초파리 연관적 역경 학습을 연구하는 새로운 패러다임으로서의 수동적인 회피 행동

요약

이 작품은 성인 과일 파리에서 역경 연관 학습의 분석을 허용하는 간단한 행동 패러다임을 설명합니다. 이 방법은 특정 환경 적 맥락과 감전 사이에 형성된 협회로 인해 타고난 음극식 행동을 억제하는 데 기반을 두고 있습니다.

초록

이 프로토콜은 성인 파리의 회선 적 연관 학습을 분석하기위한 새로운 패러다임을 설명합니다 (Drosophila melanogaster). 패러다임은 동물이 이전에 감전을 받은 구획을 피하는 법을 배우는 실험실 설치류의 수동 회피 행동과 유사합니다. 분석법은 파리의 부정적인 지질세를 이용하며, 이는 수직 표면에 배치될 때 올라가려는 충동으로 나타납니다. 설정은 수직 지향 상부 및 하부 구획으로 구성됩니다. 첫 번째 시험에서 비행은 보통 3-15 s 이내에 나가는 낮은 구획에 배치되고 전기 충격을 받는 상부 구획으로 단계입니다. 두 번째 시험 동안, 24 시간 후, 대기 시간이 크게 증가한다. 동시에, 충격의 수는 상부 구획에 관하여 연장 기억을 형성했다는 것을 나타내는 첫번째 예심에 비해 감소됩니다. 집계 카운터와 스톱워치 또는 Arduino 기반의 간단한 장치로 대기 시간 및 충격 횟수를 기록할 수 있습니다. 분석법을 어떻게 사용할 수 있는지 설명하기 위해 , D. 멜라노가스터 와 D. 시뮬란스의 수동 회피 행동은 여기에서 특징지어졌습니다. 늦은 시간과 충격의 수를 비교하는 것은 D. 멜라노가스터 와 D. 시뮬란 모두 수동 회피 행동을 효율적으로 배운 것으로 나타났습니다. 남성과 여성 파리 사이에 통계적 차이가 관찰되지 않았습니다. 그러나, 남성은 첫 번째 재판에 상부 구획을 입력 하는 동안 조금 더 빨랐다, 여성 모든 보존 재판에서 충격의 약간 높은 수를 받은 동안. 서양 식단 (WD)은 비행 운동이이 효과를 균형 조정하는 동안 남성 파리의 학습과 기억을 크게 손상시켰습니다. 함께 촬영, 파리의 수동 회피 행동은 학습과 기억의 기본 메커니즘을 공부하는 데 사용할 수있는 간단하고 재현 가능한 분석법을 제공합니다.

서문

학습과 기억은 드로소필라(D.)에서 인간¹에 이르는 환경에 대한 진화적으로 고대의 적응 메커니즘입니다. 과일 비행은 본질적인 분자 기계장치를 해부하기 위하여 강력한 유전 공구의 넓은 범위를 제공하기 때문에 학습과 기억의 근본적인 원리를 공부하는 강력한 모형 유기체입니다². rutabaga3, 기억 상실^{4 및 기억에 중요한} dunce5 유전자를 확인한 선구적인 유전자 선별 연구는 과일 파리가 음식, 잠재적 인 동료를 찾고 육식 동물을 피하기 위해 예리한 냄새 감각에 의존함에 따라 후각 컨디셔닝을 ^{이용했습니다.}

후각 컨디셔닝은 툴리와 퀸^7,8에 의해 후각 T-미로의 도입 덕분에 학습과 기억의 메커니즘을 연구하는 인기있는 패러다임이되었다. 그 후, 시각적 컨디셔닝⁹, 구애 컨디셔닝¹⁰, 역경 광탁 억제 분석 분석¹¹, 말살 ^{노출 컨디}셔닝 등 다양한 유형의 학습 및 메모리를 측정하는 다른 방법이 제안되었습니다. 그러나 이러한 애서의 대부분은 대학 워크샵에서 사용자 정의 구축하거나 공급 업체를 통해 구입해야하는 복잡한 설정이 있습니다. 여기에 설명된 패러다임은 몇 가지 사용 가능한 소모품으로 쉽게 조립할 수 있는 파리의 역경 적 연관 학습을 연구하는 간단한 행동 적 분석법을 기반으로합니다.

설명된 패러다임은 동물이 이전에 전기 발 ^shock13을 받은 구획을 피하는 법을 배우는 실험실 마우스 및 쥐의 수동 (또는 억제) 회피 행동과 동일합니다. murids에서, 절차는 밝은 빛의 타고난 회피와 어두운 영역에 대한 선호^{에 기초한다14}. 첫 번째 시험에서 동물은 동물이 빠르게 빠져 나가는 밝은 구획에 배치되어 전기 발 충격이 전달되는 어두운 칸으로 들어갑니다. 일반적으로 단일 평가판은 고체 장기 메모리를 형성하기에 충분하므로 대기 시간이 24시간 후에 크게 증가합니다. 대기 시간은 다음 역경 자극과 특정 환경 사이의 연관성을 기억하는 동물의 능력의 인덱스로 사용^된다15.

