מערכת תרבית איברים להערכת הרעילות של חומרי עזר לטיפול תוך עיני ותרופות

Summary

מטרת פרוטוקול זה היא להעריך שינויים בפעילות המטבולית ובתפקוד השבירה של העדשה בתגובה לטיפול ניסיוני.

Abstract

כגורם המוביל לעיוורון, קטרקט מהווה נטל משמעותי עבור עשרות מיליוני אנשים ברחבי העולם המושפעים ממצב זה. חשיפה לכימיקלים, בין שאר הגורמים הסביבתיים, היא גורם מבוסס לקטרקט. בדיקת רעילות עיניים יכולה להעריך אם תרופות ומרכיביהן עלולים לתרום לנזק לעדשות שעלול להוביל לקטרקט או לסייע בטיפול בקטרקט.

ניתן להשתמש במחקרי מבחנה וניסויים בבעלי חיים in vivo להערכת הבטיחות של כימיקלים לפני מחקרים קליניים. מבחן Draize - התקן הנוכחי in vivo לבדיקת רעילות וגירוי בעיניים - זכה לביקורת על חוסר רגישות ומדידות אובייקטיביות לקביעת רעילות עיניים. בדיקות מבוססות תאים במבחנה מוגבלות מכיוון שתרביות תאים אינן יכולות לדגמן כראוי עדשה פונקציונלית שלמה.

השיטה המתוארת כאן היא חלופה רגישה במבחנה לניסויים בבעלי חיים, שנועדה להעריך את תגובת עדשת הבקר השלמה לטיפול הן ברמת הפעילות התאית והן לביצועי השבירה הכוללים. המגיב הלא רעיל רזזורין עובר חילוף חומרים ביחס לרמת פעילות התא. בדיקת סורק הלייזר של העדשה מודדת את יכולתה של העדשה לשבור קרני אור לנקודה אחת עם שגיאה מינימלית, הרלוונטית ישירות לתפקודה הטבעי. השיטה עשויה לשמש לקביעת שינויים חריפים ומאוחרים בעדשה, כמו גם התאוששות העדשה מחשיפות כימיות או סביבתיות.

Introduction

קטרקט, המשפיע על למעלה מ-20 מיליון אנשים, הוא הגורם השכיח ביותר לעיוורון ברחבי העולם ^1,2. קטרקט נובע לרוב משינויים הקשורים לגיל בעדשה אך נגרם גם מטראומה, מצבים גנטיים, מחלות או חשיפות רעילות². כיום הטיפול כולל התערבות כירורגית להחלפת העדשה, הליך יקר ופולשני הנגיש בעיקר למדינות המפותחות. הנטל הנרחב של קטרקט הפנה עשרות שנים של מחקר למניעת קטרקט ופיתוח טיפול לא ניתוחי. בשני המקרים, החשיבות של בדיקות פרה-קליניות לרעילות, יעילות ופרמקוקינטיקה של תרופות עיניים היא בעלת חשיבות עליונה. תהליך זה של פיתוח תרופות מסתמך במידה רבה על המידע המסופק על ידי מחקרים שבוצעו בבעלי חיים.

התקן הנוכחי לבדיקת רעילות עיניים in vivo הוא מבחן Draize, הכולל מסירת תרכובת בדיקה לשק הלחמית של בעל חיים חי. המבחן זכה לביקורת משמעותית, במיוחד בכל הנוגע לאתיקה של בעלי חיים, סובייקטיביות, חזרתיות גרועה ושונות³. בנוסף, אין מרכיב בבדיקת Draize המנטר ישירות את השפעות חומרי הבדיקה על העדשה. מאמץ ניכר הושקע בפיתוח מודלים חלופיים במבחנה ⁴. עם זאת, אף אחד מהם לא אומת מספיק כדי להחליף את מבחן דרייז⁵. באופן דומה, רבים מהמודלים הללו מתמודדים עם מגבלות ביחס ליישום ישיר על קטרקט ופתולוגיות מורכבות אחרות⁶. לדוגמה, שיטות המדרגות שקיפות עדשה כאשר הן מונחות על רשת הן סובייקטיביות מטבען⁷. מחקרי תרביות תאים אמינים ומנוצלים מאוד, אם כי מאפייני תאים חד-שכבתיים עשויים לסטות מתרבית רקמה ראשונית⁸.

