Sistema de cultura de órgãos para avaliação da toxicidade de excipientes e produtos farmacêuticos para tratamento intraocular

Resumo

O objetivo deste protocolo é avaliar as alterações na atividade metabólica e na função refrativa do cristalino em resposta ao tratamento experimental.

Resumo

Como a principal causa de cegueira, a catarata é um fardo significativo para as dezenas de milhões de pessoas afetadas globalmente por essa condição. A exposição a produtos químicos, entre outros fatores ambientais, é uma causa estabelecida de catarata. Os testes de toxicidade ocular podem avaliar se os produtos farmacêuticos e seus componentes podem contribuir para danos ao cristalino que podem levar à catarata ou auxiliar no tratamento da catarata.

Estudos in vitro e testes in vivo em animais podem ser usados para avaliar a segurança de produtos químicos antes de estudos clínicos. O teste de Draize - o padrão atual in vivo para testes de toxicidade ocular e irritação - foi criticado por falta de sensibilidade e medições objetivas para determinar a toxicidade ocular. Os ensaios in vitro baseados em células são limitados, pois as culturas de células não podem modelar adequadamente uma lente funcional intacta.

O método aqui descrito é uma alternativa in vitro sensível aos ensaios em animais, concebida para avaliar a resposta do cristalino bovino intacto ao tratamento, tanto ao nível da actividade celular como ao desempenho refractivo global. O reagente não tóxico resazurina é metabolizado proporcionalmente ao nível de atividade celular. O ensaio de scanner a laser de lente mede a capacidade da lente de refratar feixes de luz incidentes em um único ponto com erro mínimo, diretamente relevante para sua função natural. O método pode ser usado para determinar alterações agudas e tardias na lente, bem como a recuperação da lente de exposições químicas ou ambientais.

Introdução

Afetando mais de 20 milhões de pessoas, a catarata é a causa mais prevalente de cegueira em todo o mundo ^1,2. A catarata é mais comumente causada por alterações relacionadas à idade no cristalino, mas também é induzida por trauma, condições genéticas, doenças ou exposições tóxicas². Atualmente, o tratamento envolve intervenção cirúrgica para substituição do cristalino, um procedimento caro e invasivo acessível principalmente para quem está em países desenvolvidos. A extensa carga da catarata direcionou décadas de pesquisa para a prevenção da catarata e o desenvolvimento de tratamentos não cirúrgicos. Em ambos os casos, a importância dos testes pré-clínicos para toxicidade, eficácia e farmacocinética de medicamentos oftálmicos é fundamental. Esse processo de desenvolvimento de medicamentos depende muito das informações fornecidas por estudos realizados em animais.

O padrão atual para testes de toxicidade ocular in vivo é o teste de Draize, envolvendo a entrega de um composto de teste ao saco conjuntival de um animal vivo. O teste tem sido significativamente criticado, principalmente no que diz respeito à ética animal, subjetividade, baixa repetibilidade e variabilidade³. Além disso, não há nenhum componente do teste de Draize que monitore diretamente os efeitos das substâncias de teste na lente. Esforços consideráveis têm sido investidos no desenvolvimento de modelos alternativos in vitro ⁴. No entanto, nenhum foi suficientemente validado para substituir o teste de Draize⁵. Da mesma forma, muitos desses modelos enfrentam limitações no que diz respeito à aplicação direta à catarata e outras patologias complexas⁶. Por exemplo, os métodos que classificam a transparência da lente quando colocados sobre uma grade são inerentemente subjetivos⁷. Os estudos de cultura celular são confiáveis e altamente utilizados, embora as características da monocamada celular possam divergir da cultura primária de tecidos⁸.

