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要約

この研究は、成体果実ハエにおける回避的な連想学習の分析を可能にする単純な行動パラダイムを記述する。この方法は、特定の環境コンテキストと感電との間に形成された関連付けによる自然負のジオタキシス行動を抑制することに基づいています。

要約

このプロトコルは、成体ハエ(ショウジョウバエメラノガスター)における回避的な連想学習を分析するための新しいパラダイムを記述する。パラダイムは、動物が以前に感電を受けたコンパートメントを避けることを学ぶ実験室げっ歯類の受動的回避行動に似ています。このアッセイは、ハエの負のジオタキシスを利用しており、垂直表面に置かれたときに登りたいという衝動として現れます。セットアップは縦方向の上下のコンパートメントから成っている。最初の試験では、ハエは通常3〜15 s以内に出る下のコンパートメントに置かれ、電気ショックを受ける上部コンパートメントに足を踏み入れます。2 回目の試行の 24 時間後に、待機時間が大幅に増加します。同時に、衝撃の数は、最初の試験と比較して減少し、ハエが上部コンパートメントに関する長期記憶を形成したことを示す。待ち時間とショックの数の記録は、タリーカウンターとストップウォッチ、またはArduinoベースのシンプルなデバイスで行うことができます。アッセイがどのように使用できるかを説明するために、 D.メラノガスターとD . シミュランの 受動的回避挙動をここで特徴付けた。待ち時間とショック数の比較により、 D.メラノガスターとD . シミュランの 両方がパッシブ回避行動を効率的に学んだことが明らかになった。オスとメスのハエの間に統計的な違いは認められなかった。しかし、男性は最初の試験で上部コンパートメントに入っている間に少し速かったが、女性はすべての保持試験でわずかに多くのショックを受けた。西洋の食事(WD)は、飛行運動がこの効果を相殺しながら、男性のハエの学習と記憶を著しく損なった。ハエの受動的回避行動は、学習と記憶の基本的なメカニズムを研究するために使用できるシンプルで再現可能なアッセイを提供します。

概要

学習と記憶は、ショウジョウバエ(D.)からヒト1に保存された、環境への進化的に古代の適応メカニズムである。フルーツフライは、本質的な分子メカニズムを解剖するための強力な遺伝的ツールの広い範囲を提供しているので、学習と記憶の基本的な原則を研究するための堅牢なモデル生物です2。学習と記憶に不可欠なrutabaga3、健忘4、dunce5遺伝子を同定した先駆的な遺伝子スクリーニング研究は、フルーツハエが食べ物、潜在的な仲間を見つけ、捕食者を避けるために鋭い嗅覚に依存しているので、嗅覚コンディショニングを利用しました6。

学びと記憶のメカニズムを研究する嗅覚コンディショニングは、タリーとQuinn7,8による嗅覚T迷路の導入のおかげで、人気のパラダイムとなっています。続いて、視覚調節9、求愛コンディショニング10、回避光タクシー抑制アッセイ11、およびスズバチ露光調節12を含む様々なタイプの学習および記憶を測定する他の方法が提案されている。しかし、これらのアッセイのほとんどは、大学のワークショップでカスタム構築するか、ベンダーを通じて購入しなければならない複雑なセットアップを持っています。ここで説明するパラダイムは、いくつかの利用可能な供給で簡単に組み立てることができるハエの回避的な連想学習を研究するための単純な行動アッセイに基づいています。

説明されたパラダイムは、動物が以前に電気足の衝撃を受けたコンパートメントを避けることを学ぶ実験室のマウスおよびラットにおける受動的(または抑制的)回避行動に相当する。ムリドでは、手順は、明るい光の生来の回避と暗い領域14の好みに基づいています。最初の試験では、動物は明るいコンパートメントに入れられ、そこから動物はすぐに出て行き、暗いコンパートメントに足を踏み入れ、そこで電気足のショックが送達されます。通常、単一の試験は、固体長期記憶を形成するのに十分であり、その結果、24時間後に大幅に増加した待ち時間をもたらす。遅延は、その後、回避刺激と特定の環境15との間の関連を記憶する動物の能力の指標として使用されます。

