Drosophila Passives Vermeidungsverhalten als neues Paradigma zur Untersuchung assoziativen aversiven Lernens

Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt ein einfaches Verhaltensparadigma, das die Analyse des aversiven assoziativen Lernens bei erwachsenen Fruchtfliegen ermöglicht. Die Methode basiert auf der Unterdrückung des angeborenen negativen Geotaxis-Verhaltens aufgrund der Assoziation zwischen einem bestimmten Umweltkontext und einem elektrischen Schlag.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein neues Paradigma zur Analyse des aversiven assoziativen Lernens bei erwachsenen Fliegen (Drosophila melanogaster). Das Paradigma ist analog zum passiven Vermeidungsverhalten bei Labornagetieren, bei dem Tiere lernen, ein Kompartiment zu meiden, in dem sie zuvor einen elektrischen Schlag erhalten haben. Der Assay nutzt die negative Geotaxis bei Fliegen, die sich als Drang nach oben manifestiert, wenn sie auf einer vertikalen Oberfläche platziert werden. Das Setup besteht aus vertikal ausgerichteten oberen und unteren Fächern. Beim ersten Versuch wird eine Fliege in ein unteres Fach gelegt, aus dem sie normalerweise innerhalb von 3-15 s austritt, und tritt in das obere Fach, wo sie einen elektrischen Schlag erhält. Während des zweiten Versuchs, 24 h später, wird die Latenz deutlich erhöht. Gleichzeitig ist die Anzahl der Schocks im Vergleich zum ersten Versuch verringert, was darauf hindeutet, dass Fliegen ein Langzeitgedächtnis über das obere Kompartiment bildeten. Die Aufzeichnungen von Latenzen und Anzahl der Schocks könnten mit einem Zähler und einer Stoppuhr oder mit einem Arduino-basierten einfachen Gerät durchgeführt werden. Um zu veranschaulichen, wie der Assay eingesetzt werden kann, wurde hier das passive Vermeidungsverhalten von D. melanogaster und D. simulans männlich und weiblich charakterisiert. Der Vergleich der Latenzen und der Anzahl der Schocks ergab, dass sowohl D. melanogaster als auch D. simulans Fliegen das passive Vermeidungsverhalten effizient erlernten. Es wurden keine statistischen Unterschiede zwischen männlichen und weiblichen Fliegen beobachtet. Die Männchen waren jedoch beim Betreten des oberen Kompartiments im ersten Versuch etwas schneller, während die Weibchen in jedem Retentionsversuch eine etwas höhere Anzahl von Schocks erhielten. Die westliche Ernährung (WD) beeinträchtigte das Lernen und Das Gedächtnis bei männlichen Fliegen signifikant, während Flugübungen diesen Effekt ausgleichten. Zusammengenommen bietet das passive Vermeidungsverhalten bei Fliegen einen einfachen und reproduzierbaren Assay, mit dem grundlegende Mechanismen des Lernens und des Gedächtnisses untersucht werden können.

Einleitung

Lernen und Gedächtnis ist ein evolutionär alter Anpassungsmechanismus an die Umwelt, der von Drosophila (D.) bis zum Menschen erhalten ^bleibt1. Die Fruchtfliege ist ein robuster Modellorganismus zur Untersuchung grundlegender Prinzipien des Lernens und des Gedächtnisses, da sie eine breite Palette leistungsstarker genetischer Werkzeuge zur Verfügung stellt, um intrinsische molekulare Mechanismen zu sezieren2. Die bahnbrechenden genetischen Screening-Studien, die Rutabaga3-, Amnesie4- und Dunce5-Gene identifizierten, die für Lernen und Gedächtnis entscheidend ^sind2, nutzten die olfaktorische Konditionierung, da die Fruchtfliegen auf ihren scharfen Geruchssinn angewiesen sind, um Nahrung und potenzielle Partner zu finden und Raubtiere zu ^vermeiden6.

