АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Эта работа описывает простую поведенческую парадигму, которая позволяет анализировать аверсивное ассоциативное обучение у взрослых плодовых мушек. Метод основан на подавлении врожденного негативного поведения геотаксиса из-за ассоциации, образующейся между конкретным экологическим контекстом и поражением электрическим током.

Аннотация

Этот протокол описывает новую парадигму анализа аверсивного ассоциативного обучения у взрослых мух (Drosophila melanogaster). Парадигма аналогична пассивному поведению избегания у лабораторных грызунов, в котором животные учатся избегать отсека, где они ранее получили удар электрическим током. Анализ использует отрицательный геотаксис у мух, который проявляется как желание подняться вверх, когда они размещены на вертикальной поверхности. Установка состоит из вертикально ориентированных верхнего и нижнего отсеков. На первом испытании муху помещают в нижний отсек, откуда она обычно выходит в течение 3-15 с, и входят в верхний отсек, где она получает удар электрическим током. Во время второго испытания, спустя 24 часа, задержка значительно увеличивается. При этом количество ударов снижается по сравнению с первым испытанием, что свидетельствует о том, что у мух формируется долговременная память о верхнем отсеке. Запись задержек и количества ударов может быть выполнена с помощью счетчика и секундомера или с помощью простого устройства на основе Arduino. Чтобы проиллюстрировать, как может быть использован анализ, здесь было охарактеризовано пассивное поведение избегания D. melanogaster и D. simulans мужского и женского пола. Сравнение задержек и количества ударов показало, что и D. melanogaster , и D. simulans эффективно научились пассивному поведению избегания. Статистических различий между самцами и самками мух не наблюдалось. Тем не менее, самцы были немного быстрее при входе в верхний отсек в первом испытании, в то время как самки получали немного большее количество ударов в каждом испытании удержания. Западная диета (WD) значительно ухудшала обучение и память у самцов мух, в то время как полетные упражнения уравновешивали этот эффект. Взятые вместе, пассивное поведение избегания у мух предлагает простой и воспроизводимый анализ, который можно использовать для изучения основных механизмов обучения и памяти.

Введение

Обучение и память — это эволюционно древний механизм адаптации к окружающей среде, сохранившийся от дрозофилы (Д.) до человека1. Плодовая муха является надежным модельным организмом для изучения фундаментальных принципов обучения и памяти, поскольку она предлагает широкий спектр мощных генетических инструментов для препарирования внутренних молекулярных механизмов2. Новаторские генетические скрининговые исследования, которые идентифицировали гены rutabaga3, amnesiac4 и dunce5, критически важные для обучения и памяти2, воспользовались обонятельным обусловливанием, поскольку плодовые мухи полагаются на свое острое обоняние, чтобы найти пищу, потенциальных партнеров и избежать хищников6.

Обонятельное обусловливание стало популярной парадигмой для изучения механизма обучения и памяти, благодаря введению обонятельного Т-лабиринта Талли и Куинна7,8. Впоследствии были предложены другие методы измерения различных типов обучения и памяти, включая визуальное обусловливание9, обусловливание ухаживания10, аверсивный анализ подавления фототаксиса11 и кондиционирование воздействия осы12. Тем не менее, большинство из этих анализов имеют сложную настройку, которая должна быть изготовлена на заказ в университетской мастерской или приобретена через поставщика. Парадигма, описанная здесь, основана на простом поведенческом анализе для изучения аверсивного ассоциативного обучения у мух, которое можно легко собрать с помощью нескольких доступных принадлежностей.

Описанная парадигма эквивалентна пассивному (или тормозящему) поведению избегания у лабораторных мышей и крыс, у которых животные учатся избегать отсека, где они ранее получали удар электрическим током13. У мюридов процедура основана на их врожденном избегании яркого света и предпочтении более темных областей14. На первом испытании животное помещается в светлый отсек, откуда животное быстро выходит, шагая в темный отсек, куда наносится удар электрической ногой. Обычно одного испытания достаточно для формирования твердой долговременной памяти, что приводит к значительному увеличению задержки через 24 часа. Затем латентность используется в качестве индекса способности животного запоминать связь между аверсивным стимулом и конкретной средой15.