ניתן לנתח עדשות שלמות מעיניהם של בעלי חיים ולתרבת אותן כדי לשמור על המבנה והתפקוד המקוריים שלהן. בדיקה אחת שימושית להערכת תפקוד העדשה תוך שמירה על מצב האיבר היא בדיקת סורק הלייזר של העדשה הכוללת סורק שפותח באוניברסיטת ווטרלו בקנדה. הבדיקה היא מערכת סריקה המשתמשת בסדרה של הקרנות לייזר כדי למדוד את האיכות האופטית או ביצועי השבירה של העדשה. העדשות נסרקות בתאי התרבית הדו-מקטעים המותאמים אישית שלהן, מה שמאפשר לאלומות לעבור מלמטה דרך העדשה (איור 1A). מצלמה קבועה בתוך הסורק מצלמת את תמונת הלייזר העובר דרך העדשה בנקודות רבות. תוכנת הסורק מחשבת את המרחק מאחורי העדשה שבו היא מצטלבת עם ציר מרכזי (מרחק קודקוד אחורי, BVD), ומייצרת סדרה של מדידות המצביעות על מידת העקביות שבה העדשה ממקדת אור לנקודה אחת (איור 1).

המאפיינים התאיים של העדשה, כגון הסידור ההדוק והמסודר של התאים שלה, עוזרים לשמור על שקיפות ולמזער את הפיזור כך שהעדשה תוכל למקד את האור באופן פונקציונלי⁹. ניתן להשתמש במדד זה כדי לפרש עד כמה כימיקל משבש באופן משמעותי את המבנה החיוני של העדשה, כגון מקדם השבירה של השיפוע, וכמה תפקוד נפגע בגלל האטימות המושרת. מחקרים אחרים שעקבו אחר התגובה של עדשות מתורבתות ושלפוחיות עדשות מצביעים על כך שפיזור האור הוא תוצר של שינויים מבניים, בהשוואה לשינויים מטבוליים, וכי שיבושים בשומנים ובחלבונים של העדשות עלולים להשפיע על מקדם השבירה וכתוצאה מכך להגביר את הפיזור^10,11.

ניתן להשתמש בסורק הלייזר של העדשה בשילוב עם ריאגנטים מטבוליים בבדיקות כדי לקבוע מדדים ביוכימיים של רעילות התאים. רזזורין הוא ריאגנט כימי לא רעיל העובר חילוף חומרים על ידי תאים פעילים, ומייצר תוצר מופחת (רסורופין) עם פלואורסצנטיות מדידה¹². העדשה נטולת אברונים ברובה, למעט המיטוכונדריה הפעילה מטבולית המרוכזת בתוך האפיתל הקדמי ותאי סיבים קליפת המוח השטחיים, הממלאים את דרישות האנרגיה של העדשה^13,14. נזק לעדשה ברמה התאית עלול לשבש את חילוף החומרים ולעתים קרובות מקדים את הופעתם של שינויים מבניים פתוגניים וקטרקט¹⁵.

מטרת שיטה זו היא להעריך את ההשפעה של חשיפות קסנוביוטיות וסביבתיות על העדשה, מה שעשוי לתרום להתפתחות קטרקט. הפרוטוקול כולל שתי בדיקות להערכת השפעת הטיפול באמצעות עדשת בקר מתורבתת. היתרון בגישה זו הוא שהיא מספקת הערכה תאית ותפקודית של האופן שבו העדשה כרקמה ראשונית מגיבה לטיפול. זוהי הערכה רגישה ואובייקטיבית של העדשה בהשוואה לשיטות נפוצות אחרות 16,17,18.