Lentes inteiras podem ser dissecadas dos olhos dos animais e cultivadas para manter sua estrutura e função originais. Um ensaio que é útil para avaliar a função do cristalino, mantendo a condição do órgão, é o ensaio de scanner a laser de lente envolvendo um scanner desenvolvido na Universidade de Waterloo, no Canadá. O ensaio é um sistema de varredura que usa uma série de projeções a laser para medir a qualidade óptica ou o desempenho de refração da lente. As lentes são digitalizadas em suas câmaras de cultura personalizadas de dois segmentos, permitindo que os feixes passem de baixo para cima através da lente (Figura 1A). Uma câmera fixada dentro do scanner captura a imagem do laser passando pela lente em vários pontos. O software do scanner calcula a distância atrás da lente na qual ela se cruza com um eixo central (distância do vértice traseiro, BVD), produzindo uma série de medições que indicam a consistência com que a lente focaliza a luz em um único ponto (Figura 1).

As propriedades celulares da lente, como o arranjo apertado e ordenado de suas células, ajudam a manter a transparência e minimizar a dispersão para que a lente possa focalizar funcionalmente a luz⁹. Essa medida pode ser usada para interpretar o quão significativamente um produto químico interrompe a estrutura essencial da lente, como o índice de refração gradiente, e quanta função é comprometida devido às opacidades induzidas. Outros estudos que acompanharam a resposta de lentes cultivadas e vesículas do cristalino sugerem que a dispersão da luz é um produto de mudanças estruturais, em comparação com as alterações metabólicas, e que as interrupções nos lipídios e proteínas do cristalino podem afetar o índice de refração e, consequentemente, aumentar a dispersão^10,11.

O scanner a laser de lente pode ser usado em conjunto com reagentes metabólicos em ensaios para determinar medidas bioquímicas de toxicidade celular. A resazurina é um reagente químico não tóxico metabolizado por células ativas, produzindo um produto reduzido (resorufina) com fluorescência mensurável¹². O cristalino é amplamente desprovido de organelas, exceto as mitocôndrias metabolicamente ativas concentradas no epitélio anterior e nas células das fibras corticais superficiais, preenchendo os requisitos energéticos do cristalino^13,14. Danos ao cristalino no nível celular podem interromper o metabolismo e muitas vezes precedem o início de alterações estruturais patogênicas e catarata¹⁵.

O objetivo deste método é avaliar o efeito das exposições xenobióticas e ambientais no cristalino, o que pode contribuir para o desenvolvimento da catarata. O protocolo envolve dois ensaios para avaliar o efeito de um tratamento usando o cristalino bovino cultivado. A vantagem dessa abordagem é que ela fornece uma avaliação celular e funcional de como o cristalino, como tecido primário, responde ao tratamento. É uma avaliação sensível e objetiva do cristalino em comparação com outros métodos comuns 16,17,18.

O modelo tem sido usado com sucesso para avaliar os efeitos de várias exposições, incluindo surfactantes, produtos de consumo, álcoois e radiação ultravioleta 17,19,20. Mudanças na qualidade óptica estão consistentemente presentes em lentes cultivadas como resposta à exposição tóxica²¹. A capacidade desse método de manter a cultura do cristalino a longo prazo é adequada para monitorar o efeito potencialmente retardado de um composto e a recuperação do cristalino de danos induzidos ou catarata^22,23. Os resultados produzidos a partir da aplicação deste protocolo podem ser usados para reduzir a dependência de testes em animais no desenvolvimento de produtos oftálmicos.

Protocolo

Todos os protocolos experimentais foram realizados em conformidade com as políticas de ética da Universidade de Waterloo para pesquisa usando tecido animal. Os olhos bovinos para o presente estudo foram fornecidos em abatedouro, obtidos de vacas não leiteiras poucas horas após a morte, e foram dissecados imediatamente, um processo que leva até 8 h para obter os olhos. Os olhos devem ser dissecados imediatamente para preservar a esterilidade e a qualidade da dissecção. O meio de cultura é preparado para um pH de 7,4 e filtrado estéril antes da suplementação com FBS²¹. Todos os procedimentos são realizados em condições estéreis, com fontes de materiais e equipamentos listados na Tabela de Materiais.

