Sistema de cultivo de órganos para la evaluación de la toxicidad de excipientes y productos farmacéuticos para tratamientos intraoculares

Resumen

El objetivo de este protocolo es evaluar los cambios en la actividad metabólica y la función refractiva del cristalino en respuesta a un tratamiento experimental.

Resumen

Como causa principal de ceguera, las cataratas son una carga significativa para las decenas de millones de personas afectadas en todo el mundo por esta afección. Las exposiciones químicas, entre otros factores ambientales, son una causa establecida de cataratas. Las pruebas de toxicidad ocular pueden evaluar si los productos farmacéuticos y sus componentes pueden contribuir al daño del cristalino que puede provocar cataratas o ayudar en el tratamiento de las cataratas.

Los estudios in vitro y las pruebas in vivo con animales pueden utilizarse para evaluar la seguridad de los productos químicos antes de los estudios clínicos. La prueba de Draize, el estándar in vivo actual para las pruebas de toxicidad e irritabilidad ocular, ha sido criticada por la falta de sensibilidad y mediciones objetivas para determinar la toxicidad ocular. Los ensayos in vitro basados en células son limitados, ya que los cultivos celulares no pueden modelar adecuadamente un cristalino funcional intacto.

El método descrito aquí es una alternativa in vitro sensible a la experimentación con animales, diseñada para evaluar la respuesta del cristalino bovino intacto al tratamiento tanto a nivel de actividad celular como para el rendimiento refractivo general. El reactivo no tóxico resazurina se metaboliza en proporción al nivel de actividad celular. El ensayo de escáner láser de lente mide la capacidad de la lente para refractar haces de luz incidentes en un solo punto con un error mínimo, directamente relevante para su función natural. El método se puede utilizar para determinar los cambios agudos y tardíos en el cristalino, así como la recuperación del cristalino de exposiciones químicas o ambientales.

Introducción

Las cataratas, que afectan a más de 20 millones de personas, son la causa más prevalente de ceguera en todo el mundo ^1,2. Las cataratas se deben con mayor frecuencia a cambios en el cristalino relacionados con la edad, pero también son inducidas por traumatismos, afecciones genéticas, enfermedades o exposiciones tóxicas². En la actualidad, el tratamiento consiste en una intervención quirúrgica para sustituir el cristalino, un procedimiento costoso e invasivo al que pueden acceder principalmente los países desarrollados. La gran carga de las cataratas ha dirigido décadas de investigación hacia la prevención de las cataratas y el desarrollo de tratamientos no quirúrgicos. En ambos casos, la importancia de las pruebas preclínicas de toxicidad, eficacia y farmacocinética de los fármacos oftálmicos es primordial. Este proceso de desarrollo de fármacos depende en gran medida de la información proporcionada por los estudios realizados en animales.

La norma actual para los ensayos de toxicidad ocular in vivo es el ensayo de Draize, que consiste en la administración de un compuesto de ensayo al saco conjuntival de un animal vivo. La prueba ha sido significativamente criticada, particularmente en lo que se refiere a la ética animal, la subjetividad, la poca repetibilidad y la variabilidad³. Además, no hay ningún componente de la prueba Draize que controle directamente los efectos de las sustancias de prueba en la lente. Se ha invertido un esfuerzo considerable en el desarrollo de modelos alternativos in vitro ⁴. Sin embargo, ninguno ha sido suficientemente validado para reemplazar la prueba de Draize⁵. Del mismo modo, muchos de estos modelos enfrentan limitaciones con respecto a la aplicación directa a cataratas y otras patologías complejas⁶. Por ejemplo, los métodos que califican la transparencia de la lente cuando se coloca sobre una cuadrícula son inherentemente subjetivos⁷. Los estudios de cultivo celular son fiables y altamente utilizados, aunque las características de la monocapa celular pueden diferir del cultivo primario de tejidos⁸.