В этой работе описывается аналогичная процедура с использованием D. в качестве модельной системы, которая предлагает несколько преимуществ по сравнению с моделями грызунов, включая экономическую эффективность, больший размер выборки, отсутствие регулирующего надзора и доступ к мощным генетическим инструментам16,17. Процедура основана на негативном поведении геотаксиса, которое проявляется в желании мух подняться вверх, когда они размещены на вертикальной поверхности18. Установка состоит из двух вертикальных камер. На первом испытании плодовая муха помещается в нижний отсек. Оттуда он обычно выходит в течение 3-15 с, ступая в верхний отсек, где получает удар током. Во время 1-минутного испытания некоторые мухи могут иногда возвращаться в верхний отсек, что приводит к дополнительному поражению электрическим током. На этапе тестирования, спустя 24 часа, задержка значительно увеличивается. При этом количество ударов снижается по сравнению с первым днем, что свидетельствует о том, что у мух формируется аверсивная ассоциативная память о верхнем отсеке. Латентность, количество толчков, а также продолжительность и частота груминговых схваток затем используются для анализа поведения животных и способности формировать и запоминать связь между аверсивным стимулом и конкретной средой. Репрезентативные результаты показывают, что воздействие западной диеты (WD) значительно ухудшает пассивное поведение избегания у самцов мух, предполагая, что WD глубоко влияет на поведение и познание мухи. И наоборот, полетные упражнения смягчили негативное влияние WD, улучшив пассивное поведение избегания.

протокол

1. Подготовка аппарата пассивного избегания

  1. Просверлите отверстие диаметром 4 мм, перпендикулярное поверхности стенки 14 мл полипропиленовой культуральной трубки и находящееся на расстоянии 8 мм от дна трубы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте электрическую дрель и сверло 5/32 для достижения наилучших результатов.
  2. С помощью стального ножа отрежьте верхнюю часть 14 мл полипропиленовой культуральной трубки, чтобы создать фрагмент дна трубки длиной 45 мм. Нижний фрагмент служит нижним отсеком.
  3. Отрежьте наконечник синего наконечника пипетки объемом 1000 мкл с помощью лезвия бритвы с одним краем, чтобы сделать отверстие достаточно широким для прохождения одной мухи. Отрежьте сужающуюся часть синего наконечника, чтобы создать фрагмент толщиной 12 мм. Вставьте этот фрагмент плотно в 4-миллиметровое отверстие нижнего отсека. Он используется в качестве погрузочного дока для перевозки мух.
  4. Вырежьте 15-миллиметровый кусок прозрачной виниловой трубки 5/8" ID (см. Таблицу материалов), чтобы создать муфту. Вставьте верхний и нижний отсек в муфту с противоположных концов, чтобы надежно прикрепить нижний отсек к верхнему отсеку.
  5. С помощью 2-контактного регулируемого зажима прикрепите узел к вертикальной подставке. Ориентируйте узел вертикально с помощью ударной трубки в качестве верхнего отсека.
  6. Подключите провода ударной трубки к электростимулятору (см. Таблицу материалов) для нанесения ударов электрическим током. Продолжительность тренировочного периода составляет 1 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы облегчить наблюдение, поместите лист белой бумаги за ударной трубкой, чтобы служить белым фоном аппарата. Поместите лампу с эквивалентной мягкой лампочкой мощностью 75 Вт над ударным отсеком. Поместите регулируемую лампу лупы перед установкой. Представление аппарата пассивного избегания показано на рисунке 1.

2. Подготовка мух к процедуре пассивного избегания

  1. Обездвиживают 3-4 дневных мух D. melanogaster или D. simulans с помощью ледяной глыбы и переносят их в отдельные флаконы с пищей за 24 ч до начала эксперимента (1 муха на флакон) после процедуры, описанной ранее19.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты, описанные здесь, сравнивали 3-4 дневных мужчин и. самка летает у D. melanogaster и D. simulans.
  2. Перед поведенческими экспериментами закодируйте все флаконы. Для этого присваивайте каждой группе букву, например, «А», «В», «С» и т.д., и каждой летит цифра. Раскрывайте этот код только после того, как все данные будут записаны и проанализированы. Используйте не менее 20 мух на генотип или лечение, чтобы противостоять индивидуальным вариациям.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проведение экспериментов и анализов «вслепую» позволяет исключить смещение в оценке эффективности полета и анализе данных.

