Drosofila Comportamento di evitamento passivo come nuovo paradigma per studiare l'apprendimento avversivo associativo

Riepilogo

Questo lavoro descrive un semplice paradigma comportamentale che consente l'analisi dell'apprendimento associativo avversivo nei moscerini della frutta adulti. Il metodo si basa sulla soppressione del comportamento innato della geotaxi negativa a causa dell'associazione formata tra uno specifico contesto ambientale e una scossa elettrica.

Abstract

Questo protocollo descrive un nuovo paradigma per l'analisi dell'apprendimento associativo avversivo nelle mosche adulte (Drosophila melanogaster). Il paradigma è analogo al comportamento di evitamento passivo nei roditori di laboratorio in cui gli animali imparano a evitare un compartimento in cui hanno precedentemente ricevuto una scossa elettrica. Il test sfrutta la geotassi negativa nelle mosche, che si manifesta come un impulso a salire quando sono posizionate su una superficie verticale. La configurazione è costituita da scomparti superiori e inferiori orientati verticalmente. Nella prima prova, una mosca viene posizionata in un compartimento inferiore da dove di solito esce entro 3-15 s e entra nel compartimento superiore dove riceve una scossa elettrica. Durante la seconda prova, 24 ore dopo, la latenza è significativamente aumentata. Allo stesso tempo, il numero di shock è diminuito rispetto al primo studio, indicando che le mosche hanno formato una memoria a lungo termine sul compartimento superiore. Le registrazioni delle latenze e del numero di shock potrebbero essere eseguite con un contatore di conteggi e un cronometro o con un semplice dispositivo basato su Arduino. Per illustrare come il test può essere utilizzato, il comportamento passivo di evitamento di D. melanogaster e D. simulans maschio e femmina sono stati caratterizzati qui. Il confronto tra latenze e numero di shock ha rivelato che sia D. melanogaster che D. simulans vola in modo efficiente hanno imparato il comportamento di evitamento passivo. Non sono state osservate differenze statistiche tra mosche maschili e femminili. Tuttavia, i maschi erano un po 'più veloci mentre entravano nel compartimento superiore al primo studio, mentre le femmine ricevevano un numero leggermente più alto di shock in ogni prova di ritenzione. La dieta occidentale (WD) ha significativamente compromesso l'apprendimento e la memoria nelle mosche maschio durante l'esercizio di volo controbilanciato questo effetto. Nel complesso, il comportamento passivo di evitamento nelle mosche offre un test semplice e riproducibile che potrebbe essere utilizzato per studiare i meccanismi di base dell'apprendimento e della memoria.

Introduzione

L'apprendimento e la memoria sono un meccanismo di adattamento evolutivamente antico all'ambiente, conservato dalla Drosophila (D.) ^all'uomo1. Il moscerino della frutta è un robusto organismo modello per studiare i principi fondamentali dell'apprendimento e della memoria in quanto offre una vasta gamma di potenti strumenti genetici per sezionare i meccanismi molecolari ^intrinseci2. I pionieristici studi di screening genetico, che hanno identificato i geni rutabaga3, amnesia4 e dunce5 fondamentali per l'apprendimento e la ^memoria2, hanno approfittato del condizionamento olfattivo poiché i moscerini della frutta si affidano al loro acuto senso dell'olfatto per trovare cibo, potenziali compagni ed evitare i ^predatori6.

Il condizionamento olfattivo è diventato un paradigma popolare per studiare il meccanismo dell'apprendimento e della memoria, grazie all'introduzione del labirinto a T olfattivo di Tully e ^Quinn7,8. Successivamente, sono stati proposti altri metodi per misurare vari tipi di apprendimento e memoria, tra cui il condizionamento ^visivo9, il condizionamento del corteggiamento10, il saggio di soppressione della fototassi ^avversiva11 e il condizionamento dell'esposizione alle ^vespe12. Tuttavia, la maggior parte di questi test ha una configurazione complessa che deve essere costruita su misura in un laboratorio universitario o acquistata tramite un fornitore. Il paradigma qui descritto si basa su un semplice test comportamentale per studiare l'apprendimento associativo avversivo nelle mosche che può essere facilmente assemblato con poche forniture disponibili.

Il paradigma descritto è equivalente al comportamento passivo (o inibitorio) di evitamento nei topi e nei ratti di laboratorio in cui gli animali imparano a evitare un compartimento in cui hanno precedentemente ricevuto scosse elettriche del ^piede13. Nei muridi, la procedura si basa sulla loro innata evitamento della luce intensa e sulla preferenza per le aree più ^scure14. Nella prima prova, l'animale viene collocato nel compartimento luminoso, da dove l'animale esce rapidamente, entrando in un compartimento buio, dove viene erogata una scossa elettrica del piede. Di solito, una singola prova è sufficiente per formare una solida memoria a lungo termine, con conseguente aumento significativo della latenza 24 ore dopo. La latenza viene quindi utilizzata come indice della capacità dell'animale di ricordare l'associazione tra lo stimolo avversivo e l'ambiente ^specifico15.

Questo lavoro descrive una procedura analoga che utilizza D. come sistema modello che offre diversi vantaggi rispetto ai modelli di roditori, tra cui l'economicità, dimensioni del campione più grandi, l'assenza di supervisione normativa e l'accesso a potenti strumenti ^{genetici16,17}. La procedura si basa sul comportamento negativo della geotaxi, che si manifesta nell'impulso delle mosche di arrampicarsi quando sono posizionate su una superficie ^verticale18. La configurazione è composta da due camere verticali. Nella prima prova, un moscerino della frutta viene posizionato in un compartimento inferiore. Da lì, di solito esce entro 3-15 s, entrando nel compartimento superiore dove riceve una scossa elettrica. Durante una prova di 1 minuto, alcune mosche possono occasionalmente rientrare nel compartimento superiore, il che si traduce in un'ulteriore scossa elettrica. Durante la fase di test, 24 ore dopo, la latenza è notevolmente aumentata. Allo stesso tempo, il numero di shock è diminuito rispetto al primo giorno indicando che le mosche hanno formato una memoria associativa avversa sul compartimento superiore. La latenza, il numero di shock e la durata e la frequenza degli attacchi di toelettatura vengono quindi utilizzati per analizzare il comportamento animale e la capacità di formare e ricordare l'associazione tra lo stimolo avversivo e l'ambiente specifico. I risultati rappresentativi rivelano che l'esposizione alla dieta occidentale (WD) compromette significativamente il comportamento di evitamento passivo nelle mosche maschili, suggerendo che il WD influisce profondamente sul comportamento e sulla cognizione della mosca. Al contrario, l'esercizio di volo ha alleviato l'effetto negativo del WD, migliorando il comportamento di evitamento passivo.

Protocollo

1. Preparazione di apparecchi passivi di evitamento

1. Praticare un foro di 4 mm perpendicolare alla superficie della parete del tubo di coltura in polipropilene da 14 mL e a 8 mm di distanza dal fondo del tubo.
   NOTA: utilizzare un trapano elettrico e una punta da trapano 5/32 per ottenere i migliori risultati.
2. Utilizzando un coltello da utilità in acciaio, tagliare la parte superiore del tubo di coltura in polipropilene da 14 ml per creare un frammento inferiore del tubo lungo 45 mm. Il frammento inferiore funge da compartimento inferiore.
3. Tagliare la punta della punta della pipetta blu da 1.000 μL usando una lama di rasoio a bordo singolo per rendere l'apertura abbastanza ampia per un passaggio di una singola mosca. Tagliare la parte restringente della punta blu per creare un frammento di 12 mm. Inserire saldamente questo frammento in un foro di 4 mm del compartimento inferiore. Questo è usato come banchina di carico per il trasferimento delle mosche.
4. Tagliare un pezzo di tubo in vinile trasparente da 15 mm ID 5/8" (vedi Tabella dei materiali) per creare un accoppiamento. Inserire lo scomparto superiore e inferiore nell'accoppiamento da estremità opposte per fissare saldamente lo scomparto inferiore al compartimento superiore.
5. Utilizzando un morsetto regolabile a 2 poli, collegare l'assieme a un supporto verticale. Orientate verticalmente il gruppo con il tubo ammortizzatore come scomparto superiore.
6. Collegare i fili del tubo d'urto a uno stimolatore elettrico (vedere Tabella dei materiali) per erogare scosse elettriche. La durata del periodo di formazione è di 1 min.
   NOTA: per facilitare l'osservazione, posizionare un pezzo di carta bianca dietro il tubo d'urto per fungere da sfondo bianco dell'apparecchio. Metti una lampada con una lampadina morbida equivalente a 75 W sopra il vano ammortizzatore. Posizionare una lampada a lente d'ingrandimento a braccio regolabile davanti alla configurazione. Una rappresentazione dell'apparato passivo di evitamento è mostrata nella Figura 1.

2. Preparazione delle mosche per la procedura di evitamento passivo

1. Immobilizzare le mosche D. melanogaster o D. simulans di 3-4 giorni usando un blocco ghiacciato e trasferirle in singole fiale con cibo 24 ore prima dell'esperimento (1 mosca per fiala) seguendo la procedura descritta in precedenza19.
   NOTA: Gli esperimenti qui descritti hanno confrontato maschi di 3-4 giorni rispetto a mosche femminili in D. melanogaster e D. simulans.
2. Prima degli esperimenti comportamentali, codificare tutte le fiale. Per questo, assegna a ciascun gruppo una lettera, ad esempio "A", "B", "C", ecc., E ogni mosca un numero. Rivela questo codice solo dopo che tutti i dati sono stati registrati e analizzati. Utilizzare almeno 20 mosche per genotipo o trattamento per contrastare le variazioni individuali.
   NOTA: Eseguire gli esperimenti e le analisi "alla cieca" consente di escludere un pregiudizio nella valutazione delle prestazioni della mosca e l'analisi dei dati.

3. Esecuzione della prima prova

1. Utilizzando un aspiratore a bocca mosca (vedere Tabella dei materiali) descritto in ^{precedenza20,} trasferire delicatamente una mosca dal singolo flaconcino nel compartimento inferiore attraverso la banchina di carico. Aspirare delicatamente una mosca nell'aspiratore della bocca aspirando l'aria. Deposita la mosca soffiando leggermente nella banchina di carico.
   NOTA: Evitare di stressare l'animale durante la cattura e il carico.
2. Subito dopo che la mosca è stata caricata nello scompartimento inferiore, avviare un timer e un cronometro di 1 minuto.
   NOTA: il cronometro viene utilizzato per misurare le latenze e il contatore di conteggio per contare il numero di scosse.
3. Premere il cronometro per registrare la prima latenza quando la mosca entra nel tubo d'urto posizionando tutte le zampe sulla griglia. Accendi lo stimolatore per fornire una scossa elettrica al volo. I parametri di stimolazione sono 120 volt, 1000 ms di durata, 1 impulso/s (PPS), durata del treno 2000 ms.
4. Fornire ulteriori urti se la mosca rientra nel tubo d'urto. Registrare il numero di shock ricevuti durante una prova di 1 minuto con un contatore di conteggio o un contatore basato su Arduino (vedere Tabella dei materiali). Se si utilizza il contatore basato su Arduino, attenersi alla seguente procedura.
   NOTA: Un dispositivo opzionale basato su Arduino AKM-007 (vedi Tabella dei materiali) può essere utilizzato per misurare il tempo, la latenza, il numero di shock e la frequenza e la durata degli attacchi di toelettatura per ciascun animale premendo e rilasciando i pulsanti corrispondenti sul dispositivo. I pulsanti sul dispositivo sono assegnati per misurare la latenza, amministrare e registrare il numero di shock e misurare la frequenza e la durata degli attacchi di toelettatura.
   1. Premere il pulsante Start al passaggio 3.2. e premere il pulsante Shock al passaggio 3.3.
   2. Per registrare la durata di un incontro di toelettatura, premere il pulsante Toelettatura all'inizio di un incontro di toelettatura sul dispositivo e rilasciare questo pulsante alla fine dell'incontro di toelettatura.
      NOTA: Gli attacchi di toelettatura sono stati misurati durante 1 minuto di prova. Una toelettatura estensiva potrebbe essere indicativa di stress ^animale21,22. Il dispositivo basato su Arduino salva tutti i dati come file CSV su una scheda di memoria.
5. Al termine di una prova di 1 minuto, trasferire delicatamente la mosca su un singolo flaconcino. Annota la latenza, il numero di shock ricevuti e qualsiasi cambiamento notevole nel comportamento.
6. Pulire il compartimento inferiore e antiurto con etanolo al 70%, pulire con un fazzoletto per la pulizia privo di lanugine (vedere Tabella dei materiali) e asciugare con l'asciugacapelli. Ripeti la prova con la mosca successiva.
7. Dopo gli esperimenti comportamentali, pulire il compartimento inferiore con acqua e detergente inodore. Pulire il compartimento inferiore e il compartimento degli ammortizzatori con etanolo al 70% e asciugare all'aria durante la notte.