Die olfaktorische Konditionierung ist dank der Einführung des olfaktorischen T-Labyrinths durch Tully und Quinn zu einem beliebten Paradigma geworden, um den Mechanismus des Lernens und des Gedächtnisses zu ^{untersuchen7,8}. Anschließend wurden andere Methoden zur Messung verschiedener Arten von Lernen und Gedächtnis vorgeschlagen, darunter visuelle ^{Konditionierung9}, Balzkonditionierung10, aversiver Phototaxis-Suppressionsassay11 und Wespenexpositionskonditionierung12. Die meisten dieser Assays haben jedoch ein komplexes Setup, das in einer Universitätswerkstatt speziell angefertigt oder über einen Anbieter erworben werden muss. Das hier beschriebene Paradigma basiert auf einem einfachen Verhaltenstest zur Untersuchung des aversiven assoziativen Lernens bei Fliegen, das mit wenigen verfügbaren Vorräten leicht zusammengesetzt werden kann.

Das beschriebene Paradigma entspricht dem passiven (oder hemmenden) Vermeidungsverhalten bei Labormäusen und Ratten, bei dem Tiere lernen, ein Kompartiment zu meiden, in dem sie zuvor einen elektrischen Fußschock erhalten ^haben13. Bei Muriden basiert das Verfahren auf ihrer angeborenen Vermeidung von hellem Licht und der Vorliebe für dunklere ^Bereiche14. Beim ersten Versuch wird das Tier in das helle Kompartiment gebracht, aus dem das Tier schnell austritt und in ein dunkles Kompartiment tritt, wo ein elektrischer Fußschlag abgegeben wird. In der Regel reicht ein einziger Versuch aus, um ein solides Langzeitgedächtnis zu bilden, was 24 Stunden später zu einer deutlich erhöhten Latenz führt. Die Latenz wird dann als Index für die Fähigkeit des Tieres verwendet, sich an den Zusammenhang zwischen dem aversiven Reiz und der spezifischen Umgebung zu ^erinnern15.

Diese Arbeit beschreibt ein analoges Verfahren unter Verwendung von D. als Modellsystem, das mehrere Vorteile gegenüber Nagetiermodellen bietet, darunter Kosteneffizienz, größere Stichprobengröße, das Fehlen einer regulatorischen Aufsicht und zugang zu leistungsstarken genetischen Werkzeugen16,17. Das Verfahren basiert auf einem negativen Geotaxis-Verhalten, das sich im Drang der Fliegen äußert, nach oben zu klettern, wenn sie auf einer vertikalen Fläche platziert ^werden18. Der Aufbau besteht aus zwei vertikalen Kammern. Beim ersten Versuch wird eine Fruchtfliege in ein unteres Kompartiment gelegt. Von dort aus tritt es normalerweise innerhalb von 3-15 s aus und tritt in das obere Fach, wo es einen elektrischen Schlag erhält. Während eines 1-minütigen Versuchs können einige Fliegen gelegentlich wieder in das obere Kompartiment eindringen, was zu einem zusätzlichen elektrischen Schlag führt. Während der Testphase, 24 h später, wird die Latenz deutlich erhöht. Gleichzeitig ist die Anzahl der Schocks im Vergleich zum ersten Tag verringert, was darauf hindeutet, dass Fliegen ein aversives assoziatives Gedächtnis über das obere Kompartiment gebildet haben. Die Latenz, die Anzahl der Schocks sowie die Dauer und Häufigkeit der Pflegeanfälle werden dann verwendet, um das Verhalten des Tieres und die Fähigkeit zu analysieren, die Assoziation zwischen dem aversiven Reiz und der spezifischen Umgebung zu bilden und sich daran zu erinnern. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass die Exposition gegenüber der westlichen Ernährung (WD) das passive Vermeidungsverhalten bei männlichen Fliegen signifikant beeinträchtigt, was darauf hindeutet, dass die WD das Verhalten und die Kognition der Fliege tiefgreifend beeinflusst. Umgekehrt linderte die Flugübung den negativen Effekt der WD und verbesserte das passive Vermeidungsverhalten.