Las lentes enteras se pueden diseccionar de los ojos de los animales y cultivarlas para mantener su estructura y función originales. Un ensayo que es útil para evaluar la función del cristalino mientras se mantiene la condición del órgano es el ensayo de escáner láser de lente que involucra un escáner desarrollado en la Universidad de Waterloo en Canadá. El ensayo es un sistema de escaneo que utiliza una serie de proyecciones láser para medir la calidad óptica o el rendimiento refractivo de la lente. Las lentes se escanean en sus cámaras de cultivo personalizadas de dos segmentos, lo que permite que los haces pasen desde abajo a través de la lente (Figura 1A). Una cámara fija dentro del escáner captura la imagen del láser que pasa a través de la lente en numerosos puntos. El software del escáner calcula la distancia detrás de la lente en la que se cruza con un eje central (distancia del vértice posterior, BVD), produciendo una serie de mediciones que indican la consistencia con la que la lente enfoca la luz en un solo punto (Figura 1).

Las propiedades celulares de la lente, como la disposición ajustada y ordenada de sus células, ayudan a mantener la transparencia y minimizar la dispersión para que la lente pueda enfocar la luz^de manera funcional. Esta medida se puede utilizar para interpretar la medida en que un producto químico altera la estructura esencial de la lente, como el índice de refracción del gradiente, y cuánto se ve comprometida la función debido a las opacidades inducidas. Otros estudios que han seguido la respuesta de lentes cultivados y vesículas de lentes sugieren que la dispersión de la luz es producto de cambios estructurales, en comparación con los cambios metabólicos, y que las alteraciones de los lípidos y proteínas del cristalino pueden afectar el índice de refracción y, en consecuencia, aumentar la dispersión^10,11.

El escáner láser de lente se puede utilizar junto con reactivos metabólicos en ensayos para determinar medidas bioquímicas de toxicidad celular. La resazurina es un reactivo químico no tóxico metabolizado por las células activas, produciendo un producto reducido (resorufina) con una fluorescencia medible¹². El cristalino está en gran parte desprovisto de orgánulos, excepto las mitocondrias metabólicamente activas concentradas dentro del epitelio anterior y las células de fibra cortical superficial, cumpliendo con los requisitos energéticos del cristalino^13,14. El daño en el cristalino a nivel celular puede alterar el metabolismo y, a menudo, precede a la aparición de cambios estructurales patogénicos y cataratas¹⁵.

El propósito de este método es evaluar el efecto de las exposiciones ambientales y xenobióticas en el cristalino, lo que puede contribuir al desarrollo de cataratas. El protocolo consiste en dos ensayos para evaluar el efecto de un tratamiento con el cristalino bovino cultivado. La ventaja de este enfoque es que proporciona una evaluación celular y funcional de cómo el cristalino responde al tratamiento como tejido primario. Es una evaluación sensible y objetiva de la lente en comparación con otros métodos comunes 16,17,18.

El modelo se ha utilizado con éxito para evaluar los efectos de diversas exposiciones, incluidos surfactantes, productos de consumo, alcoholes y radiación ultravioleta 17,19,20. Los cambios en la calidad óptica están presentes de manera constante en las lentes cultivadas como respuesta a la exposición tóxica²¹. La capacidad de este método para mantener el cultivo del cristalino a largo plazo es muy adecuada para monitorizar el efecto potencialmente retardado de un compuesto y la recuperación del cristalino de un daño inducido o catarata^22,23. Los resultados obtenidos de la aplicación de este protocolo se pueden utilizar para reducir la dependencia de la experimentación con animales en el desarrollo de productos oftálmicos.

Protocolo

Todos los protocolos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las políticas éticas de la Universidad de Waterloo para la investigación con tejido animal. Los ojos bovinos para el presente estudio fueron suministrados por un matadero, obtenidos de vacas no lecheras a las pocas horas de la muerte, y fueron diseccionados inmediatamente, un proceso que toma hasta 8 h desde la obtención de los ojos. Los ojos deben ser diseccionados inmediatamente para preservar la esterilidad y la calidad de la disección. El medio de cultivo se prepara a un pH de 7,4 y se filtra estérilmente antes de la suplementación con FBS²¹. Todos los procedimientos se llevan a cabo en condiciones estériles, con las fuentes de material y equipo enumeradas en la Tabla de Materiales.