이 작품은 비용 효율성, 더 큰 샘플 크기, 규제 감독의 부재 및 강력한 유전 도구에 대한 액세스를 포함하여 설치류 모델에 비해 몇 가지 이점을 제공하는 모델 시스템으로 D.를 사용하는 유사한 절차를 설명합니다^16,17. 절차는 부정적인 지질 택시 행동을 기반으로, 이는 그들이 수직 표면에 배치 될 때 상승 파리의 충동에 명시¹⁸. 설정은 두 개의 수직 챔버로 구성됩니다. 첫 번째 시험에서는 과일 파리를 하부 구획에 배치합니다. 거기에서, 그것은 일반적으로 3-15 s 이내에 종료, 그것은 감전을 수신 하는 상부 구획에 스테핑. 1분 시험 중에 일부 파리는 때때로 상부 구획에 다시 들어갈 수 있으며, 이로 인해 추가적인 감전이 발생할 수 있습니다. 테스트 단계 동안, 24 시간 후, 대기 시간이 크게 증가된다. 동시에, 충격의 수는 파리가 상부 구획에 대한 역경 연관 메모리를 형성것을 나타내는 첫날에 비해 감소된다. 대기 시간, 충격 수 및 그루밍 시합의 지속 시간 및 빈도는 동물 행동과 역경 자극과 특정 환경 사이의 연관성을 형성하고 기억하는 능력을 분석하는 데 사용됩니다. 대표적인 결과는 서양 규정식 (WD)에 노출이 크게 수컷 파리의 수동 회피 행동을 손상한다는 것을 보여줍니다, WD가 심오하게 비행의 행동과 인식에 영향을 미친다는 것을 건의합니다. 반대로, 비행 운동은 WD의 부정적인 효과를 완화하여 수동 회피 행동을 개선했습니다.

프로토콜

1. 수동 회피 장치의 준비

1. 14mL 폴리프로필렌 배양튜브의 벽면에 수직으로 4mm 구멍을 뚫고 튜브 바닥에서 8mm 떨어진 곳에 드릴한다.
   참고: 최상의 결과를 위해 전기 드릴과 5/32 드릴 비트를 사용합니다.
2. 강철 유틸리티 나이프를 사용하여 14mL 폴리프로필렌 배양 튜브의 상부를 잘라 45mm 길이의 튜브 바닥 조각을 생성합니다. 아래쪽 조각은 하부 구획역할을 합니다.
3. 단일 가장자리 면도날을 사용하여 1,000 μL 블루 파이펫 팁의 끝을 잘라 하나의 비행의 통과를 위해 충분히 넓은 개방을 합니다. 파란색 팁의 좁히는 부분을 잘라 12mm 조각을 만듭니다. 이 조각을 하부 구획의 4mm 구멍에 단단히 삽입합니다. 이 는 파리 전송을 위한 로딩 도크로 사용됩니다.
4. 투명 비닐 튜브 5/8" ID( 재료 표 참조)의 15mm 조각을 잘라 커플링을 만듭니다. 상하 구획을 반대쪽 끝에서 커플링에 삽입하여 아래 칸을 상부 구획에 단단히 부착합니다.
5. 2-갈래 조절 식 클램프를 사용하여 어셈블리를 수직 스탠드에 부착합니다. 상부 구획으로 충격 튜브와 수직으로 조립을 방향을 지정합니다.
6. 충격 튜브 와이어를 전기 자극기( 재료 표 참조)에 연결하여 감전을 전달합니다. 훈련 기간은 1분입니다.
   참고: 관찰을 용이하게 하기 위해 충격관 뒤에 백서를 배치하여 장치의 흰색 배경역할을 한다. 충격 구획 위에 75W와 동등한 부드러운 전구가 있는 램프를 놓습니다. 설정 앞에 조절 가능한 암 돋보기 램프를 놓습니다. 수동 회피 장치의 표현은 도 1에 도시된다.

2. 수동 회피 절차에 대한 파리의 준비

1. 3-4일 된 D. 멜라노가스터 또는 D. 시뮬란스는 얼음-차가운 블록을 사용하여 비행^{하여 이전에 설명}한 절차에 따라 실험(유리병 당 1플라이)을 하기 전에 24시간 동안 음식으로 개별 바이알로 이송합니다.
   참고 : 여기에 설명 된 실험은 3-4 일 된 남성 대 비교했습니다. 암컷은 D. 멜라노가스터 와 디 시뮬란에서 날아간다.
2. 행동 실험 전에 모든 바이알을 코딩합니다. 이를 위해 각 그룹에 "A", "B", "C" 등과 같은 문자를 할당하고 각 그룹은 숫자를 비행합니다. 모든 데이터가 기록되고 분석된 후에만 이 코드를 표시합니다. 유전자형 또는 치료당 적어도 20파리를 사용하여 개별적인 변이에 대응하십시오.
   참고: 실험 및 분석 "블라인드"를 수행하면 플라이 및 데이터 분석의 성능을 평가하는 데 편향을 제외할 수 있습니다.