3. Выполнение первой пробной версии

  1. Используя аспиратор с мухобойным устьем (см. Таблицу материалов), описанный ранее20, осторожно перенесите муху из отдельного флакона в нижний отсек через погрузочный док. Осторожно всасывайте одну муху в рот аспиратора, всасывая воздух. Посадите муху, слегка дуя в погрузочный док.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте стресса животного во время ловли и погрузки.
  2. Сразу после того, как муха будет загружена в нижний отсек, запустите 1-минутный таймер и секундомер.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Секундомер используется для измерения задержек и счетчика для подсчета количества ударов.
  3. Нажмите секундомер, чтобы записать первую задержку, когда муха входит в ударную трубку, поместив все лапы на сетку. Включите стимулятор, чтобы нанести удар током мухе. Параметры стимуляции: 120 вольт, длительность 1000 мс, 1 импульс/с (PPS), продолжительность поезда 2000 мс.
  4. Доставьте дополнительные удары, если муха снова войдет в ударную трубку. Запишите количество полученных ударов во время 1-минутного испытания с помощью счетчика или счетчика на основе Arduino (см. Таблицу материалов). Если вы используете счетчик на основе Arduino, выполните следующие действия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Опциональное устройство на базе Arduino АКМ-007 (см. Таблицу материалов) может использоваться для измерения времени, задержки, количества ударов, а также частоты и продолжительности груминговых схваток для каждого животного путем нажатия и отпускания соответствующих кнопок на устройстве. Кнопки на устройстве предназначены для измерения задержки, администрирования и записи количества ударов, а также измерения частоты и продолжительности груминговых схваток.
    1. Нажмите кнопку Пуск на шаге 3.2., и нажмите кнопку Shock на шаге 3.3.
    2. Чтобы записать продолжительность грумингового боя, нажмите кнопку Груминг в начале грумингового боя на устройстве и отпустите эту кнопку в конце грумингового боя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Схватки по грумингу измерялись в течение 1 мин испытания. Обширный груминг может свидетельствовать о стрессе животных21,22. Устройство на базе Arduino сохраняет все данные в виде CSV-файла на карту памяти.
  5. В конце 1-минутного испытания аккуратно перенесите муху обратно в отдельный флакон. Запишите задержку, количество полученных ударов и любые заметные изменения в поведении.
  6. Очистите нижний и ударный отсек 70% этанолом, протрите безворсовой чистящей салфеткой (см. Таблицу материалов) и высушите феном. Повторите пробную версию со следующей мухой.
  7. После поведенческих экспериментов очистите нижний отсек водой и моющим средством без запаха. Протрите нижний отсек и амортизатор 70% этанолом и высушите на воздухе ночь.

4. Выполнение второго испытания

  1. Выполните второе испытание, повторив процедуру, описанную выше (шаг 3) через 24 часа. Протестируйте мух в той же последовательности, что и в предыдущий день.

5. Анализ результатов

  1. Рассчитайте среднюю латентность, среднее количество ударов и продолжительность груминговых схваток для испытания 1 и испытания 2 для каждой экспериментальной группы животных. Выполните студенческий t-тест для сравнения двух групп или ANOVA для нескольких сравнений с пост-специальным анализом, используя тест Туки23.

Результаты

Пассивное избегание изучалось у D. melanogaster (Canton-S) и D. симулянты. В экспериментах сравнивали задержки и количество полученных шоков между последовательными испытаниями. Первоначально эксперименты проводились с 3-4-дневными самцами мух D. melanogaster . Мухи содержались на ста?...

