagini (come descritto nel passaggio 4.2).
   5. Una volta acquisita l'immagine, selezionare inForm come sorgente della libreria spettrale e creare la libreria spettrale.
   6. Quando vengono utilizzati fluorofori, selezionare Macchie/Fluor... dal menu.
   7. Durante la scelta delle macchie o dei fluorofori, restringere le scelte selezionando uno o più gruppi. Selezionare Tutto per visualizzare tutti gli spettri compatibili con le immagini.
2. Imaging spettrale
   NOTA: le immagini sono state acquisite utilizzando la Mantra Workstation con la libreria spettrale stabilita utilizzando il software inForm Image Analysis.
   1. Acquisire l'immagine dei vetrini colorati con anticorpi singoli con gli opportuni filtri di epifluorescenza come proposto nella Tabella 2 (ad esempio, DAPI, isotiocianato di fluoresceina [FITC], CY3, Texas Red e CY5) utilizzando la workstation.
      NOTA: i filtri consigliati per i fluorofori specifici utilizzati in questo protocollo sono mostrati nella Tabella 2.
   2. Identificare un tempo di esposizione adatto per un segnale ottimale esaminando ciascun marcatore nel corrispondente canale di fluorescenza.
      NOTA: Il segnale ottimale viene determinato in base al riferimento sulla positività e localizzazione ottenuta nella colorazione a singolo anticorpo.
   3. Determinare un tempo di esposizione fisso per ciascun analita (combinazione anticorpo-fluoroforo) per standardizzare un confronto tra campioni.
      NOTA: La determinazione dell'esposizione fissa dipende dall'intensità del campione di interessi.
   4. Scansiona le diapositive colorate multiplex nella modalità di scansione appropriata con l'algoritmo di messa a fuoco automatica incorporato.
      NOTA: la libreria spettrale stabilita verrebbe utilizzata per differenziare il cubo di immagine multispettrale in singoli singoli componenti (unmixing spettrale). Ciò consentirebbe di elaborare l'identificazione basata sul colore per tutti i marcatori di interesse utilizzando le seguenti due fasi principali: sessione di allenamento e sessione di analisi delle immagini.
3. Analisi delle immagini
   1. Conteggio cellulare di tipi di cellule immunitarie selezionati nell'endometrio
   2. Cattura un minimo di 10 campi per l'analisi con ingrandimento 200x.
      NOTA: i campi sono stati acquisiti eseguendo la scansione dell'intera sezione senza alcuna selezione. Ciò può garantire la cattura simultanea di tutti i componenti cellulari dell'endometrio, ad esempio il bordo epiteliale luminale, lo stroma e le ghiandole.
   3. Per contare le celle, fare clic sul pulsante Conta oggetti nella barra dei passaggi per visualizzare il pannello Impostazioni conteggio oggetti.
   4. Selezionare la casella Elimina oggetto se tocco un bordo per l'esclusione di qualsiasi oggetto che tocchi il bordo dell'immagine, l'area di processo o la regione del tessuto.
   5. Se il tessuto è stato segmentato, selezionare la categoria di tessuto in cui si trovano gli oggetti. Non contare gli oggetti al di fuori della categoria di tessuto selezionata.
   6. Selezionare l'approccio desiderato per identificare gli oggetti: Object-Based o Pixel-Based (Soglia).
      NOTA: l'approccio Basato su pixel (soglia) deve essere selezionato in caso di una macchia affidabile o coerente per la quale l'applicazione di una soglia semplice produrrà pixel dell'oggetto. L'approccio Object-Based è raccomandato quando sono richiesti approcci più avanzati basati sulla morfometria in caso di mancanza di coerenza e specificità della colorazione degli oggetti.
   7. Selezionare il Signal Scalingdesiderato: Scala automatica o Scala fissa.
      NOTA: se si sceglie Scala automatica, il ridimensionamento automatico di ciascun piano componente prima di eseguire la segmentazione degli oggetti. L'opzione Scala fissa è consigliata quando sono richieste migliori prestazioni di segmentazione e i segnali di macchia sono coerenti e affidabili.
   8. Selezionare il componente primario per la segmentazione degli oggetti dall'elenco a discesa.
   9. Regolare il valore del segnale minimo per il componente primario in base al valore di soglia desiderato.
   10. Per riempire automaticamente i fori negli oggetti, selezionate Riempi fori ( Fill Holes) .
   11. Per rilevare oggetti che toccano altri oggetti come singoli oggetti, anziché come un unico oggetto, selezionare la casella di controllo Perfeziona divisione dopo aver selezionato la casella di controllo Dimensione massima (pixel).
   12. Per escludere gli oggetti in base all'rotondità dell'oggetto, selezionate la casella Rotondità (Roundness) e specificate la circolarità minimadesiderata.
   13. Contare tutte le cellule stromali (CD3⁻/CD20⁻/CD68⁻/CD56⁻e DAPI^+),comprese le cellule che circondano i vasi sanguigni.
   14. Contare le cellule immunitarie separatamente, comprese le cellule T (CD3⁺ e DAPI⁺), le cellule B (CD20⁺ e DAPI⁺), i macrofagi (CD68⁺ e DAPI⁺) e le cellule uNK (CD56⁺ e DAPI⁺).
   15. Esprimere i dati come percentuali delle cellule immunitarie rispetto al numero totale di cellule stromali per ogni immagine catturata e riportare il conteggio finale delle cellule come media di tutti i campi.
   16. Utilizzare l'Editor viste per visualizzare le tabelle di dati risultanti dopo l'elaborazione. Esportare la tabella Count Data.
   17. Quantificazione della distribuzione spaziale delle cellule immunitarie endometriali
   18. Sotto l'ingrandimento di 200x, stimare la funzione L utilizzando il programma R per un intervallo di 0-20 μm considerato una distanza massima di contatto cellula-cella¹⁴.
       NOTA: la casella degli strumenti del linguaggio R 'spatstat' è stata utilizzata per misurare la funzione L.
       1. Denotare il livello di raggruppamento di diverse coppie di cellule immunitarie in base all'area sotto la curva (AUC) della loro funzione L.

Risultati

Il processo schematico complessivo di esecuzione di un test multiplex a 4 colori per il rilevamento di 4 tipi di cellule immunitarie endometriali è mostrato nella Figura 1. In breve, il protocollo per questa colorazione di immunofluorescenza multiplex ha richiesto 8 passaggi chiave: 1. Preparazione del vetrino, 2. Recupero dell'epitopo, 3. Blocco, 4. Applicazione dell'anticorpo primario, 5. Applicazione dell'anticorpo secondario, 6. Amplificazione del segnale, 7. Rimozione dell'anticorpo e ...

Discussione

Passaggi critici all'interno del protocollo
È importante notare che la colorazione multiplex richiede un'ottimizzazione diligente. Il recupero dell'antigene, utilizzando il tampone citrato e la tecnologia a microonde, richiede l'ottimizzazione per garantire la completa rimozione degli anticorpi e mantenere la vitalità dei tessuti. Poiché i reagenti TSA si legano covalentemente ai siti che circondano l'antigene, possono potenzialmente inibire il legame di un successivo anticorpo primario attraverso ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplification Diluent	Perkin Elmer	FP1498	Fluorophore diluent buffer
Antibody diluent	Perkin Elmer	ARD1001EA	Diluting the antibody
CD3	Spring Bioscience	M3072	Primary antibody
CD20	Biocare Medical	CM004B	Primary antibody
CD56	Leica	NCL-CD56-504	Primary antibody
CD68	Spring Bioscience	M5510	Primary antibody
Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x)	Abcam	AB64214	Antigen retrieval solution
EMSURE Xylene (isomeric mixture)	Merck	108297	Dewaxing
Ethanol absolute	Merck	107017	Ethyl alcohol for rehydration
HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome	Leica	RM2125RTS	Sectioning of paraffin-embedded tissue
inForm Advanced Image Analysis Software	Perkin Elmer	inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0)	Data Analysis software
Mantra® Workstation	Akoya Biosciences	CLS140089	Spectral imaging
Microwave	Panasonic	Inverter	Microwave stripping
Opal 520	Perkin Elmer	FP1487A	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal 620	Perkin Elmer	FP1495A	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal 650	Perkin Elmer	FP1496A	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal 690	Perkin Elmer	FP1497A	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Oven	Memmert	U10	Dewaxing
Peroxidase Blocking Solution	DAKO	S2023	Removal of tissue peroxidase activities
Poly-L-lysine coated slide	FISHER SCIENTIFIC	120-550-15	Slide for routine histological use
PolyHRP Broad Spectrum	Perkin Elmer	ARH1001EA	Secondary antibody
ProLong™ Gold Antifade Mountant	ThemoFisher Scientific	P36930	Mounting
Spatstat	/	Version 2.1-0	Spatial point pattern analysis
Spectral DAPI	Perkin Elmer	FP1490A	Nucleic acid staining
Tissue Processor	Thermo Fischer	Excelsior ES	Tissue processing for dehydration and paraffination
Tris Buffer Saline (TBS), 10x	Cell Signaling Technology	12498S	Washing solution
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1370-1L	Nonionic detergent