Sistema di coltura d'organo per la valutazione della tossicità del trattamento intraoculare Eccipienti e prodotti farmaceutici

Riepilogo

L'obiettivo di questo protocollo è valutare i cambiamenti nell'attività metabolica e nella funzione refrattiva del cristallino in risposta al trattamento sperimentale.

Abstract

Essendo la principale causa di cecità, la cataratta è un onere significativo per le decine di milioni di persone colpite da questa condizione in tutto il mondo. L'esposizione chimica, tra gli altri fattori ambientali, è una causa accertata di cataratta. I test di tossicità oculare possono valutare se i prodotti farmaceutici e i loro componenti possono contribuire al danno al cristallino che può portare alla cataratta o aiutare il trattamento della cataratta.

Gli studi in vitro e i test in vivo sugli animali possono essere utilizzati per valutare la sicurezza delle sostanze chimiche prima degli studi clinici. Il test di Draize, l'attuale standard in vivo per i test di tossicità e irritazione oculare, è stato criticato per la mancanza di sensibilità e di misurazioni oggettive per determinare la tossicità oculare. I saggi in vitro basati su cellule sono limitati in quanto le colture cellulari non possono modellare in modo appropriato una lente funzionale intatta.

Il metodo qui descritto è un'alternativa in vitro sensibile ai test sugli animali, progettata per valutare la risposta del cristallino bovino intatto al trattamento sia a livello di attività cellulare che per le prestazioni refrattive complessive. Il reagente non tossico resazurina viene metabolizzato in proporzione al livello di attività cellulare. Il test laser scanner a lente misura la capacità della lente di rifrangere i fasci di luce incidenti in un singolo punto con un errore minimo, direttamente rilevante per la sua funzione naturale. Il metodo può essere utilizzato per determinare sia i cambiamenti acuti che quelli ritardati della lente, nonché il recupero della lente da esposizioni chimiche o ambientali.

Introduzione

La cataratta, che colpisce oltre 20 milioni di persone, è la causa più diffusa di cecità in tutto il mondo ^1,2. La cataratta è più comunemente dovuta a cambiamenti legati all'età del cristallino, ma è anche indotta da traumi, condizioni genetiche, malattie o esposizioni tossiche². Attualmente, il trattamento prevede l'intervento chirurgico per sostituire la lente, una procedura costosa e invasiva accessibile principalmente a chi vive nei paesi sviluppati. L'ampio carico di cataratta ha indirizzato decenni di ricerca verso la prevenzione della cataratta e lo sviluppo di trattamenti non chirurgici. In entrambi i casi, l'importanza dei test preclinici per la tossicità, l'efficacia e la farmacocinetica dei farmaci oftalmici è fondamentale. Questo processo di sviluppo dei farmaci si basa in larga misura sulle informazioni fornite dagli studi condotti sugli animali.

L'attuale standard per i test di tossicità oculare in vivo è il test di Draize, che prevede la somministrazione di un composto di prova nel sacco congiuntivale di un animale vivo. Il test è stato criticato in modo significativo, in particolare per quanto riguarda l'etica animale, la soggettività, la scarsa ripetibilità e la variabilità³. Inoltre, non esiste alcun componente del test di Draize che monitori direttamente gli effetti delle sostanze in esame sulla lente. Sono stati investiti notevoli sforzi nello sviluppo di modelli alternativi in vitro ⁴. Tuttavia, nessuno è stato sufficientemente convalidato per sostituire il test di Draize⁵. Allo stesso modo, molti di questi modelli incontrano limitazioni rispetto all'applicazione diretta alla cataratta e ad altre patologie complesse⁶. Ad esempio, i metodi che classificano la trasparenza dell'obiettivo quando viene posizionato su una griglia sono intrinsecamente soggettivi⁷. Gli studi sulle colture cellulari sono affidabili e altamente utilizzati, sebbene le caratteristiche del monostrato cellulare possano divergere dalla coltura tissutale primaria⁸.