Обсуждение

Избегание угрожающих раздражителей является важнейшей характеристикой адаптивного поведения у различных видов от C. elegance до human32. Процедуры обучения избеганию, которые обычно влекут за собой побег от аверсивного события, обычно используются поведенческими задачами ?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Это исследование было частично поддержано NIH R15ES029673 (AKM).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Bloomington Formulation dietNutri-Fly 66-112Available from Genesee Scientific Inc., San Diego, CA
1000 µL Blue tipFisherNC9546243
17 x 100 mm 14 mL polypropylene culture tubeVWR 60818-689
Aduino-based Automatic Kontrol ModuleIn-houseAKM-007This unit is optional. Complete description, schematics, wiring diagram and a code are provided at the ECU Digital Market - https://digitalmarket.ecu.edu/akmmodule
Dual-Display 2-Channel  Digital Clock/TimerDigi-SenseAO-94440-10https://www.amazon.com/Cole-Parmer-AO-94440-10-Dual-Display-2-Channel-Jumbo-Digit/dp/B00PR0809G/ref=sr_1_5?dchild=1&keywords=Dual-Display+timer+jumbo&qid=1627660660&sr=
8-5#customerReviews
Electronic Finger CounterN/AN/Ahttps://www.amazon.com/gp/product/B01M8IRK6F/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
Fisherbrand Sparkleen 1 DetergentFisher Scientific04-320-4
Fly mouth aspiratorIn-housePrepared as described in reference 19.
Grass S88 stimulatorN/AN/ACould be replaced with any stimulator which can provide described parameters
Kim-wipesFisher Scientific06-666Kimberly-Clark Professional 34120
Metal block for fly immobilizationIn-house4 x 13 x 23.5cm aluminum block
Nutiva USDA Certified Organic, non-GMO, Red Palm OilNutivaN/Ahttps://www.amazon.com/Nutiva-Certified-Cold-Filtered-Unrefined-Ecuadorian/dp/B00JJ1E83G/ref=sxts_rp_s1_0?cv_ct_cx=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&dchild=1&keywords=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&pd_rd_i=B00JJ1E83G&pd_
rd_r=f35e9d2f-afe4-44b6-afc2-1c9cd705be18&pd_rd_w=
R3Zb4&pd_rd_wg=eUv1m&pf_rd_
p=c6bde456-f877-4246-800f-44405f638777&pf
_rd_r=M94N11RC7NH333EMJ66Y
&psc=1&qid=1627661533&sr=1-1-f0029781-b79b-4b60-9cb0-eeda4dea34d6
Shock tubeCelExplorerTMA-201https://www.celexplorer.com/product_detail.asp?id=217&MainType=110&SubType=8
StopwatchAccusplitA601XLNhttps://www.amazon.com/gp/product/B0007ZGZYI/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
Transparent vinyl tubing (3/4” OD, 5/8” ID)LowesAvaiable from Lowes