3. 첫 번째 시험 수행

1. ^{이전에 설명}한 플라이 입 흡자(재료 표 참조)를 사용하여 개별 바이알에서 하중 도크를 통해 하부 구획으로 부드럽게 이송합니다. 공기를 빨아 입 흡입기로 부드럽게 한 비행을 빨아. 로딩 도크에 가볍게 불어 비행을 입금합니다.
   참고: 잡기 및 적재 중에 동물을 강조하지 마십시오.
2. 비행이 하부 구획에 적재된 직후 1분 타이머와 스톱워치를 시작합니다.
   참고: 스톱워치는 충격 수를 계산하기 위해 대기 시간 및 집계 카운터를 측정하는 데 사용됩니다.
3. 스톱워치를 눌러 플라이가 충격 튜브에 들어갈 때 모든 발을 격자에 배치하여 첫 번째 대기 시간을 기록합니다. 자극기를 켜서 즉석에서 감전을 전달합니다. 자극 매개 변수는 120 볼트, 1000 ms 지속 시간, 1 펄스 / s (PPS), 기차 기간 2000 ms입니다.
4. 비행이 충격 튜브에 다시 들어가면 추가 충격을 전달합니다. 탈리 카운터 또는 Arduino 기반 카운터로 1분 간의 시험 에서 받은 충격 수를 기록 합니다(재료 표 참조). 아두이노 기반 카운터를 사용하는 경우 아래 단계를 따르십시오.
   참고: 옵션 Arduino 기반 장치 AKM-007( 재료 표 참조)을 사용하여 장치의 해당 버튼을 누르고 해제하여 각 동물에 대한 시간, 대기 시간, 충격 수 및 그루밍 시합의 빈도 및 지속 시간을 측정할 수 있습니다. 장치의 단추는 대기 시간을 측정하고, 충격 수를 관리하고 기록하고, 그루밍 시합의 빈도와 지속 시간을 측정하도록 할당됩니다.
   1. 3.2단계에서 시작 버튼을 누르고 3.3단계에서 충격 버튼을 누릅니다.
   2. 그루밍 시합의 지속 시간을 기록하려면 장치에서 그루밍 시합이 시작될 때 그루 밍 버튼을 누르고 그루밍 시합이 끝날 때이 버튼을 놓습니다.
      참고 : 그루밍 시합은 1 분 시험 내내 측정되었습니다. 광범위한 그루밍은 동물 스트레스를 나타낼 수 ^{있습니다21,22}. Arduino 기반 장치는 모든 데이터를 CSV 파일로 메모리 카드에 저장합니다.
5. 1분 시험이 끝나면 플라이를 개별 바이알로 부드럽게 옮기십시오. 대기 시간, 수신된 충격 수 및 동작의 주목할 만한 변경 사항을 적어 둡니다.
6. 70% 에탄올로 하부 및 충격 구획을 청소하고, 보풀이 없는 청소 조직( 재료 표 참조)으로 닦고, 헤어드라이어로 건조시킵니다. 다음 비행으로 재판을 반복합니다.
7. 행동 실험 후, 물과 무취 세제로 하부 구획을 청소하십시오. 낮은 구획과 충격 구획을 70% 에탄올로 닦고 밤새 공기 건조를 합니다.

4. 두 번째 시험 수행

1. 상기(3단계) 24시간 후에 설명한 절차를 반복하여 두 번째 시험을 수행한다. 전날과 동일한 순서로 파리를 테스트합니다.

5. 결과 분석

1. 실험 1 및 실험 용 실험 1 및 예심 2의 평균 대기 시간, 평균 충격 수 및 그루밍 시합 의 기간을 계산합니다. Tukey의 ^test23을 사용하여 후hoc 분석과 여러 비교를 위해 2그룹 비교 또는 ANOVA에 대한 학생 t-테스트를 수행합니다.

결과

수동적 회피는 D. 멜라노가스터 (캔톤-S)와 D에서 연구되었다. 시뮬란. 실험은 연속적인 시험 사이 수신된 충격의 대기 시간 및 수를 비교했습니다. 처음에, 실험은 3-4 일 오래된 남성 D. 멜라노가스터 파리로 수행되었다. 파리는 12h 의 밝은 어두운 주기, 70 % 습도 및 통제 된 인구 밀도하에서 24 °C에서 기후 조절 환경에서 표준 블루밍턴 제형 식단에서 유지되었습니다. 밀?...

토론

위협적인 자극의 회피는 C. 우아함 에서 인간³²에 이르기까지 다양한 종의 적응 행동의 중요한 특성입니다. 일반적으로 역경 이벤트의 탈출을 수반 회피 학습 절차는 일반적으로 1970 년대 이후 실험실 설치류¹³ 에서 학습 및 메모리 프로세스를 조사하기 위해 동작 작업을 사용한다³². 활성 회피 절차에서, 무관심 자극 또는 조건된 신호 (CS...

자료

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