1. Cultivo de lentes bovinos

1. Diseccionar las lentes mediante la extirpación de los músculos extraoculares y el tejido de la esclerótica, la extirpación de la mitad posterior del globo y el vítreo, la extirpación del iris y el cuerpo ciliar junto con el cristalino, y luego la extirpación de las uniones zonulares, con el corte final colocado de manera que el cristalino caiga en la cámara de cultivo llena de medio.
2. Cultive las lentes disecadas en cámaras personalizadas con una base adaptada al sistema de escaneo láser, con 21 mL de medio filtrado estéril, a 37 °C y 5% de CO₂. Utilice un medio de cultivo suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 3% con penicilina-estreptomicina al 1%, 9,4 g/L de M-199, 0,1 g/L de L-glutamina, 5,96 g/L de HEPES, 2,2 g/L de bicarbonato de sodio y 7 mL/L de NaOH. Guarde el medio de cultivo no utilizado en el refrigerador hasta por 7 días.
3. Reemplace el medio de cultivo cada 1-2 días. Calentar el medio de cultivo durante una hora a 37 °C antes de su uso. Utilice una pipeta Pasteur estéril conectada a la succión para aspirar el medio de una cámara de cultivo individual y reponerlo inmediatamente con el medio suplementado.
4. Cultive las lentes durante 48 h después de la disección para dar tiempo a que se manifieste el daño físico. Inspeccione y escanee la calidad óptica de las lentes de acuerdo con la sección 4 antes de incluirlas en un experimento.
   NOTA: Las lentes se orientan boca abajo en preparación para el ensayo de escáner láser.

2. Procedimiento de control

1. Prepare una solución con la concentración deseada de un agente solubilizante que sea compatible con el compuesto químico y el medio de cultivo.
2. Prepare una solución de control de vehículos agregando el agente solubilizante al medio suplementado. Calentar la solución de control durante una hora a 37 °C antes de la experimentación.
3. Utilice una pipeta Pasteur conectada a la succión para aspirar el medio de cultivo desde las cámaras de la lente de control. Reponga las cámaras con la solución de control. Si es necesario, realice este paso con muestras por triplicado.
   NOTA: Se requiere un volumen mínimo de 7 ml para cubrir completamente el cristalino en la posición anterior boca arriba. Las condiciones para los controles en el estudio actual fueron 21 mL de medio control sin tratar, 21 mL de un medio de control del vehículo y 7 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
4. Cultive las lentes en un medio de control durante 2 días y, a continuación, sustitúyalas por un nuevo medio de control de acuerdo con la sección 1. Para exposiciones a corto plazo, aspire la solución de control de las cámaras y realice un enjuague al menos tres veces con medio de cultivo no suplementado antes de reanudar el protocolo de cultivo de la lente como se describe en la sección 1.0.
5. Deje que las lentes se aclimaten en la incubadora a 37 °C y 5% de CO₂ durante al menos 3,5 h antes de la evaluación de la calidad óptica.

3. Procedimiento de exposición

1. Prepare una solución con la concentración deseada de un agente solubilizante que sea compatible con el compuesto químico y el medio de cultivo. Combine el producto químico con el agente solubilizante, dejando el tiempo adecuado para la interacción si es necesario.
   NOTA: En el estudio actual se utilizó 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina para mejorar la solubilidad del lanosterol (0,033 g/L) en el medio. La solución de cloruro de benzalconio (BAK 0,0075%) se preparó utilizando PBS.
2. Incorporar el producto químico solubilizado en el medio de cultivo. Prepare un volumen total suficiente para proporcionar 21 ml de medio a todas las muestras de lentes. Calentar el medio experimental durante una hora a 37 °C antes de la experimentación.
3. Utilice una pipeta Pasteur conectada a la succión para aspirar el medio de cultivo desde las cámaras de la lente. Reponga inmediatamente las cámaras con la solución de prueba. Después del intervalo de exposición, reemplácelo con un medio de cultivo suplementado, realizando primero un enjuague si es necesario. Si es necesario, realice este paso con muestras por triplicado.
   NOTA: En el estudio actual, las condiciones de prueba fueron 21 mL de medio suplementado con lanosterol y 7 mL de una solución BAK 0.0075%. Se requiere un volumen mínimo de 7 ml para cubrir completamente la lente. En este caso, las lentes deben orientarse primero hacia arriba. Se puede utilizar una pipeta Pasteur para crear una corriente en la cámara de cultivo con parte del medio de cultivo circundante para reposicionar la lente.
4. Vuelva a colocar las lentes en la incubadora durante al menos 3,5 h para aclimatarse antes de la evaluación de la calidad óptica.
   NOTA: Las lentes se orientan boca abajo en preparación para el ensayo de escáner láser.