Le lenti intere possono essere sezionate dagli occhi degli animali e coltivate per mantenere la loro struttura e funzione originali. Un test utile per valutare la funzione della lente mantenendo le condizioni dell'organo è il test dello scanner laser a lente che coinvolge uno scanner sviluppato presso l'Università di Waterloo in Canada. Il test è un sistema di scansione che utilizza una serie di proiezioni laser per misurare la qualità ottica o le prestazioni di rifrazione della lente. Le lenti vengono scansionate nelle loro camere di coltura personalizzate a due segmenti, consentendo ai raggi di passare dal basso attraverso la lente (Figura 1A). Una telecamera fissata all'interno dello scanner cattura l'immagine del laser che passa attraverso l'obiettivo in numerosi punti. Il software dello scanner calcola la distanza dietro la lente alla quale si interseca con un asse centrale (distanza del vertice posteriore, BVD), producendo una serie di misurazioni che indicano la coerenza con cui la lente focalizza la luce su un singolo punto (Figura 1).

Le proprietà cellulari della lente, come la disposizione stretta e ordinata delle sue celle, aiutano a mantenere la trasparenza e a ridurre al minimo la dispersione in modo che la lente possa focalizzare funzionalmente la luce⁹. Questa misura può essere utilizzata per interpretare in che misura una sostanza chimica interrompe la struttura essenziale della lente, come l'indice di rifrazione del gradiente, e quanta funzione è compromessa a causa delle opacità indotte. Altri studi che hanno seguito la risposta delle lenti coltivate e delle vescicole del cristallino suggeriscono che la diffusione della luce è un prodotto di cambiamenti strutturali, rispetto ai cambiamenti metabolici, e che le interruzioni dei lipidi e delle proteine del cristallino possono influenzare l'indice di rifrazione e di conseguenza aumentare la dispersione^10,11.

Lo scanner laser a lente può essere utilizzato in combinazione con i reagenti metabolici nei saggi per determinare le misure biochimiche della tossicità cellulare. La resazurina è un reagente chimico non tossico metabolizzato dalle cellule attive, che produce un prodotto ridotto (resorufina) con una fluorescenza misurabile¹². Il cristallino è in gran parte privo di organelli, ad eccezione dei mitocondri metabolicamente attivi concentrati all'interno dell'epitelio anteriore e delle cellule delle fibre corticali superficiali, che soddisfano i requisiti energetici del cristallino^13,14. Il danno al cristallino a livello cellulare può interrompere il metabolismo e spesso precede l'insorgenza di cambiamenti strutturali patogeni e cataratta¹⁵.

Lo scopo di questo metodo è valutare l'effetto delle esposizioni xenobiotiche e ambientali sul cristallino, che possono contribuire allo sviluppo della cataratta. Il protocollo prevede due saggi per valutare l'effetto di un trattamento con il cristallino bovino in coltura. Il vantaggio di questo approccio è che fornisce una valutazione sia cellulare che funzionale di come il cristallino come tessuto primario risponde al trattamento. Si tratta di una valutazione sensibile e obiettiva della lente rispetto ad altri metodi comuni 16,17,18.

Il modello è stato utilizzato con successo per valutare gli effetti di varie esposizioni, tra cui tensioattivi, prodotti di consumo, alcoli e radiazioni ultraviolette 17,19,20. I cambiamenti nella qualità ottica sono costantemente presenti nelle lenti coltivate in risposta all'esposizione tossica²¹. La capacità di questo metodo di mantenere la coltura del cristallino a lungo termine è adatta per monitorare l'effetto potenzialmente ritardato di un composto e il recupero del cristallino dal danno indotto o dalla cataratta^22,23. I risultati ottenuti dall'applicazione di questo protocollo possono essere utilizzati per ridurre la dipendenza dalla sperimentazione animale nello sviluppo di prodotti oftalmici.

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Protocollo

Tutti i protocolli sperimentali sono stati eseguiti in conformità con le politiche etiche dell'Università di Waterloo per la ricerca che utilizza tessuti animali. Gli occhi bovini per il presente studio sono stati forniti al macello, ottenuti da vacche non da latte entro poche ore dalla morte, e sono stati sezionati immediatamente, un processo che richiede fino a 8 ore dall'ottenimento degli occhi. Gli occhi devono essere sezionati immediatamente per preservare la sterilità e la qualità della dissezione. Il terreno di coltura viene preparato a un pH di 7,4 e filtrato sterile prima dell'integrazione con FBS²¹. Tutte le procedure vengono eseguite in condizioni sterili, con le fonti di materiali e attrezzature elencate nella Tabella dei materiali.