この研究は、費用対効果、より大きなサンプルサイズ、規制監督の欠如、強力な遺伝的ツールへのアクセスを含むげっ歯類モデルよりもいくつかの利点を提供するモデルシステムとしてD.を使用して同様の手順を記述します16,17。この手順は、垂直表面に置かれたときに上昇したいというハエの衝動に現れる負のジオタキシスの挙動に基づいています18。セットアップは2つの縦の部屋から成っている。最初の試験では、フルーツフライは、より低いコンパートメントに配置されます。そこから、通常は3〜15s以内に出て、電気ショックを受ける上部コンパートメントに足を踏み入れます。1分の試験中に、いくつかのハエが時折上部コンパートメントに再入り、追加の感電をもたらす可能性があります。テストフェーズでは、24時間後、遅延が大幅に増加します。同時に、衝撃の数は、ハエが上部コンパートメントに関する回避的な連想記憶を形成したことを示す最初の日に比べて減少する。待ち時間、衝撃の数、およびグルーミングバウトの持続時間と頻度は、動物の行動と、回避刺激と特定の環境との関連を形成し、記憶する能力を分析するために使用されます。代表的な結果は、西洋の食事(WD)への暴露が雄のハエの受動的回避行動を著しく損なうことを明らかにし、WDがハエの行動および認知に大きな影響を与えることを示唆している。逆に、飛行運動はWDの悪影響を緩和し、受動回避行動を改善した。

プロトコル

1. 受動回避装置の準備

  1. 14 mL ポリプロピレン培養チューブの壁面に垂直な 4 mm の穴を開け、チューブ底部から 8 mm 離れたところにドリルします。
    メモ:最良の結果を得るには、電動ドリルと5/32ドリルビットを使用してください。
  2. 鋼製のユーティリティナイフを使用して、14 mLポリプロピレン培養チューブの上部を切断し、長さ45mmのチューブ底部を作成します。下の断片は、下部のコンパートメントとして機能します。
  3. 単一のエッジカミソリブレードを使用して1,000 μLの青いピペットチップの先端を切り取り、開口部を単一のフライの通過に十分な幅にします。青い先端の狭い部分を切り取って、12mmの断片を作成します。この断片を下の区画の4mm穴にしっかりと差し込みます。これはハエを移すための積み込みドックとして使用されます。
  4. 15mm透明なビニールチューブ5/8"ID( 材料表を参照)をカットしてカップリングを作成します。反対側の端からカップリングに上側と下側のコンパートメントを挿入し、下部コンパートメントを上部のコンパートメントにしっかりと取り付けます。
  5. 2本の調整可能なクランプを使用して、アセンブリを垂直スタンドに取り付けます。上部コンパートメントとしてショックチューブを使用してアセンブリを垂直方向に向けます。
  6. ショックチューブワイヤを電気刺激装置( 材料表参照)に接続して、感電を引き起こす。トレーニング期間は1分です。
    注:観察を容易にするために、ショックチューブの後ろに白い紙を置いて、装置の白い背景として機能させます。ショックコンパートメントの上に75 W相当のソフト電球を備えたランプを置きます。セットアップの前に、調節可能な腕の拡大鏡ランプを置きます。パッシブ回避装置の表現を 図1に示す。

2. 受動回避手順のためのハエの準備

  1. 3-4日齢 のD.メラノガスター または D.シミュラン は氷冷ブロックを使用して飛び、実験の24時間前に食品24時間(バイアルあたり1飛ぶ)を持つ個々のバイアルに移す前に、以前に説明した手順19に従う。
    注:ここで説明した実験は、3-4日齢の男性 対を比較しました。 D.メラノガスターとD . シミュランで雌のハエ。
  2. 行動実験の前に、すべてのバイアルをコーディングします。このためには、各グループに文字を割り当てます(例えば、「A」、「B」、「C」など)、各フライは数字です。すべてのデータが記録され、分析された後にのみ、このコードを明らかにする。個々の変動に対抗するために、遺伝子型または治療ごとに少なくとも20ハエを使用してください。
    注: 実験と「ブラインド」解析を実行すると、フライとデータ分析のパフォーマンスを評価する際の偏りは除外されます。