4. Ensayo de calidad óptica (lente, láser-escáner)

1. Asegúrese de que las lentes estén orientadas con la cara anterior hacia abajo y visualmente niveladas en la cámara de cultivo, utilizando la técnica del paso 3.3 para ajustar la posición de la lente si es necesario.
   NOTA: Esta posición asegura que el haz incidente se reflejará hacia arriba a través del fondo de la cámara y pasará a través de la lente desde la superficie anterior a la posterior.
2. Coloque una cámara de cultivo de lentes en el escáner láser de manera que el pasador del carro de la cámara encaje en la ranura de la base de la cámara.
3. Seleccione la lente y el punto de escaneo para los que desea realizar un escaneo, haga clic con el botón derecho en la lente de escaneo y espere a que el escáner le indique que se encuentre y alinee el haz. Seleccione puntos de inicio y final bien distanciados para el haz detrás de la lente. Asegúrese de que el haz central esté alineado con los botones de ajuste bruto y fino del software del escáner y la perilla de ajuste del escáner. Cuando el haz esté alineado, haga clic en calibrar e introduzca una selección adecuada de pasos radiales y separación del haz.
   NOTA: Para este estudio con la lente bovina, los ajustes para los pasos radiales y la separación del haz se establecieron en 10 pasos y 0,5 mm, respectivamente. El primer escaneo que realiza el escáner sirve para calibrar el escáner láser. Esto es necesario una vez, y todas las exploraciones adicionales de las lentes se pueden realizar directamente después de la alineación.
4. Una vez que se haya calibrado el escáner, haga clic en escanear. Espere a que se generen los valores de la media, la desviación estándar y el error de BVD a lo largo de un eje después de completar el escaneo de la lente, y se haya establecido el alcance del haz. Ajuste el visor desde donde los haces salen de la lente hasta el punto final deseado, seleccionando la distancia máxima detrás de la lente y excluyendo cualquier interferencia aparente.
5. Utilice el gráfico generado para ver las distancias individuales de los vértices traseros para cada haz.
   NOTA: Excluya los haces que pasan a través de las suturas del cristalino. Para excluir una viga, utilice la leyenda en pantalla para hacer clic con el botón derecho en una viga individual y seleccione excluir.
6. Gire manualmente la posición de la base de la cámara de cultivo dentro del escáner en 90°, de modo que el segundo escaneo a lo largo de la superficie anterior de la lente sea perpendicular al escaneo anterior. Asegúrese de que el haz central esté alineado como se detalla en el paso 4.3 y, a continuación, escanee la lente.

5. Ensayo de actividad metabólica (resazurina)

1. Prepare el medio sin FBS. Calentar el medio durante una hora a 37 °C. Prepare 50 mL de reactivo de resazurina al 8% en medio no suplementado.
   NOTA: Es suficiente preparar 50 mL para llenar todos los pocillos en una placa de 12 pocillos. La solución debe prepararse estéril en condiciones de poca luz en un recipiente opaco, ya que la resazurina es sensible a la luz.
2. Agregue 3.8 mL de solución de resazurina al 8% a cada pocillo dentro de una placa estéril de 12 pocillos de fondo transparente para cubrir el cristalino.
3. Utilice cucharas metálicas estériles para levantar con cuidado las lentes de debajo de la superficie posterior y realice un enjuague con una pipeta Pasteur para lavar la lente con un pequeño volumen de medio de cultivo no suplementado. Coloque las lentes individualmente en cada pocillo.
4. Incubar la placa de pocillos a 37 °C y 5% de CO₂ durante 5 h. Después de la incubación, retire las lentes con palas de metal de los pocillos y colóquelas en un contenedor de eliminación de desechos animales. Transfiera una muestra de 100 μL de cada pocillo a una placa estéril de fondo transparente de 96 pocillos.
   NOTA: Los lentes pueden evaluarse varias veces con el ensayo de actividad metabólica. En este caso, devuelva las lentes a las cámaras de cultivo con medio fresco para la incubación. El ensayo de actividad metabólica se realiza mejor una vez que se completan todas las exploraciones, ya que el tinte puede afectar las mediciones de BVD.
5. Mida la fluorescencia del punto final de las muestras de 100 μL utilizando un lector de placas fluorescentes, con las longitudes de onda de excitación y emisión establecidas en 560 nm y 590 nm, respectivamente.