1. Coltura di cristallino bovino

1. Sezionare le lenti rimuovendo i muscoli extraoculari e il tessuto dalla sclera, rimuovendo la metà posteriore del globo e il vitreo, rimuovendo l'iride e il corpo ciliare insieme alla lente, quindi tagliando via gli attacchi zonulari, con il taglio finale posizionato in modo tale che la lente cada nella camera di coltura a riempimento medio.
2. Coltura delle lenti sezionate in camere personalizzate con una base adattata al sistema di scansione laser, con 21 mL di terreno filtrato sterile, a 37 °C e 5% di CO₂. Utilizzare un terreno di coltura integrato con siero fetale bovino (FBS) al 3% con penicillina-streptomicina all'1%, 9,4 g/L di M-199, 0,1 g/L di L-glutammina, 5,96 g/L di HEPES, 2,2 g/L di bicarbonato di sodio e 7 mL/L di NaOH. Conservare il terreno di coltura inutilizzato in frigorifero per un massimo di 7 giorni.
3. Sostituire il terreno di coltura ogni 1-2 giorni. Riscaldare il terreno di coltura per un'ora a 37 °C prima dell'uso. Utilizzare una pipetta sterile Pasteur collegata all'aspirazione per aspirare il terreno da una camera di coltura individuale e rabboccare immediatamente con il terreno integrato.
4. Coltivare le lenti per 48 ore dopo la dissezione per consentire la manifestazione del danno fisico. Ispezionare e scansionare le lenti per verificarne la qualità ottica secondo la sezione 4 prima di includerle in un esperimento.
   NOTA: Le lenti sono orientate a faccia in giù in preparazione per il test con scanner laser.

2. Procedura di controllo

1. Preparare una soluzione con la concentrazione desiderata di un agente solubilizzante compatibile con il composto chimico e il terreno di coltura.
2. Preparare una soluzione di controllo del veicolo aggiungendo l'agente solubilizzante al mezzo integrato. Riscaldare la soluzione di controllo per un'ora a 37 °C prima della sperimentazione.
3. Utilizzare una pipetta Pasteur collegata all'aspirazione per aspirare il terreno di coltura dalle camere delle lenti di controllo. Riempire le camere con la soluzione di controllo. Se necessario, eseguire questo passaggio con campioni in triplice copia.
   NOTA: È necessario un volume minimo di 7 ml per coprire completamente la lente nella posizione anteriore rivolta verso l'alto. Le condizioni per i controlli nel presente studio erano 21 mL di mezzo di controllo non trattato, 21 mL di un mezzo di controllo del veicolo e 7 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
4. Coltivare le lenti nel mezzo di controllo per 2 giorni, quindi sostituirle con un nuovo mezzo di controllo secondo la sezione 1. Per esposizioni a breve termine, aspirare la soluzione di controllo dalle camere ed eseguire un risciacquo almeno tre volte con terreno di coltura non integrato prima di riprendere il protocollo di coltura della lente come descritto nella sezione 1.0.
5. Lasciare acclimatare le lenti nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO₂ per almeno 3,5 ore prima della valutazione della qualità ottica.

3. Procedura di esposizione

1. Preparare una soluzione con la concentrazione desiderata di un agente solubilizzante compatibile con il composto chimico e il terreno di coltura. Combinare la sostanza chimica con l'agente solubilizzante, lasciando il tempo appropriato per l'interazione, se necessario.
   NOTA: La 2-idrossipropil-β-ciclodestrina è stata utilizzata nel presente studio per migliorare la solubilità del lanosterolo (0,033 g/L) nel terreno. La soluzione di cloruro di benzalconio (BAK 0,0075%) è stata preparata utilizzando PBS.
2. Incorporare la sostanza chimica solubilizzata nel terreno di coltura. Preparare un volume totale sufficiente a fornire 21 mL di terreno a tutti i campioni di lenti. Riscaldare il terreno sperimentale per un'ora a 37 °C prima della sperimentazione.
3. Utilizzare una pipetta Pasteur collegata all'aspirazione per aspirare il terreno di coltura dalle camere delle lenti. Riempire immediatamente le camere con la soluzione di prova. Dopo l'intervallo di esposizione, sostituire con terreno di coltura integrato, eseguendo prima un risciacquo se necessario. Se necessario, eseguire questo passaggio con campioni in triplice copia.
   NOTA: Nel presente studio, le condizioni di test erano 21 mL di terreno integrato con lanosterolo e 7 mL di una soluzione BAK 0,0075%. È necessario un volume minimo di 7 ml per coprire completamente la lente. In questo caso, le lenti devono essere prima orientate anteriormente rivolte verso l'alto. Una pipetta Pasteur può essere utilizzata per creare una corrente nella camera di coltura con parte del terreno di coltura circostante per riposizionare la lente.
4. Rimettere le lenti nell'incubatrice per almeno 3,5 ore per acclimatarle prima della valutazione della qualità ottica.
   NOTA: Le lenti sono orientate a faccia in giù in preparazione per il test con scanner laser.

4. Saggio della qualità ottica (laser-scanner a lenti)

1. Assicurarsi che le lenti siano orientate con la parte anteriore rivolta verso il basso e visivamente livellate nella camera di coltura, utilizzando la tecnica del passaggio 3.3 per regolare la posizione della lente, se necessario.
   NOTA: Questa posizione garantisce che il raggio incidente venga riflesso attraverso il fondo della camera e passi attraverso la lente dalla superficie anteriore a quella posteriore.
2. Posizionare una camera di coltura delle lenti nello scanner laser in modo che il perno del carrello della camera si inserisca nella fessura della base della camera.
3. Selezionare la lente e il punto di scansione per i quali eseguire una scansione, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla lente di scansione e attendere che lo scanner richieda di trovare e allineare il raggio. Selezionare l'inizio e i punti finali ben distanti per il raggio dietro la lente. Assicurarsi che il raggio centrale sia allineato utilizzando i pulsanti di regolazione grossolana e fine nel software dello scanner e la manopola di regolazione sullo scanner. Quando il raggio è allineato, fare clic su calibra e inserire una selezione appropriata di passi radiali e separazione del raggio.
   NOTA: Per questo studio con la lente bovina, le impostazioni per i gradini radiali e la separazione del fascio sono state impostate rispettivamente su 10 passi e 0,5 mm. La prima scansione eseguita dallo scanner serve a calibrare lo scanner laser. Questa operazione è necessaria una sola volta e tutte le scansioni aggiuntive dell'obiettivo possono essere eseguite direttamente dopo l'allineamento.
4. Una volta calibrato lo scanner, fare clic su Scansione. Attendere che vengano generati i valori per la media BVD, la deviazione standard e l'errore lungo un asse dopo il completamento della scansione dell'obiettivo e che l'ambito del raggio sia stato impostato. Impostare il cannocchiale da cui i raggi escono dall'obiettivo al punto finale desiderato, selezionando la distanza massima dietro l'obiettivo escludendo qualsiasi interferenza apparente.
5. Utilizzare il grafico generato per visualizzare le distanze dei singoli vertici posteriori per ciascun raggio.
   NOTA: Escludere i raggi che passano attraverso le suture delle lenti. Per escludere una trave, utilizzare la legenda sullo schermo per fare clic con il pulsante destro del mouse su una singola trave e selezionare Escludi.
6. Ruotare manualmente la posizione della base della camera di coltura all'interno dello scanner di 90°, in modo che la seconda scansione lungo la superficie anteriore della lente sia perpendicolare alla scansione precedente. Assicurarsi che il raggio centrale sia allineato come descritto al punto 4.3, quindi eseguire la scansione dell'obiettivo.

5. Saggio dell'attività metabolica (resazurina)

1. Preparare il terreno senza FBS. Scaldare il fluido per un'ora a 37 °C. Preparare 50 mL di reagente di resazurina all'8% in terreno non integrato.
   NOTA: È sufficiente preparare 50 ml per riempire tutti i pozzetti in una piastra a 12 pozzetti. La soluzione deve essere preparata sterile in condizioni di scarsa illuminazione in un contenitore opaco, poiché la resazurina è sensibile alla luce.
2. Aggiungere 3,8 mL di soluzione di resazurina all'8% in ciascun pozzetto all'interno di una piastra sterile a 12 pozzetti a fondo trasparente per coprire la lente.
3. Utilizzare misurini metallici sterili per sollevare con cautela le lenti da sotto la superficie posteriore ed eseguire un risciacquo con una pipetta Pasteur per lavare la lente con un piccolo volume di terreno di coltura non integrato. Posiziona le lenti singolarmente in ogni pozzetto.
4. Incubare la piastra a pozzetti a 37 °C e 5% di CO₂ per 5 ore. Dopo l'incubazione, rimuovere le lenti con palette metalliche dai pozzetti e metterle in un contenitore per lo smaltimento dei rifiuti animali. Trasferire un campione da 100 μl da ciascun pozzetto in una piastra sterile a fondo trasparente da 96 pozzetti.
   NOTA: Le lenti possono essere valutate più volte con il test dell'attività metabolica. In questo caso, rimettere le lenti nelle camere di coltura con un terreno fresco per l'incubazione. Il test dell'attività metabolica viene eseguito al meglio una volta completate tutte le scansioni, poiché il colorante può influenzare le misurazioni della BVD.
5. Misurare la fluorescenza finale dei campioni da 100 μl utilizzando un lettore di piastre fluorescenti, con le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione impostate rispettivamente a 560 nm e 590 nm.