1. Cultura de lentes bovinas

1. Disseque as lentes removendo os músculos e tecidos extraoculares da esclera, removendo a metade posterior do globo e o vítreo, removendo a íris e o corpo ciliar junto com a lente e, em seguida, cortando as inserções zonulares, com o corte final posicionado de forma que a lente caia na câmara de cultura cheia de meio.
2. Cultura das lentes dissecadas em câmaras personalizadas com base adaptada ao sistema de varredura a laser, com 21 mL de meio filtrado estéril, a 37 °C e 5% de CO₂. Use meio de cultura suplementado com soro fetal bovino (FBS) a 3% com penicilina-estreptomicina a 1%, 9,4 g/L M-199, 0,1 g/L de L-glutamina, 5,96 g/L de HEPES, 2,2 g/L de bicarbonato de sódio e 7 mL/L de NaOH. Armazene o meio de cultura não utilizado na geladeira por até 7 dias.
3. Substitua o meio de cultura a cada 1-2 dias. Aquecer o meio de cultura durante uma hora a 37 °C antes da utilização. Use uma pipeta Pasteur estéril conectada por sucção para aspirar o meio de uma câmara de cultura individual e reabastecer imediatamente com o meio suplementado.
4. Cultive as lentes por 48 h após a dissecção para dar tempo para que os danos físicos se manifestem. Inspecionar e analisar a qualidade óptica das lentes de acordo com a seção 4 antes da inclusão em um experimento.
   NOTA: As lentes são orientadas voltadas para baixo em preparação para o ensaio de scanner a laser.

2. Procedimento de controlo

1. Preparar uma solução com a concentração desejada de um agente solubilizante compatível com o composto químico e o meio de cultura.
2. Prepare uma solução de controle do veículo adicionando o agente solubilizante ao meio suplementado. Aquecer a solução de controlo durante uma hora a 37 °C antes da experimentação.
3. Use uma pipeta Pasteur conectada à sucção para aspirar o meio de cultura das câmaras das lentes de controle. Reabasteça as câmaras com a solução de controle. Se necessário, execute esta etapa com amostras em triplicado.
   NOTA: É necessário um volume mínimo de 7 mL para cobrir completamente a lente na posição anterior voltada para cima. As condições para controles no estudo atual foram 21 mL de controle de meio não tratado, 21 mL de um meio de controle de veículo e 7 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
4. Cultive as lentes em meio de controle por 2 dias e, em seguida, substitua por um novo meio de controle de acordo com a seção 1. Para exposições de curta duração, aspirar a solução de controlo das câmaras e enxaguar pelo menos três vezes com meio de cultura não suplementado antes de retomar o protocolo de cultura do cristalino conforme descrito no ponto 1.0.
5. Deixe as lentes se aclimatarem na incubadora a 37 °C e 5% de CO₂ por pelo menos 3.5 h antes da avaliação da qualidade óptica.

3. Procedimento de exposição

1. Preparar uma solução com a concentração desejada de um agente solubilizante compatível com o composto químico e o meio de cultura. Combine o produto químico com o agente solubilizante, permitindo o tempo adequado para interação, se necessário.
   NOTA: A 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina foi usada no presente estudo para aumentar a solubilidade do lanosterol (0,033 g / L) em meio. A solução de cloreto de benzalcônio (BAK 0,0075%) foi preparada usando PBS.
2. Incorpore o produto químico solubilizado no meio de cultura. Prepare um volume total suficiente para fornecer 21 mL de meio para todas as amostras de lentes. Aquecer o meio experimental durante uma hora a 37 °C antes da experimentação.
3. Use uma pipeta Pasteur conectada à sucção para aspirar o meio de cultura das câmaras do cristalino. Reabasteça imediatamente as câmaras com a solução de teste. Após o intervalo de exposição, substitua por meio de cultura suplementado, realizando um enxágue primeiro, se necessário. Se necessário, execute esta etapa com amostras em triplicado.
   NOTA: No presente estudo, as condições de teste foram 21 mL de meio suplementado com lanosterol e 7 mL de uma solução BAK 0,0075%. É necessário um volume mínimo de 7 mL para cobrir completamente a lente. Nesse caso, as lentes devem primeiro ser orientadas anteriormente voltadas para cima. Uma pipeta Pasteur pode ser usada para criar uma corrente na câmara de cultura com parte do meio de cultura circundante para reposicionar a lente.
4. Devolva as lentes à incubadora por pelo menos 3.5 h para aclimatação antes da avaliação da qualidade óptica.
   NOTA: As lentes são orientadas voltadas para baixo em preparação para o ensaio de scanner a laser.

4. Ensaio de qualidade óptica (lente laser-scanner)

1. Certifique-se de que as lentes estejam orientadas com a face anterior voltada para baixo e visualmente niveladas na câmara de cultura, usando a técnica da etapa 3.3 para ajustar a posição da lente, se necessário.
   NOTA: Esta posição garante que o feixe incidente seja refletido para cima através do fundo da câmara e passe pela lente da superfície anterior para a posterior.
2. Posicione uma câmara de cultura de lentes no scanner a laser de forma que o pino do carro da câmara se encaixe na ranhura na base da câmara.
3. Selecione a lente e o ponto de varredura para os quais deseja executar uma varredura, clique com o botão direito do mouse na lente de varredura e aguarde até que o scanner solicite que o feixe seja encontrado e alinhado. Selecione o início e os pontos finais bem distanciados para o feixe atrás da lente. Certifique-se de que o feixe central esteja alinhado usando os botões de ajuste bruto e fino no software do scanner e o botão de ajuste no scanner. Quando o feixe estiver alinhado, clique em calibrar e insira uma seleção apropriada de etapas radiais e separação de feixe.
   NOTA: Para este estudo usando a lente bovina, as configurações para degraus radiais e separação de feixe foram definidas para 10 degraus e 0,5 mm, respectivamente. A primeira varredura que o scanner executa serve para calibrar o scanner a laser. Isso é necessário uma vez, e todas as varreduras adicionais da lente podem ser realizadas diretamente após o alinhamento.
4. Depois que o scanner for calibrado, clique em digitalizar. Aguarde até que os valores sejam gerados para a média BVD, desvio padrão e erro ao longo de um eixo após a conclusão da varredura da lente e o escopo do feixe foi definido. Defina o osciloscópio de onde os feixes saem da lente até o ponto final desejado, selecionando a distância máxima atrás da lente e excluindo qualquer interferência aparente.
5. Use o gráfico gerado para visualizar as distâncias individuais dos vértices posteriores para cada viga.
   NOTA: Exclua feixes que passam pelas suturas da lente. Para excluir uma viga, use a legenda na tela para clicar com o botão direito do mouse em uma viga individual e selecione excluir.
6. Gire manualmente a posição da base da câmara de cultura dentro do scanner em 90°, de modo que a segunda varredura ao longo da superfície anterior da lente seja perpendicular à varredura anterior. Certifique-se de que o feixe central esteja alinhado conforme detalhado na etapa 4.3 e, em seguida, digitalize a lente.

5. Ensaio de atividade metabólica (resazurina)

1. Prepare o meio sem FBS. Aquecer o meio durante uma hora a 37 °C. Prepare 50 mL de reagente de resazurina a 8% em meio não suplementado.
   NOTA: Basta preparar 50 mL para encher todos os poços em uma placa de 12 poços. A solução deve ser preparada estéril em condições de penumbra em um recipiente opaco, pois a resazurina é sensível à luz.
2. Adicione 3,8 mL de solução de resazurina a 8% a cada poço dentro de uma placa estéril de 12 poços de fundo transparente para cobrir a lente.
3. Use colheres de metal estéreis para levantar cuidadosamente as lentes sob a superfície posterior e faça um enxágue usando uma pipeta Pasteur para lavar a lente com um pequeno volume de meio de cultura não suplementado. Coloque as lentes individualmente em cada poço.
4. Incubar a placa do poço a 37 °C e 5% de CO₂ durante 5 h. Após a incubação, remova as lentes com conchas de metal dos poços e coloque-as em um recipiente para descarte de dejetos animais. Transfira uma amostra de 100 μL de cada poço para uma placa estéril, de fundo transparente, de 96 poços.
   NOTA: As lentes podem ser avaliadas várias vezes com o ensaio de atividade metabólica. Neste caso, devolva as lentes às câmaras de cultura com meio fresco para incubação. O ensaio de atividade metabólica é melhor realizado quando todos os exames são concluídos, pois o corante pode afetar as medições de BVD.
5. Meça a fluorescência final das amostras de 100 μL usando um leitor de placa fluorescente, com os comprimentos de onda de excitação e emissão definidos em 560 nm e 590 nm, respectivamente.

6. Análise dos dados

1. Para o ensaio de qualidade óptica, calcule a média dos valores calculados pelo software para o erro BVD²⁴ das duas varreduras realizadas em cada ponto de tempo. Execute este cálculo para todas as lentes e todos os pontos de varredura.
2. Para o ensaio de atividade metabólica, colete os valores de fluorescência relativa do ponto final gerados pelo leitor de placas. Normalize os dados definindo a média de todos os valores de controle em um ponto de varredura como 100%. Calcule a atividade de cada lente como uma porcentagem do valor médio de controle para esse ponto de varredura.
3. Realize um teste de normalidade para todos os grupos experimentais. Supondo que os dados sejam normais, analise as diferenças de erro BVD entre lentes de controle e experimentais usando a ANOVA bidirecional. Além disso, execute o teste de comparações múltiplas post-hoc de Tukey. Realize uma ANOVA unidirecional e teste post-hoc de Dunnett para os dados de atividade metabólica.

Resultados

A Figura 2 e a Figura 3 (n = 6) demonstram os resultados de um estudo que testou o efeito do tratamento químico (lanosterol) no cristalino bovino. O lanosterol é um esterol natural no cristalino que já mostrou resultados promissores como uma potencial intervenção farmacêutica para catarata²⁵, embora isso ainda não tenha sido comprovado²⁶. O desenho do estudo incluiu um contr...

Discussão

O objetivo deste protocolo é avaliar diretamente os efeitos de produtos químicos ou exposições ambientais no cristalino em cultura de tecidos primários. Primeiro, as lentes são dissecadas e digitalizadas quanto à qualidade óptica. A prevenção da contaminação e a garantia da qualidade da dissecação são críticas. As lentes são escaneadas em intervalos periódicos para monitorar continuamente as mudanças na função de refração em relação ao grupo de controle ou condi?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
(2-Hydroxypropyl)-β-cyclodextrin	Sigma-Aldrich	H107	Powder
1 L bottle-top filtration system	VWR	97066-204	Full Assembly, bottle-top, 0.2 μm
100 mm Petri dish	VWR	89022-320	Slippable, media saver style, sterile
12 well-plate	Corning	353043	Sterile, clear-bottom
35 mm petri dish	VWR	25373-041	Falcon disposable petri dishes, sterile, Corning
96 well-plate	VWR	29442-072	Sterile, clear-bottom
Alamar blue (resazurin)	Fischer Scientific	DAL1100	Molecular Probes cell viability reagent
Benzalkonium chloride solution	Sigma-Aldrich	63249	50% in H20
Biosafety cabinet
Cytation 5 plate reader	BioTek	CYT5MPV	Cell imaging multi-mode reader
Fetal bovine serum	ThermoFischer Scientific	12484028	Qualified, heat inactivated, Canada
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	For cell culture, powder
Incubator
Lanosterol	Sigma-Aldrich	L5768	≥93%, powder
L-glutamine	Sigma-Aldrich		For cell culture, powder
Medium (M-199)	Sigma-Aldrich	M3769	Modified, with Earle′s salts, without L-glutamine, sodium bicarbonate, and phenol red, powder, suitable for cell culture
Pasteur pipettes			5 3/4'', with and without cotton
Penicillin-Streptomycin	ThermoFischer Scientific	15140122	Liquid (10,000 U/mL)
Phospate buffer saline (PBS)			liquid, sterile, suitable for cell culture
Pipette tips (100 µL, 1,000 µL, 5,000 µL)	VWR		Sterile
ScanTox (lens laser-scanner)	Specially developed in-house	N/A	Scans lens with a laser to determine lens optical quality
ScanTox culture chamber	Specially developed in-house	N/A	Holds bovine lens in place during testing and culturing
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	For cell culture, powder
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S2770	1.0 N, BioReagent, suitable for cell culture