6. Análisis de datos

1. Para el ensayo de calidad óptica, calcule el promedio de los valores calculados por el software para el error^{BVD 24} de los dos escaneos realizados en cada punto de tiempo. Realice este cálculo para todas las lentes y todos los puntos de exploración.
2. Para el ensayo de actividad metabólica, recopile los valores de fluorescencia relativa del punto final generados por el lector de placas. Normalice los datos estableciendo el promedio de todos los valores de control en un punto de escaneo al 100%. Calcule la actividad de cada lente como un porcentaje del valor de control promedio para ese punto de exploración.
3. Realice una prueba de normalidad para todos los grupos de experimentos. Suponiendo que los datos son normales, analice las diferencias de error de BVD entre las lentes de control y experimentales utilizando el ANOVA de dos vías. Además, realice la prueba de comparaciones múltiples post-hoc de Tukey. Realice un ANOVA de un factor y una prueba post-hoc de Dunnett para los datos de actividad metabólica.

Resultados

La Figura 2 y la Figura 3 (n = 6) muestran los resultados de un estudio que probó el efecto del tratamiento químico (lanosterol) en el cristalino bovino. El lanosterol es un esterol natural en el cristalino que en su día mostró resultados prometedores como posible intervención farmacéutica para las cataratas²⁵, aunque esto aún no se ha demostrado²⁶. El diseño del estudio in...

Discusión

El propósito de este protocolo es evaluar directamente los efectos de los productos químicos o las exposiciones ambientales en el cristalino en el cultivo primario de tejidos. En primer lugar, se diseccionan las lentes y se escanea para comprobar la calidad óptica. La prevención de la contaminación y la garantía de la calidad de la disección son fundamentales. Las lentes se escanean a intervalos periódicos para monitorear continuamente los cambios en la función refractiva con re...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
(2-Hydroxypropyl)-β-cyclodextrin	Sigma-Aldrich	H107	Powder
1 L bottle-top filtration system	VWR	97066-204	Full Assembly, bottle-top, 0.2 μm
100 mm Petri dish	VWR	89022-320	Slippable, media saver style, sterile
12 well-plate	Corning	353043	Sterile, clear-bottom
35 mm petri dish	VWR	25373-041	Falcon disposable petri dishes, sterile, Corning
96 well-plate	VWR	29442-072	Sterile, clear-bottom
Alamar blue (resazurin)	Fischer Scientific	DAL1100	Molecular Probes cell viability reagent
Benzalkonium chloride solution	Sigma-Aldrich	63249	50% in H20
Biosafety cabinet
Cytation 5 plate reader	BioTek	CYT5MPV	Cell imaging multi-mode reader
Fetal bovine serum	ThermoFischer Scientific	12484028	Qualified, heat inactivated, Canada
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	For cell culture, powder
Incubator
Lanosterol	Sigma-Aldrich	L5768	≥93%, powder
L-glutamine	Sigma-Aldrich		For cell culture, powder
Medium (M-199)	Sigma-Aldrich	M3769	Modified, with Earle′s salts, without L-glutamine, sodium bicarbonate, and phenol red, powder, suitable for cell culture
Pasteur pipettes			5 3/4'', with and without cotton
Penicillin-Streptomycin	ThermoFischer Scientific	15140122	Liquid (10,000 U/mL)
Phospate buffer saline (PBS)			liquid, sterile, suitable for cell culture
Pipette tips (100 µL, 1,000 µL, 5,000 µL)	VWR		Sterile
ScanTox (lens laser-scanner)	Specially developed in-house	N/A	Scans lens with a laser to determine lens optical quality
ScanTox culture chamber	Specially developed in-house	N/A	Holds bovine lens in place during testing and culturing
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	For cell culture, powder
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S2770	1.0 N, BioReagent, suitable for cell culture