3. 最初のトライアルを実施する

  1. 前に説明したフライマウス吸引器(材料表を参照)を使用して、個々のバイアルからローディングドックを介して下側コンパートメントにハエをそっと移します。空気を吸って口のアスピレーターに1つのフライをそっと吸う。軽く装填ドックに吹き込んでフライを堆積します。
    注:キャッチとロード中に動物にストレスを与えないようにしてください。
  2. フライが下のコンパートメントにロードされた直後に、1分タイマーとストップウォッチを開始します。
    注: ストップウォッチは、遅延を測定し、ショックの数をカウントする集計カウンターに使用されます。
  3. ストップウォッチを押すと、フライがショックチューブに入ったときに、グリッド上にすべての足を配置して最初の待ち時間を記録します。刺激装置をオンにして、フライに感電を与えます。刺激パラメータは120ボルト、1000 msの持続時間、1パルス/秒(PPS)、トレーニング所要時間2000 msです。
  4. フライが衝撃管に再入りした場合、追加の衝撃を与えます。1分のトライアル中に、集計カウンターまたはArduinoベースのカウンターで受けた衝撃の数を記録 します(資料表を参照)。Arduinoベースのカウンターをご利用の場合は、以下の手順に従ってください。
    メモ:オプションのArduinoベースのデバイスAKM-007( 資料表を参照)は、デバイス上の対応するボタンを押して解放することにより、各動物の時間、遅延、衝撃の数、およびグルーミングの頻度と持続時間を測定するために使用することができます。デバイスのボタンは、遅延を測定し、ショックの数を管理および記録し、グルーミングの頻度と持続時間を測定するために割り当てられます。
    1. ステップ3.2.で スタート ボタンを押し、ステップ3.3で Shock ボタンを押します。
    2. グルーミングバウトの継続時間を記録するには、デバイスの グルーミング バウトの最初にある[グルーミング]ボタンを押し、グルーミングバウトの最後にこのボタンを放します。
      注:グルーミングの試合は1分の試験を通して測定されました。広範なグルーミングは、動物のストレス21,22を示す可能性があります。Arduino ベースのデバイスは、すべてのデータを CSV ファイルとしてメモリ カードに保存します。
  5. 1分のトライアルの終わりに、ハエを個々のバイアルにそっと戻します。遅延、受け取ったショックの数、および動作の顕著な変更を書き留めください。
  6. 70%エタノールで下側とショックコンパートメントを洗浄し、糸くずのない洗浄ティッシュ( 材料表を参照)で拭き取り、ヘアドライヤーで乾燥させます。次のフライでトライアルを繰り返します。
  7. 行動実験の後、水と無臭の洗剤で下のコンパートメントを清掃してください。下部コンパートメントとショックコンパートメントを70%エタノールで拭き取り、一晩で空気乾燥します。

4. 第2のトライアルを実施する

  1. 上記の手順を繰り返して第2の試用を行う(ステップ3)24時間後。前日と同じ順序でハエをテストします。

5. 結果の分析

  1. 動物の実験グループごとに、試験1と試験2の平均待ち時間、衝撃の平均回数、およびグルーミングバウトの持続時間を計算します。Tukeyのtest23を使用して、ポストホック分析との複数比較のために、2グループ比較またはANOVAのための学生t検定を実行します。

結果

受動回避は 、D.メラノガスター (カントン-S)および Dで研究された。 シミュラン。実験では、連続した試験の間に受けたショックの待ち時間と数を比較しました。当初、実験は3-4日齢の雄 のD.メラノガスター ハエで行われた。ハエは、12時間の明暗サイクル、70%の湿度、および制御された人口密度の下で24°Cの気候制御環境で標準的なブルーミントン製剤ダイエット...

ディスカッション

C.エレガンスからヒト32までの様々な種における適応行動の重要な特徴である、 脅迫的な刺激の回避。回避学習手順は、通常、回避イベントのエスケープを伴う、一般的に1970年代の32以来、実験室げっ歯類13の学習と記憶プロセスを調査するために行動タスクを使用されます。アクティブな回避手順では、無関心な刺激または条件付...

開示事項

著者らは利益相反を宣言しない。

謝辞

この研究は、NIH R15ES029673(AKM)によって部分的にサポートされました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Bloomington Formulation dietNutri-Fly 66-112Available from Genesee Scientific Inc., San Diego, CA
1000 µL Blue tipFisherNC9546243
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