Ссылки

  1. Kandel, E. R., Dudai, Y., Mayford, M. R. The molecular and systems biology of memory. Cell. 157 (1), 163-186 (2014).
  2. McGuire, S. E., Deshazer, M., Davis, R. L. Thirty years of olfactory learning and memory research in Drosophila melanogaster. Progress in Neurobiology. 76 (5), 328-347 (2005).
  3. Livingstone, M. S., Sziber, P. P., Quinn, W. G. Loss of calcium/calmodulin responsiveness in adenylate cyclase of rutabaga, a Drosophila learning mutant. Cell. 37 (1), 205-215 (1984).
  4. Quinn, W. G., Sziber, P. P., Booker, R. The Drosophila memory mutant amnesiac. Nature. 277 (5693), 212-214 (1979).
  5. Dudai, Y., Jan, Y. N., Byers, D., Quinn, W. G., Benzer, S. dunce, a mutant of Drosophila deficient in learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (5), 1684-1688 (1976).
  6. Busto, G. U., Cervantes-Sandoval, I., Davis, R. L. Olfactory learning in Drosophila. Physiology. 25 (6), 338-346 (2010).
  7. Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology. A: Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 157 (2), 263-277 (1985).
  8. Wright, N. J. Evolution of the techniques used in studying associative olfactory learning and memory in adult Drosophila in vivo: A historical and technical perspective. Invertebrate Neuroscience. 14 (1), 1-11 (2014).
  9. Vogt, K., Yarali, A., Tanimoto, H. Reversing stimulus timing in visual conditioning leads to memories with opposite valence in Drosophila. PloS One. 10 (10), 0139797 (2015).
  10. Koemans, T. S., et al. Drosophila courtship conditioning as a measure of learning and memory. Journal of Visualized Experiments. (124), e55808 (2017).
  11. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), e2504 (2011).
  12. Bozler, J., et al. A systems level approach to temporal expression dynamics in Drosophila reveals clusters of long term memory genes. Plos Genetics. 13 (10), 1007054 (2017).
  13. Atucha, E., Roozendaal, B. The inhibitory avoidance discrimination task to investigate accuracy of memory. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 60 (2015).
  14. Thiels, E., Hoffman, E. K., Gorin, M. B. A reliable behavioral assay for the assessment of sustained photophobia in mice. Current Eye Research. 33 (5), 483-491 (2008).
  15. Detrait, E. R., Hanon, E., Dardenne, B., Lamberty, Y. The inhibitory avoidance test optimized for discovery of cognitive enhancers. Behavior Research Methods. 41 (3), 805-811 (2009).
  16. Piper, M. D. W., Partridge, L. Drosophila as a model for ageing. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1864 (9), 2707-2717 (2018).
  17. Chalmers, J., et al. A multicomponent screen for feeding behaviour and nutritional status in Drosophila to interrogate mammalian appetite-related genes. Molecular Metabolism. 43, 101127 (2021).
  18. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental Gerontology. 40 (5), 386-395 (2005).
  19. Yang, D. Simple homemade tools to handle fruit flies-Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (149), e59613 (2019).
  20. Barradale, F., Sinha, K., Lebestky, T. Quantification of Drosophila grooming behavior. Journal of Visualized Experiments. (125), e55231 (2017).
  21. Denmark, A., et al. The effects of chronic social defeat stress on mouse self-grooming behavior and its patterning. Behavioural Brain Research. 208 (2), 553-559 (2010).
  22. Kalueff, A. V., et al. Neurobiology of rodent self-grooming and its value for translational neuroscience. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (1), 45-59 (2016).
  23. Motulsky, H. . Intuitive biostatistics: A nonmathematical guide to statistical thinking. Fourth edition. , (2018).
  24. Qiao, B., Li, C., Allen, V. W., Shirasu-Hiza, M., Syed, S. Automated analysis of long-term grooming behavior in Drosophila using a k-nearest neighbors classifier. Elife. 7, 34497 (2018).
  25. Mu, M. D., et al. A limbic circuitry involved in emotional stress-induced grooming. Nature Communications. 11 (1), 2261 (2020).
  26. Song, C., Berridge, K. C., Kalueff, A. V. Stressing' rodent self-grooming for neuroscience research. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (9), 591 (2016).
  27. Wang, C., Chan, J. S., Ren, L., Yan, J. H. Obesity reduces cognitive and motor functions across the lifespan. Neural Plasticity. 2016, 2473081 (2016).
  28. Lewis, A. R., Singh, S., Youssef, F. F. Cafeteria-diet induced obesity results in impaired cognitive functioning in a rodent model. Heliyon. 5 (3), 01412 (2019).
  29. Yohn, S. E., Galbraith, J., Calipari, E. S., Conn, P. J. Shared behavioral and neurocircuitry disruptions in drug addiction, obesity, and binge eating disorder: Focus on Group I mGluRs in the mesolimbic dopamine pathway. ACS Chemical Neuroscience. 10 (5), 2125-2143 (2019).
  30. Lopez-Taboada, I., Gonzalez-Pardo, H., Conejo, N. M. Western Diet: Implications for brain function and behavior. Frontiers in Psychololgy. 11, 564413 (2020).
  31. Murashov, A. K., et al. Preference and detrimental effects of high fat, sugar, and salt diet in wild-caught Drosophila simulans are reversed by flight exercise. FASEB Bioadvances. 3 (1), 49-64 (2021).
  32. Krypotos, A. M., Effting, M., Kindt, M., Beckers, T. Avoidance learning: A review of theoretical models and recent developments. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 189 (2015).
  33. Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. . Encyclopedia of Neuroscience. , 3093 (2009).
  34. Mery, F., Belay, A. T., So, A. K., Sokolowski, M. B., Kawecki, T. J. Natural polymorphism affecting learning and memory in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (32), 13051-13055 (2007).
  35. Tan, Y., Yu, D., Pletting, J., Davis, R. L. Gilgamesh is required for rutabaga-independent olfactory learning in Drosophila. Neuron. 67 (5), 810-820 (2010).
  36. Ögren, S. O., Stiedl, O., Stolerman, I. P. . Encyclopedia of Psychopharmacology. , 960-967 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

176

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены