Drosophila Comportamiento de evitación pasiva como nuevo paradigma para estudiar el aprendizaje asociativo aversivo

Resumen

Este trabajo describe un paradigma conductual simple que permite el análisis del aprendizaje asociativo aversivo en moscas de la fruta adultas. El método se basa en suprimir el comportamiento geotaxis negativo innato debido a la asociación formada entre un contexto ambiental específico y una descarga eléctrica.

Resumen

Este protocolo describe un nuevo paradigma para analizar el aprendizaje asociativo aversivo en moscas adultas (Drosophila melanogaster). El paradigma es análogo al comportamiento de evitación pasiva en roedores de laboratorio en el que los animales aprenden a evitar un compartimento donde previamente han recibido una descarga eléctrica. El ensayo aprovecha la geotaxis negativa en moscas, que se manifiesta como un impulso de subir cuando se colocan en una superficie vertical. La configuración consiste en compartimentos superiores e inferiores orientados verticalmente. En la primera prueba, una mosca se coloca en un compartimento inferior desde donde generalmente sale dentro de 3-15 s, y entra en el compartimiento superior donde recibe una descarga eléctrica. Durante la segunda prueba, 24 h después, la latencia aumenta significativamente. Al mismo tiempo, el número de choques disminuye en comparación con el primer ensayo, lo que indica que las moscas formaron memoria a largo plazo sobre el compartimento superior. Las grabaciones de latencias y número de choques podrían realizarse con un contador de conteo y un cronómetro o con un dispositivo simple basado en Arduino. Para ilustrar cómo se puede utilizar el ensayo, aquí se caracterizó el comportamiento de evitación pasiva de D. melanogaster y D. simulans masculino y femenino. La comparación de latencias y el número de choques reveló que tanto D. melanogaster como D. simulans vuelan de manera eficiente aprendieron el comportamiento de evitación pasiva. No se observaron diferencias estadísticas entre las moscas macho y hembra. Sin embargo, los hombres fueron un poco más rápidos al ingresar al compartimento superior en el primer ensayo, mientras que las mujeres recibieron un número ligeramente mayor de choques en cada ensayo de retención. La dieta occidental (WD) deterioró significativamente el aprendizaje y la memoria en las moscas macho, mientras que el ejercicio de vuelo contrarrestó este efecto. En conjunto, el comportamiento de evitación pasiva en las moscas ofrece un ensayo simple y reproducible que podría usarse para estudiar los mecanismos básicos de aprendizaje y memoria.

Introducción

El aprendizaje y la memoria es un mecanismo de adaptación evolutivamente antiguo al medio ambiente, conservado desde Drosophila (D.) hasta el ^humano1. La mosca de la fruta es un organismo modelo robusto para estudiar los principios fundamentales del aprendizaje y la memoria, ya que ofrece una amplia gama de poderosas herramientas genéticas para diseccionar los mecanismos moleculares intrínsecos2. Los estudios pioneros de cribado genético, que identificaron los genes rutabaga3, amnesiac4 y dunce5 críticos para el aprendizaje y la ^memoria2, aprovecharon el condicionamiento olfativo ya que las moscas de la fruta dependen de su agudo sentido del olfato para encontrar comida, parejas potenciales y evitar ^{depredadores6}.

El condicionamiento olfativo se ha convertido en un paradigma popular para estudiar el mecanismo del aprendizaje y la memoria, gracias a la introducción del laberinto en T olfativo por Tully y ^Quinn7,8. Posteriormente, se han propuesto otros métodos para medir diversos tipos de aprendizaje y memoria, entre ellos el condicionamiento ^visual9, el acondicionamiento del ^cortejo10, el ensayo de supresión de fototaxis ^aversivo11 y el condicionamiento de exposición a avispas12. Sin embargo, la mayoría de estos ensayos tienen una configuración compleja que debe ser construida a medida en un taller universitario o comprada a través de un proveedor. El paradigma aquí descrito se basa en un simple ensayo conductual para estudiar el aprendizaje asociativo aversivo en moscas que se puede ensamblar fácilmente con unos pocos suministros disponibles.

El paradigma descrito es equivalente a la conducta de evitación pasiva (o inhibitoria) en ratones y ratas de laboratorio en la que los animales aprenden a evitar un compartimento donde previamente han recibido descarga eléctrica del ^pie13. En los múridos, el procedimiento se basa en su evitación innata de la luz brillante y la preferencia por las zonas más ^oscuras14. En el primer ensayo, el animal se coloca en el compartimento brillante, desde donde el animal sale rápidamente, entrando en un compartimento oscuro, donde se administra una descarga eléctrica para el pie. Por lo general, un solo ensayo es suficiente para formar una memoria sólida a largo plazo, lo que resulta en un aumento significativo de la latencia 24 h más tarde. La latencia se utiliza entonces como índice de la capacidad del animal para recordar la asociación entre el estímulo aversivo y el entorno ^{específico15}.

Este trabajo describe un procedimiento análogo utilizando D. como sistema modelo que ofrece varias ventajas sobre los modelos de roedores, incluyendo la rentabilidad, el mayor tamaño de la muestra, la ausencia de supervisión regulatoria y el acceso a poderosas herramientas ^{genéticas16,17}. El procedimiento se basa en el comportamiento negativo de la geotaxis, que se manifiesta en la necesidad de las moscas de subir cuando se colocan en una superficie ^vertical18. La configuración consta de dos cámaras verticales. En el primer ensayo, una mosca de la fruta se coloca en un compartimento inferior. Desde allí, generalmente sale dentro de 3-15 s, entrando en el compartimiento superior donde recibe una descarga eléctrica. Durante una prueba de 1 minuto, algunas moscas pueden volver a entrar ocasionalmente en el compartimento superior, lo que resulta en una descarga eléctrica adicional. Durante la fase de prueba, 24 h después, la latencia aumenta significativamente. Al mismo tiempo, el número de choques disminuye en comparación con el primer día, lo que indica que las moscas formaron memoria asociativa aversiva sobre el compartimento superior. La latencia, el número de choques y la duración y frecuencia de los combates de aseo se utilizan para analizar el comportamiento animal y la capacidad de formar y recordar la asociación entre el estímulo aversivo y el entorno específico. Los resultados representativos revelan que la exposición a la dieta occidental (WD) afecta significativamente el comportamiento de evitación pasiva en las moscas macho, lo que sugiere que el WD afecta profundamente el comportamiento y la cognición de la mosca. Por el contrario, el ejercicio de vuelo alivió el efecto negativo del WD, mejorando el comportamiento de evitación pasiva.

Protocolo

1. Preparación de aparatos de evitación pasiva

1. Perfore un orificio de 4 mm perpendicular a la superficie de la pared del tubo de cultivo de polipropileno de 14 ml y a 8 mm del fondo del tubo.
   NOTA: Utilice un taladro eléctrico y una broca de 5/32 para obtener los mejores resultados.
2. Usando un cuchillo utilitario de acero, corte la parte superior del tubo de cultivo de polipropileno de 14 ml para crear un fragmento inferior de tubo de 45 mm de largo. El fragmento inferior sirve como compartimento inferior.
3. Corte la punta de la punta de la pipeta azul de 1.000 μL con una hoja de afeitar de un solo borde para que la abertura sea lo suficientemente ancha para el paso de una sola mosca. Corta la parte estrechante de la punta azul para crear un fragmento de 12 mm. Inserte este fragmento firmemente en un orificio de 4 mm del compartimento inferior. Esto se utiliza como muelle de carga para transferir las moscas.
4. Corte una pieza de 15 mm de tubo de vinilo transparente de 5/8" ID (ver Tabla de Materiales) para crear un acoplamiento. Inserte el compartimento superior e inferior en el acoplamiento desde extremos opuestos para unir de forma segura el compartimento inferior al compartimento superior.
5. Con una abrazadera ajustable de 2 puntas, fije el conjunto a un soporte vertical. Oriente el conjunto verticalmente con el tubo de choque como compartimento superior.
6. Conecte los cables del tubo de descarga a un estimulador eléctrico (consulte la Tabla de materiales) para administrar descargas eléctricas. La duración del período de entrenamiento es de 1 min.
   NOTA: Para facilitar la observación, coloque un trozo de papel blanco detrás del tubo de choque para que sirva como fondo blanco del aparato. Coloque una lámpara con una bombilla suave equivalente a 75 W sobre el compartimiento de choque. Coloque una lámpara de lupa de brazo ajustable frente a la configuración. Una representación del aparato de evitación pasiva se muestra en la Figura 1.

2. Preparación de las moscas para el procedimiento de evitación pasiva

1. Inmovilizar moscas D. melanogaster o D. simulans de 3-4 días de edad utilizando bloques helados y transferirlas a viales individuales con alimentos 24 h antes del experimento (1 mosca por vial) siguiendo el procedimiento descrito anteriormente19.
   NOTA: Los experimentos descritos aquí compararon hombres de 3-4 días de edad vs. moscas hembra en D. melanogaster y D. simulans.
2. Antes de los experimentos de comportamiento, codifique todos los viales. Para esto, asigne a cada grupo una letra, por ejemplo, "A", "B", "C", etc., y cada uno vuele un número. Revele este código solo después de que todos los datos hayan sido registrados y analizados. Use al menos 20 moscas por genotipo o tratamiento para contrarrestar las variaciones individuales.
   NOTA: Realizar los experimentos y análisis "a ciegas" permite excluir un sesgo en la evaluación del rendimiento de la mosca y el análisis de datos.

3. Realización de la primera prueba

1. Utilizando un aspirador de boca de mosca (ver Tabla de Materiales) descrito ^{anteriormente20,} transfiera suavemente una mosca desde el vial individual al compartimento inferior a través de la base de carga. Succiona suavemente una mosca en el aspirador bucal aspirando aire. Deposite la mosca soplando ligeramente en el muelle de carga.
   NOTA: Evite estresar al animal durante la captura y la carga.
2. Inmediatamente después de cargar la mosca en el compartimento inferior, inicie un temporizador de 1 minuto y un cronómetro.
   NOTA: El cronómetro se utiliza para medir latencias y contador para contar el número de choques.
3. Presione el cronómetro para registrar la primera latencia cuando la mosca entra en el tubo de choque colocando todas las patas en la rejilla. Encienda el estimulador para administrar una descarga eléctrica a la mosca. Los parámetros de estimulación son 120 voltios, 1000 ms de duración, 1 pulso/s (PPS), duración del tren 2000 ms.
4. Administre choques adicionales si la mosca vuelve a entrar en el tubo de choque. Registre el número de choques recibidos durante un ensayo de 1 minuto con un contador de conteo o un contador basado en Arduino (consulte la Tabla de materiales). Si utiliza el contador basado en Arduino, siga los pasos a continuación.
   NOTA: Se puede utilizar un dispositivo opcional basado en Arduino AKM-007 (consulte la Tabla de materiales) para medir el tiempo, la latencia, el número de choques y la frecuencia y duración de los combates de aseo para cada animal presionando y soltando los botones correspondientes en el dispositivo. Los botones del dispositivo se asignan para medir la latencia, administrar y registrar el número de choques y medir la frecuencia y la duración de los combates de aseo.
   1. Pulse el botón Inicio en el paso 3.2., y pulse el botón Shock en el paso 3.3.
   2. Para registrar la duración de una pelea de aseo, presione el botón de aseo al comienzo de una pelea de aseo en el dispositivo y suelte este botón al final de la pelea de aseo.
      NOTA: Los combates de aseo se midieron a lo largo de 1 minuto de prueba. El aseo extensivo podría ser indicativo de estrés ^animal21,22. El dispositivo basado en Arduino guarda todos los datos como archivo CSV en una tarjeta de memoria.
5. Al final de una prueba de 1 minuto, transfiera suavemente la mosca a un vial individual. Anote la latencia, el número de choques recibidos y cualquier cambio notable en el comportamiento.
6. Limpie el compartimento inferior y el compartimento de choque con etanol al 70%, limpie con un pañuelo de limpieza sin pelusa (consulte la Tabla de materiales) y séquelo con el secador de pelo. Repita la prueba con la siguiente mosca.
7. Después de los experimentos de comportamiento, limpie el compartimiento inferior con agua y detergente inodoro. Limpie el compartimento inferior y el compartimento de choque con etanol al 70% y séquelo al aire durante la noche.

