Drosófila Comportamento de evasão passiva como um novo paradigma para estudar aprendizagem aversiva associativa

Resumo

Este trabalho descreve um simples paradigma comportamental que permite a análise da aprendizagem associativa aversiva em moscas de frutas adultas. O método baseia-se na supressão do comportamento geotaxis negativo inato devido à associação formada entre um contexto ambiental específico e um choque elétrico.

Resumo

Este protocolo descreve um novo paradigma para a análise do aprendizado associativo aversivo em moscas adultas (Drosophila melanogaster). O paradigma é análogo ao comportamento de evasão passiva em roedores de laboratório nos quais os animais aprendem a evitar um compartimento onde já receberam um choque elétrico. O ensaio se aproveita de geotaxis negativos em moscas, que se manifesta como uma vontade de subir quando são colocadas em uma superfície vertical. A configuração consiste em compartimentos superiores e inferiores orientados verticalmente. No primeiro teste, uma mosca é colocada em um compartimento inferior de onde geralmente sai dentro de 3-15 s, e entra no compartimento superior onde recebe um choque elétrico. Durante o segundo julgamento, 24 horas depois, a latência é significativamente aumentada. Ao mesmo tempo, o número de choques é reduzido em comparação com o primeiro ensaio, indicando que as moscas formaram memória de longo prazo sobre o compartimento superior. As gravações de latências e número de choques poderiam ser realizadas com um contador de contagem e um cronômetro ou com um dispositivo simples baseado em Arduino. Para ilustrar como o ensaio pode ser utilizado, o comportamento passivo de evasão de D. melanogaster e D. simulados masculino e feminino foram caracterizados aqui. A comparação das latências e o número de choques revelou que tanto d. melanogaster quanto D. simulados voam eficientemente aprendeu o comportamento de evasão passiva. Não foram observadas diferenças estatísticas entre moscas do sexo masculino e feminino. No entanto, os machos foram um pouco mais rápidos ao entrar no compartimento superior no primeiro ensaio, enquanto as fêmeas receberam um número ligeiramente maior de choques em todos os testes de retenção. A dieta ocidental (WD) prejudicou significativamente o aprendizado e a memória em moscas machos, enquanto o exercício de voo contrabalançava esse efeito. Em conjunto, o comportamento de evasão passiva em moscas oferece um ensaio simples e reprodutível que poderia ser usado para estudar mecanismos básicos de aprendizagem e memória.

Introdução

O aprendizado e a memória são um mecanismo de adaptação evolutivamente antigo ao meio ambiente, conservado de Drosophila (D.) para ^humano1. A mosca-das-frutas é um organismo modelo robusto para estudar princípios fundamentais de aprendizagem e memória, pois oferece uma ampla gama de poderosas ferramentas genéticas para dissecar mecanismos moleculares intrínsecos2. Os pioneiros estudos de triagem genética, que identificaram os genes rutabaga3, amnésiac4 e dunce5 críticos para o aprendizado e ^memória2, aproveitaram-se do condicionamento olfativo à medida que as moscas das frutas dependem de seu agudo olfato para encontrar comida, potenciais companheiros e evitar ^predadores6.

O condicionamento olfativo tornou-se um paradigma popular para estudar o mecanismo de aprendizagem e memória, graças à introdução do olfativo T-maze por Tully e ^Quinn7,8. Posteriormente, foram propostos outros métodos para medir vários tipos de aprendizagem e memória, incluindo condicionamento ^visual9, condicionamento de ^namoro10, ensaio de supressão de fototaxis aversiva11 e condicionamento de exposição de ^vespas12. No entanto, a maioria desses ensaios tem uma configuração complexa que deve ser feita sob medida em uma oficina universitária ou comprada através de um fornecedor. O paradigma descrito aqui baseia-se em um simples ensaio comportamental para estudar o aprendizado associativo aversivo em moscas que podem ser facilmente montados com alguns suprimentos disponíveis.