Protokoll

1. Herstellung eines passiven Vermeidungsapparates

1. Bohren Sie ein 4-mm-Loch senkrecht zur Wandoberfläche des 14-ml-Polypropylenkulturrohrs und 8 mm vom Rohrboden entfernt.
   HINWEIS: Verwenden Sie eine elektrische Bohrmaschine und einen 5/32-Bohrer für beste Ergebnisse.
2. Schneiden Sie mit einem Stahlwerkzeug den oberen Teil des 14 ml Polypropylen-Kulturrohrs ab, um ein 45 mm langes Rohrbodenfragment zu erzeugen. Das untere Fragment dient als unteres Fach.
3. Schneiden Sie die Spitze der 1.000 μL blauen Pipettenspitze mit einer einschneidigen Rasierklinge ab, um die Öffnung breit genug für den Durchgang einer einzelnen Fliege zu machen. Schneiden Sie den verengenden Teil der blauen Spitze ab, um ein 12-mm-Fragment zu erzeugen. Setzen Sie dieses Fragment fest in ein 4 mm großes Loch des unteren Fachs ein. Diese dient als Laderampe für den Transfer der Fliegen.
4. Schneiden Sie ein 15-mm-Stück transparenten Vinylschlauch 5/8 "ID (siehe Materialtabelle), um eine Kupplung zu erstellen. Setzen Sie das obere und untere Fach von gegenüberliegenden Enden in die Kupplung ein, um das untere Fach sicher am oberen Fach zu befestigen.
5. Befestigen Sie die Baugruppe mit einer verstellbaren Klemme mit 2 Stiften an einem vertikalen Ständer. Richten Sie die Baugruppe mit dem Stoßdämpferrohr als oberes Fach vertikal aus.
6. Verbinden Sie die Stoßrohrdrähte mit einem elektrischen Stimulator (siehe Materialtabelle), um elektrische Schläge abzugeben. Die Dauer der Ausbildungszeit beträgt 1 min.
   HINWEIS: Um die Beobachtung zu erleichtern, positionieren Sie ein weißes Blatt Papier hinter dem Schockrohr, das als weißer Hintergrund des Geräts dient. Stellen Sie eine Lampe mit einer 75 W äquivalenten weichen Glühbirne über das Schockfach. Platzieren Sie eine verstellbare Armlupenlampe vor dem Setup. Eine Darstellung der passiven Vermeidungsapparatur ist in Abbildung 1 dargestellt.

2. Vorbereitung der Fliegen auf das passive Vermeidungsverfahren

1. 3-4 Tage alte D. melanogaster- oder D. simulans-Fliegen mit eiskaltem Block immobilisieren und 24 h vor dem Experiment (1 Fliege pro Durchstechflasche) nach dem zuvor beschriebenen Verfahren in einzelne Fläschchen mit Nahrung überführen19.
   HINWEIS: Die hier beschriebenen Experimente verglichen 3-4 Tage alte Männer vs. weibliche Fliegen in D. melanogaster und D. simulans.
2. Codieren Sie vor den Verhaltensexperimenten alle Fläschchen. Weisen Sie dazu jeder Gruppe einen Buchstaben zu, zum Beispiel "A", "B", "C" usw., und fliegen Sie jeweils eine Zahl. Zeigen Sie diesen Code erst an, nachdem alle Daten aufgezeichnet und analysiert wurden. Verwenden Sie mindestens 20 Fliegen pro Genotyp oder Behandlung, um individuellen Variationen entgegenzuwirken.
   HINWEIS: Die "blinde" Durchführung der Experimente und Analysen ermöglicht es, eine Verzerrung bei der Beurteilung der Leistung der Fliege und der Datenanalyse auszuschließen.