4. Realización del segundo ensayo

1. Realice el segundo ensayo repitiendo el procedimiento descrito anteriormente (paso 3) 24 h más tarde. Pruebe las moscas en la misma secuencia que en el día anterior.

5. Análisis de los resultados

1. Calcule la latencia promedio, el número promedio de choques y la duración de los combates de aseo para el ensayo 1 y el ensayo 2 para cada grupo experimental de animales. Realizar la prueba t de student para la comparación de dos grupos o ANOVA para comparaciones múltiples con análisis post-hoc utilizando la prueba de ^Tukey23.

Resultados

La evitación pasiva se estudió en D. melanogaster (Cantón-S) y D. simulans. Los experimentos compararon las latencias y el número de shocks recibidos entre ensayos consecutivos. Inicialmente, los experimentos se realizaron con moscas macho D. melanogaster de 3-4 días de edad. Las moscas se mantuvieron en la dieta estándar de formulación de Bloomington en un ambiente climatizado a 24 ° C bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12 h, 70% de humedad y densidad de población controlada. ...

Discusión

Evitar los estímulos amenazantes es una característica crucial del comportamiento adaptativo en varias especies, desde C. elegancia hasta ^humana32. Los procedimientos de aprendizaje de evitación, que generalmente implican el escape de un evento aversivo, son tareas conductuales comúnmente utilizadas para investigar los procesos de aprendizaje y memoria en roedores de ^{laboratorio13} desde la década de 197032. En los procedimientos de evit...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bloomington Formulation diet	Nutri-Fly	66-112	Available from Genesee Scientific Inc., San Diego, CA
1000 µL Blue tip	Fisher	NC9546243
17 x 100 mm 14 mL polypropylene culture tube	VWR	60818-689
Aduino-based Automatic Kontrol Module	In-house	AKM-007	This unit is optional. Complete description, schematics, wiring diagram and a code are provided at the ECU Digital Market - https://digitalmarket.ecu.edu/akmmodule
Dual-Display 2-Channel  Digital Clock/Timer	Digi-Sense	AO-94440-10	https://www.amazon.com/Cole-Parmer-AO-94440-10-Dual-Display-2-Channel-Jumbo-Digit/dp/B00PR0809G/ref=sr_1_5?dchild=1&keywords=Dual-Display+timer+jumbo&qid=1627660660&sr= 8-5#customerReviews
Electronic Finger Counter	N/A	N/A	https://www.amazon.com/gp/product/B01M8IRK6F/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
Fisherbrand Sparkleen 1 Detergent	Fisher Scientific	04-320-4
Fly mouth aspirator	In-house		Prepared as described in reference 19.
Grass S88 stimulator	N/A	N/A	Could be replaced with any stimulator which can provide described parameters
Kim-wipes	Fisher Scientific	06-666	Kimberly-Clark Professional 34120
Metal block for fly immobilization	In-house		4 x 13 x 23.5cm aluminum block
Nutiva USDA Certified Organic, non-GMO, Red Palm Oil	Nutiva	N/A	https://www.amazon.com/Nutiva-Certified-Cold-Filtered-Unrefined-Ecuadorian/dp/B00JJ1E83G/ref=sxts_rp_s1_0?cv_ct_cx=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&dchild=1&keywords=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&pd_rd_i=B00JJ1E83G&pd_ rd_r=f35e9d2f-afe4-44b6-afc2-1c9cd705be18&pd_rd_w= R3Zb4&pd_rd_wg=eUv1m&pf_rd_ p=c6bde456-f877-4246-800f-44405f638777&pf _rd_r=M94N11RC7NH333EMJ66Y &psc=1&qid=1627661533&sr=1-1-f0029781-b79b-4b60-9cb0-eeda4dea34d6
Shock tube	CelExplorer	TMA-201	https://www.celexplorer.com/product_detail.asp?id=217&MainType=110&SubType=8
Stopwatch	Accusplit	A601XLN	https://www.amazon.com/gp/product/B0007ZGZYI/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
Transparent vinyl tubing (3/4” OD, 5/8” ID)	Lowes		Avaiable from Lowes