6. Analisi dei dati

1. Per il test della qualità ottica, calcolare la media dei valori calcolati dal software per l'errore BVD²⁴ dalle due scansioni eseguite in ciascun momento. Eseguire questo calcolo per tutti gli obiettivi e tutti i punti di scansione.
2. Per il test dell'attività metabolica, raccogliere i valori di fluorescenza relativi all'endpoint generati dal lettore di piastre. Normalizzare i dati impostando la media di tutti i valori di controllo in un punto di scansione su 100%. Calcolare l'attività di ciascuna lente come percentuale del valore medio di controllo per quel punto di scansione.
3. Eseguire un test di normalità per tutti i gruppi di esperimenti. Supponendo che i dati siano normali, analizzare le differenze di errore BVD tra le lenti di controllo e sperimentali utilizzando l'ANOVA a due vie. Inoltre, esegui il test di confronto multiplo post-hoc di Tukey. Eseguire un'ANOVA unidirezionale e il test post-hoc di Dunnett per i dati dell'attività metabolica.

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Risultati

La Figura 2 e la Figura 3 (n = 6) illustrano i risultati di uno studio che ha testato l'effetto del trattamento chimico (lanosterolo) sul cristallino bovino. Il lanosterolo è uno sterolo presente in natura nel cristallino che una volta ha mostrato risultati promettenti come potenziale intervento farmaceutico per la cataratta²⁵, anche se questo deve ancora essere dimostrato²⁶. Il d...

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Discussione

Lo scopo di questo protocollo è quello di valutare direttamente gli effetti delle sostanze chimiche o delle esposizioni ambientali sul cristallino nella coltura di tessuti primari. Innanzitutto, le lenti vengono sezionate e scansionate per verificarne la qualità ottica. La prevenzione della contaminazione e la garanzia della qualità della dissezione sono fondamentali. Le lenti vengono scansionate a intervalli periodici per monitorare continuamente i cambiamenti nella funzione di rifra...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
(2-Hydroxypropyl)-β-cyclodextrin	Sigma-Aldrich	H107	Powder
1 L bottle-top filtration system	VWR	97066-204	Full Assembly, bottle-top, 0.2 μm
100 mm Petri dish	VWR	89022-320	Slippable, media saver style, sterile
12 well-plate	Corning	353043	Sterile, clear-bottom
35 mm petri dish	VWR	25373-041	Falcon disposable petri dishes, sterile, Corning
96 well-plate	VWR	29442-072	Sterile, clear-bottom
Alamar blue (resazurin)	Fischer Scientific	DAL1100	Molecular Probes cell viability reagent
Benzalkonium chloride solution	Sigma-Aldrich	63249	50% in H20
Biosafety cabinet
Cytation 5 plate reader	BioTek	CYT5MPV	Cell imaging multi-mode reader
Fetal bovine serum	ThermoFischer Scientific	12484028	Qualified, heat inactivated, Canada
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	For cell culture, powder
Incubator
Lanosterol	Sigma-Aldrich	L5768	≥93%, powder
L-glutamine	Sigma-Aldrich		For cell culture, powder
Medium (M-199)	Sigma-Aldrich	M3769	Modified, with Earle′s salts, without L-glutamine, sodium bicarbonate, and phenol red, powder, suitable for cell culture
Pasteur pipettes			5 3/4'', with and without cotton
Penicillin-Streptomycin	ThermoFischer Scientific	15140122	Liquid (10,000 U/mL)
Phospate buffer saline (PBS)			liquid, sterile, suitable for cell culture
Pipette tips (100 µL, 1,000 µL, 5,000 µL)	VWR		Sterile
ScanTox (lens laser-scanner)	Specially developed in-house	N/A	Scans lens with a laser to determine lens optical quality
ScanTox culture chamber	Specially developed in-house	N/A	Holds bovine lens in place during testing and culturing
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	For cell culture, powder
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S2770	1.0 N, BioReagent, suitable for cell culture