3. Durchführung des ersten Versuchs

1. Mit einem zuvor beschriebenen Fliegenmaulsauger (siehe Materialtabelle20) wird eine Fliege vorsichtig von der einzelnen Durchstechflasche über die Laderampe in das untere Fach befördert. Saugen Sie vorsichtig eine Fliege in den Mundsauger, indem Sie Luft ansaugen. Legen Sie die Fliege ab, indem Sie leicht in die Laderampe blasen.
   HINWEIS: Vermeiden Sie es, das Tier beim Fangen und Verladen zu stressen.
2. Unmittelbar nachdem die Fliege in das untere Fach geladen wurde, starten Sie einen 1-minütigen Timer und eine Stoppuhr.
   HINWEIS: Die Stoppuhr wird verwendet, um Latenzen zu messen und den Zähler zu zählen, um die Anzahl der Schocks zu zählen.
3. Drücken Sie die Stoppuhr, um die erste Latenz aufzuzeichnen, wenn die Fliege in das Schockrohr eintritt, indem Sie alle Pfoten auf das Gitter legen. Schalten Sie den Stimulator ein, um der Fliege einen elektrischen Schlag zu versetzen. Die Stimulationsparameter sind 120 Volt, 1000 ms Dauer, 1 Puls/s (PPS), Zugdauer 2000 ms.
4. Liefern Sie zusätzliche Stöße, wenn die Fliege wieder in die Stoßdämpferröhre eintritt. Notieren Sie die Anzahl der erhaltenen Schocks während eines 1-minütigen Versuchs mit einem Zähler oder einem Arduino-basierten Zähler (siehe Materialtabelle). Wenn Sie den Arduino-basierten Zähler verwenden, führen Sie bitte die folgenden Schritte aus.
   HINWEIS: Ein optionales Arduino-basiertes Gerät AKM-007 (siehe Materialtabelle) kann verwendet werden, um Zeit, Latenz, die Anzahl der Stöße sowie die Häufigkeit und Dauer der Pflegekämpfe für jedes Tier zu messen, indem die entsprechenden Tasten auf dem Gerät gedrückt und losgelassen werden. Die Tasten auf dem Gerät sind zugewiesen, um die Latenz zu messen, die Anzahl der Schocks zu verwalten und aufzuzeichnen und die Häufigkeit und Dauer der Pflegekämpfe zu messen.
   1. Drücken Sie die Starttaste in Schritt 3.2. und die Shock-Taste in Schritt 3.3.
   2. Um die Dauer eines Grooming-Kampfes aufzuzeichnen, drücken Sie die Grooming-Taste zu Beginn eines Grooming-Kampfes auf dem Gerät und lassen Sie diese Taste am Ende des Grooming-Kampfes los.
      HINWEIS: Die Pflegeanfälle wurden während der gesamten 1-minütigen Studie gemessen. Umfangreiche Pflege könnte auf Tierstress ^{hinweisen21,22}. Das Arduino-basierte Gerät speichert alle Daten als CSV-Datei auf einer Speicherkarte.
5. Am Ende eines 1-minütigen Versuchs übertragen Sie die Fliege vorsichtig zurück in eine einzelne Durchstechflasche. Notieren Sie sich die Latenz, die Anzahl der empfangenen Schocks und alle bemerkenswerten Änderungen im Verhalten.
6. Reinigen Sie das untere und Stoßfach mit 70% Ethanol, wischen Sie es mit einem fusselfreien Reinigungstuch ab (siehe Materialtabelle) und trocknen Sie es mit dem Haartrockner ab. Wiederholen Sie den Versuch mit der nächsten Fliege.
7. Reinigen Sie nach den Verhaltensexperimenten das untere Fach mit Wasser und geruchlosem Reinigungsmittel. Wischen Sie das untere Fach und das Schockfach mit 70% Ethanol ab und trocknen Sie es über Nacht an der Luft.

4. Durchführung des zweiten Versuchs

1. Führen Sie den zweiten Versuch durch, indem Sie das oben beschriebene Verfahren (Schritt 3) 24 h später wiederholen. Testen Sie die Fliegen in der gleichen Reihenfolge wie am Vortag.