O paradigma descrito equivale ao comportamento passivo (ou inibitório) de evasão em ratos e ratos de laboratório em que os animais aprendem a evitar um compartimento onde já receberam choque elétrico ^{no pé13}. Em murids, o procedimento baseia-se em sua prevenção inata de luz brilhante e preferência por áreas mais ^escuras14. No primeiro ensaio, o animal é colocado no compartimento brilhante, de onde o animal sai rapidamente, entrando em um compartimento escuro, onde um choque elétrico no pé é entregue. Normalmente, um único ensaio é suficiente para formar uma memória sólida de longo prazo, resultando em uma latência significativamente aumentada 24 h depois. A latência é então usada como um índice da capacidade do animal de lembrar a associação entre o estímulo aversivo e o ambiente ^{específico15}.

Este trabalho descreve um procedimento análogo usando D. como um sistema de modelo que oferece várias vantagens sobre modelos de roedores, incluindo custo-efetividade, maior tamanho amostral, ausência de supervisão regulatória e acesso a poderosas ferramentas ^{genéticas16,17}. O procedimento é baseado no comportamento geotaxis negativo, que se manifesta na necessidade das moscas de subir quando são colocadas em uma superfície ^vertical18. A configuração consiste em duas câmaras verticais. No primeiro ensaio, uma mosca-das-frutas é colocada em um compartimento inferior. A partir daí, geralmente sai dentro de 3-15 s, pisando no compartimento superior onde recebe um choque elétrico. Durante um teste de 1 min, algumas moscas podem ocasionalmente reentrar no compartimento superior, o que resulta em um choque elétrico adicional. Durante a fase de testes, 24 horas depois, a latência é significativamente aumentada. Ao mesmo tempo, o número de choques é reduzido em comparação com o primeiro dia indicando que as moscas formaram memória associativa aversiva sobre o compartimento superior. A latência, o número de choques e a duração e frequência das crises de preparação são então usados para analisar o comportamento animal e a capacidade de formar e lembrar a associação entre o estímulo aversivo e o ambiente específico. Os resultados representativos revelam que a exposição à dieta ocidental (WD) prejudica significativamente o comportamento de evasão passiva em moscas masculinas, sugerindo que o WD impacta profundamente o comportamento e a cognição da mosca. Por outro lado, o exercício de voo aliviou o efeito negativo do WD, melhorando o comportamento de evasão passiva.

Protocolo

1. Preparação de aparelhos de evasão passiva

1. Perfurar um perpendicular de 4 mm na superfície da parede do tubo de cultura de polipropileno de 14 mL e 8 mm de distância do fundo do tubo.
   NOTA: Use uma broca elétrica e uma broca de 5/32 para obter melhores resultados.
2. Usando uma faca de aço, corte a parte superior do tubo de cultura de polipropileno de 14 mL para criar um fragmento inferior do tubo de 45 mm de comprimento. O fragmento inferior serve como compartimento inferior.
3. Corte a ponta de 1.000 μL de ponta de pipeta azul usando uma lâmina de barbear de borda única para tornar a abertura larga o suficiente para uma passagem de uma única mosca. Corte a parte de estreitamento da ponta azul para criar um fragmento de 12 mm. Insira este fragmento firmemente em um orifício de 4 mm do compartimento inferior. Isto é usado como uma doca de carregamento para transferir as moscas.
4. Corte um pedaço de 15 mm de tubo de vinil transparente de 5/8" ID (ver Tabela de Materiais) para criar um acoplamento. Insira compartimento superior e inferior no acoplamento de extremidades opostas para fixar com segurança o compartimento inferior ao compartimento superior.
5. Usando um grampo ajustável de 2 pinos, conecte o conjunto a um suporte vertical. Oriente a montagem verticalmente com o tubo de choque como compartimento superior.
6. Conecte os fios do tubo de choque a um estimulador elétrico (ver Tabela de Materiais) para fornecer choques elétricos. A duração do período de treinamento é de 1 min.
   NOTA: Para facilitar a observação, posicione um pedaço de papel branco atrás do tubo de choque para servir como fundo branco do aparelho. Coloque uma lâmpada com uma lâmpada macia equivalente a 75 W acima do compartimento de choque. Coloque uma lâmpada de lupa de braço ajustável na frente da configuração. Uma representação do aparelho de evasão passiva é mostrada na Figura 1.

2. Preparação das moscas para o procedimento de evasão passiva

1. Imobilize 3-4 dias de idade D. melanogaster ou D. simulados voa usando bloco gelado e transfira-os para frascos individuais com comida 24 horas antes do experimento (1 mosca por frasco) seguindo o procedimento descrito ^{anteriormente19}.
   NOTA: Os experimentos aqui descritos compararam homem de 3 a 4 dias de idade vs. moscas fêmeas em D. melanogaster e D. simulados.
2. Antes dos experimentos comportamentais, codam todos os frascos. Para isso, atribua a cada grupo uma letra, por exemplo, "A", "B", "C", etc., e cada um voa um número. Revele esse código somente depois de todos os dados terem sido registrados e analisados. Use pelo menos 20 moscas por genótipo ou tratamento para combater variações individuais.
   NOTA: Realizar os experimentos e análises "cegas" permite excluir um viés na avaliação do desempenho da análise de moscas e dados.

3. Realizando o primeiro teste

1. Usando um aspirador de boca de mosca (ver Tabela de Materiais) descrito ^{anteriormente20,} transfira suavemente uma mosca do frasco individual para o compartimento inferior através da doca de carregamento. Levemente chupar uma mosca no aspirador da boca sugando o ar. Deposite a mosca soprando levemente na doca de carregamento.
   NOTA: Evite estressar o animal durante a captura e o carregamento.
2. Imediatamente após a mosca ser carregada no compartimento inferior, inicie um cronômetro de 1 min e cronômetro.
   NOTA: O cronômetro é usado para medir latências e contador de contagem para contar o número de choques.
3. Pressione o cronômetro para gravar a primeira latência quando a mosca entrar no tubo de choque colocando todas as patas na grade. Ligue o estimulador para dar um choque elétrico na mosca. Os parâmetros de estimulação são 120 volts, 1000 ms de duração, 1 pulso/s (PPS), duração do trem de 2000 ms.
4. Entregue choques adicionais se a mosca reentrar no tubo de choque. Registo o número de choques recebidos durante um teste de 1 min com um contador de contagem ou um contador baseado em Arduino (ver Tabela de Materiais). Se estiver usando o contador baseado em Arduino, siga os passos abaixo.
   NOTA: Um dispositivo opcional baseado em Arduino AKM-007 (ver Tabela de Materiais) pode ser usado para medir o tempo, a latência, o número de choques e a frequência e duração dos ataques de preparação para cada animal pressionando e liberando os botões correspondentes no dispositivo. Os botões do dispositivo são atribuídos para medir a latência, administrar e registrar o número de choques e medir a frequência e duração dos ataques de preparação.
   1. Pressione o botão Iniciar na etapa 3.2.e pressione o botão Choque na etapa 3.3.
   2. Para gravar a duração de uma luta de preparação, pressione o botão Grooming no início de uma luta de preparação no dispositivo e solte este botão no final da luta de preparação.
      NOTA: As lutas de preparação foram medidas ao longo de 1 min de teste. O preparo extensivo pode ser indicativo de estresse ^animal21,22. O dispositivo baseado em Arduino salva todos os dados como arquivo CSV em um cartão de memória.
5. No final de um teste de 1 min, transfira suavemente a mosca de volta para um frasco individual. Anote a latência, o número de choques recebidos e quaisquer mudanças notáveis no comportamento.
6. Limpe o compartimento inferior e de choque com 70% de etanol, limpe com um tecido de limpeza sem fiapos (ver Tabela de Materiais) e seque com o secador de cabelo. Repita o julgamento com a próxima mosca.
7. Após os experimentos comportamentais, limpe o compartimento inferior com água e detergente inodoro. Limpe o compartimento inferior e o compartimento de choque com 70% de etanol, e a seco durante a noite.

4. Realizando o segundo teste

1. Realize o segundo ensaio repetindo o procedimento descrito acima (etapa 3) 24 h depois. Teste as moscas na mesma sequência do dia anterior.

5. Análise dos resultados

1. Calcule a latência média, o número médio de choques e a duração das lutas de preparação para o ensaio 1 e o teste 2 para cada grupo experimental de animais. Realize o teste t estudantil para comparação em dois grupos ou ANOVA para múltiplas comparações com análises pós-hoc usando o teste de ^Tukey23.

Resultados

A evasão passiva foi estudada em D. melanogaster (Canton-S) e D. simulados. Os experimentos compararam as latências e o número de choques recebidos entre ensaios consecutivos. Inicialmente, os experimentos foram realizados com moscas d. melanogaster machos de 3 a 4 dias de idade. As moscas foram mantidas na dieta padrão de formulação bloomington em um ambiente climatizado a 24 °C sob um ciclo claro-escuro de 12 horas, 70% de umidade e densidade populacional controlada. A densida...

Discussão

Evitar estímulos ameaçadores é uma característica crucial do comportamento adaptativo em várias espécies, desde a elegância C. até a ^humana32. Procedimentos de aprendizagem de evasão que normalmente implicam a fuga de um evento aversivo, são comumente usados tarefas comportamentais para investigar processos de aprendizagem e memória em roedores de ^{laboratório13} desde a década de 1970 ³². Em procedimentos de evasão ativa, um est...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bloomington Formulation diet	Nutri-Fly	66-112	Available from Genesee Scientific Inc., San Diego, CA
1000 µL Blue tip	Fisher	NC9546243
17 x 100 mm 14 mL polypropylene culture tube	VWR	60818-689
Aduino-based Automatic Kontrol Module	In-house	AKM-007	This unit is optional. Complete description, schematics, wiring diagram and a code are provided at the ECU Digital Market - https://digitalmarket.ecu.edu/akmmodule
Dual-Display 2-Channel  Digital Clock/Timer	Digi-Sense	AO-94440-10	https://www.amazon.com/Cole-Parmer-AO-94440-10-Dual-Display-2-Channel-Jumbo-Digit/dp/B00PR0809G/ref=sr_1_5?dchild=1&keywords=Dual-Display+timer+jumbo&qid=1627660660&sr= 8-5#customerReviews
Electronic Finger Counter	N/A	N/A	https://www.amazon.com/gp/product/B01M8IRK6F/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
Fisherbrand Sparkleen 1 Detergent	Fisher Scientific	04-320-4
Fly mouth aspirator	In-house		Prepared as described in reference 19.
Grass S88 stimulator	N/A	N/A	Could be replaced with any stimulator which can provide described parameters
Kim-wipes	Fisher Scientific	06-666	Kimberly-Clark Professional 34120
Metal block for fly immobilization	In-house		4 x 13 x 23.5cm aluminum block
Nutiva USDA Certified Organic, non-GMO, Red Palm Oil	Nutiva	N/A	https://www.amazon.com/Nutiva-Certified-Cold-Filtered-Unrefined-Ecuadorian/dp/B00JJ1E83G/ref=sxts_rp_s1_0?cv_ct_cx=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&dchild=1&keywords=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&pd_rd_i=B00JJ1E83G&pd_ rd_r=f35e9d2f-afe4-44b6-afc2-1c9cd705be18&pd_rd_w= R3Zb4&pd_rd_wg=eUv1m&pf_rd_ p=c6bde456-f877-4246-800f-44405f638777&pf _rd_r=M94N11RC7NH333EMJ66Y &psc=1&qid=1627661533&sr=1-1-f0029781-b79b-4b60-9cb0-eeda4dea34d6
Shock tube	CelExplorer	TMA-201	https://www.celexplorer.com/product_detail.asp?id=217&MainType=110&SubType=8
Stopwatch	Accusplit	A601XLN	https://www.amazon.com/gp/product/B0007ZGZYI/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
Transparent vinyl tubing (3/4” OD, 5/8” ID)	Lowes		Avaiable from Lowes