4. Esecuzione della seconda prova

1. Eseguire la seconda prova ripetendo la procedura sopra descritta (passaggio 3) 24 ore dopo. Prova le mosche nella stessa sequenza del giorno precedente.

5. Analisi dei risultati

1. Calcola la latenza media, il numero medio di shock e la durata degli attacchi di toelettatura per la prova 1 e la prova 2 per ciascun gruppo sperimentale di animali. Esegui il t-test degli studenti per il confronto a due gruppi o ANOVA per confronti multipli con analisi post-hoc utilizzando il test di ^Tukey23.

Risultati

L'evitamento passivo è stato studiato in D. melanogaster (Canton-S) e D. simulani. Gli esperimenti hanno confrontato le latenze e il numero di shock ricevuti tra prove consecutive. Inizialmente, gli esperimenti sono stati eseguiti con mosche D. melanogaster maschio di 3-4 giorni. Le mosche sono state mantenute con la dieta standard Bloomington Formulation in un ambiente climatizzato a 24 ° C in un ciclo luce-buio di 12 ore, umidità del 70% e densità di popolazione controllata. La d...

Discussione

Evitare stimoli minacciosi è una caratteristica cruciale del comportamento adattivo in varie specie, da C. eleganza a ^umano32. Le procedure di apprendimento evitamento che in genere comportano la fuga di un evento avversivo, sono compiti comportamentali comunemente usati per indagare i processi di apprendimento e memoria nei roditori di ^{laboratorio13} dal 197032. Nelle procedure di evitamento attivo, uno stimolo indifferente o un segnale con...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bloomington Formulation diet	Nutri-Fly	66-112	Available from Genesee Scientific Inc., San Diego, CA
1000 µL Blue tip	Fisher	NC9546243
17 x 100 mm 14 mL polypropylene culture tube	VWR	60818-689
Aduino-based Automatic Kontrol Module	In-house	AKM-007	This unit is optional. Complete description, schematics, wiring diagram and a code are provided at the ECU Digital Market - https://digitalmarket.ecu.edu/akmmodule
Dual-Display 2-Channel  Digital Clock/Timer	Digi-Sense	AO-94440-10	https://www.amazon.com/Cole-Parmer-AO-94440-10-Dual-Display-2-Channel-Jumbo-Digit/dp/B00PR0809G/ref=sr_1_5?dchild=1&keywords=Dual-Display+timer+jumbo&qid=1627660660&sr= 8-5#customerReviews
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Fly mouth aspirator	In-house		Prepared as described in reference 19.
Grass S88 stimulator	N/A	N/A	Could be replaced with any stimulator which can provide described parameters
Kim-wipes	Fisher Scientific	06-666	Kimberly-Clark Professional 34120
Metal block for fly immobilization	In-house		4 x 13 x 23.5cm aluminum block
Nutiva USDA Certified Organic, non-GMO, Red Palm Oil	Nutiva	N/A	https://www.amazon.com/Nutiva-Certified-Cold-Filtered-Unrefined-Ecuadorian/dp/B00JJ1E83G/ref=sxts_rp_s1_0?cv_ct_cx=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&dchild=1&keywords=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&pd_rd_i=B00JJ1E83G&pd_ rd_r=f35e9d2f-afe4-44b6-afc2-1c9cd705be18&pd_rd_w= R3Zb4&pd_rd_wg=eUv1m&pf_rd_ p=c6bde456-f877-4246-800f-44405f638777&pf _rd_r=M94N11RC7NH333EMJ66Y &psc=1&qid=1627661533&sr=1-1-f0029781-b79b-4b60-9cb0-eeda4dea34d6
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