5. Analyse der Ergebnisse

1. Berechnen Sie die durchschnittliche Latenz, die durchschnittliche Anzahl der Schocks und die Dauer der Pflegekämpfe für Versuch 1 und Versuch 2 für jede Versuchsgruppe von Tieren. Führen Sie einen Schüler-T-Test für den Zwei-Gruppen-Vergleich oder eine ANOVA für mehrfache Vergleiche mit Post-hoc-Analysen mit Tukeys ^{Test23 durch}.

Ergebnisse

Die passive Vermeidung wurde bei D. melanogaster (Canton-S) und D untersucht. Simulaner. Die Experimente verglichen die Latenzen und die Anzahl der erhaltenen Schocks zwischen aufeinanderfolgenden Versuchen. Zunächst wurden die Experimente mit 3-4 Tage alten männlichen D. melanogaster Fliegen durchgeführt. Fliegen wurden auf der Standard-Bloomington Formulation-Diät in einer klimatisierten Umgebung bei 24 ° C unter einem 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus, 70% Luftfeuchtigkeit und kont...

Diskussion

Die Vermeidung bedrohlicher Reize ist ein entscheidendes Merkmal des adaptiven Verhaltens bei verschiedenen Arten von C. elegance bis ^human32. Vermeidungslernverfahren, die typischerweise die Flucht vor einem aversiven Ereignis beinhalten, sind seit den 1970er Jahren häufig verwendete Verhaltensaufgaben, um Lern- und Gedächtnisprozesse bei Labornagetieren zu ^{untersuchen13}. Bei aktiven Vermeidungsverfahren folgt auf einen gleichgültigen Re...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bloomington Formulation diet	Nutri-Fly	66-112	Available from Genesee Scientific Inc., San Diego, CA
1000 µL Blue tip	Fisher	NC9546243
17 x 100 mm 14 mL polypropylene culture tube	VWR	60818-689
Aduino-based Automatic Kontrol Module	In-house	AKM-007	This unit is optional. Complete description, schematics, wiring diagram and a code are provided at the ECU Digital Market - https://digitalmarket.ecu.edu/akmmodule
Dual-Display 2-Channel  Digital Clock/Timer	Digi-Sense	AO-94440-10	https://www.amazon.com/Cole-Parmer-AO-94440-10-Dual-Display-2-Channel-Jumbo-Digit/dp/B00PR0809G/ref=sr_1_5?dchild=1&keywords=Dual-Display+timer+jumbo&qid=1627660660&sr= 8-5#customerReviews
Electronic Finger Counter	N/A	N/A	https://www.amazon.com/gp/product/B01M8IRK6F/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
Fisherbrand Sparkleen 1 Detergent	Fisher Scientific	04-320-4
Fly mouth aspirator	In-house		Prepared as described in reference 19.
Grass S88 stimulator	N/A	N/A	Could be replaced with any stimulator which can provide described parameters
Kim-wipes	Fisher Scientific	06-666	Kimberly-Clark Professional 34120
Metal block for fly immobilization	In-house		4 x 13 x 23.5cm aluminum block
Nutiva USDA Certified Organic, non-GMO, Red Palm Oil	Nutiva	N/A	https://www.amazon.com/Nutiva-Certified-Cold-Filtered-Unrefined-Ecuadorian/dp/B00JJ1E83G/ref=sxts_rp_s1_0?cv_ct_cx=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&dchild=1&keywords=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&pd_rd_i=B00JJ1E83G&pd_ rd_r=f35e9d2f-afe4-44b6-afc2-1c9cd705be18&pd_rd_w= R3Zb4&pd_rd_wg=eUv1m&pf_rd_ p=c6bde456-f877-4246-800f-44405f638777&pf _rd_r=M94N11RC7NH333EMJ66Y &psc=1&qid=1627661533&sr=1-1-f0029781-b79b-4b60-9cb0-eeda4dea34d6
Shock tube	CelExplorer	TMA-201	https://www.celexplorer.com/product_detail.asp?id=217&MainType=110&SubType=8
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