המודל שימש בהצלחה להערכת ההשפעות של חשיפות שונות, כולל פעילי שטח, מוצרי צריכה, אלכוהול וקרינה אולטרה סגולה 17,19,20. שינויים באיכות האופטית קיימים באופן עקבי בעדשות מתורבתות כתגובה לחשיפה רעילה²¹. היכולת של שיטה זו לשמור על תרבית עדשות לטווח ארוך מתאימה היטב לניטור ההשפעה הפוטנציאלית המושהית של תרכובת, והתאוששות העדשה מנזק שנגרם או קטרקט^22,23. ניתן להשתמש בתוצאות המופקות מיישום פרוטוקול זה כדי להפחית את התלות בניסויים בבעלי חיים בפיתוח מוצרי עיניים.

Protocol

כל פרוטוקולי הניסוי בוצעו בהתאם למדיניות האתיקה של אוניברסיטת ווטרלו למחקר באמצעות רקמות בעלי חיים. עיני הבקר במחקר הנוכחי סופקו על ידי בית מטבחיים, התקבלו מפרות שאינן חולבות תוך מספר שעות מרגע המוות, ונותחו מיד, תהליך שלוקח עד 8 שעות מרגע קבלת העיניים. יש לנתח את העיניים מיד כדי לשמור על סטריליות ואיכות החיתוך. מדיום התרבית מוכן ל-pH של 7.4 ומסונן סטרילי לפני נטילת תוסף FBS²¹. כל ההליכים מתבצעים בתנאים סטריליים, כאשר מקורות החומר והציוד מפורטים בטבלת החומרים.

1. תרבות עדשות בקר

1. נתח עדשות על ידי הסרת שרירים ורקמות חוץ עיניות מהסקלרה, הסרת החצי האחורי של הגלובוס והזגוגית, הסרת הקשתית והגוף הריסי יחד עם העדשה, ולאחר מכן חיתוך החיבורים האזוריים, כאשר החיתוך הסופי ממוקם כך שהעדשה תיפול לתוך תא התרבית המלא במדיום.
2. תרבית את העדשות המנותחות בתאים מותאמים אישית עם בסיס המותאם למערכת סריקת הלייזר, עם 21 מ"ל של מדיום מסונן סטרילי, ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂. יש להשתמש בתרבית בתוספת 3% סרום בקר עוברי (FBS) עם 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 9.4 גרם/ליטר M-199, 0.1 גרם/ליטר L-גלוטמין, 5.96 גרם/ליטר HEPES, 2.2 גרם/ליטר נתרן ביקרבונט ו-7 מ"ל/ליטר NaOH. אחסן מדיום תרבות שאינו בשימוש במקרר עד 7 ימים.
3. החלף את מדיום התרבות כל 1-2 יום. יש לחמם את מדיום התרבית למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. השתמש בפיפטה סטרילית של פסטר המחוברת ליניקה כדי לשאוב את המדיום מתא תרבית בודד ולחדש מיד במדיום הנוסף.
4. תרבית את העדשות במשך 48 שעות לאחר הדיסקציה כדי לאפשר זמן לנזק פיזי להתבטא. בדוק וסרוק את העדשות לאיכות אופטית לפי סעיף 4 לפני הכללתן בניסוי.
   הערה: העדשות מכוונות עם הפנים כלפי מטה כהכנה לבדיקת סורק הלייזר.

2. נוהל בקרה

1. הכן תמיסה עם הריכוז הרצוי של חומר מסיס התואם לתרכובת הכימית ולמדיום התרבית.
2. הכן פתרון בקרת רכב על ידי הוספת החומר המסיס למדיום משלים. מחממים את תמיסת הבקרה למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס לפני הניסוי.
3. השתמש בפיפטה פסטר המחוברת ליניקה כדי לשאוב את מדיום התרבית מתאי עדשות הבקרה. מלאו את התאים בתמיסת הבקרה. במידת הצורך, בצע שלב זה עם דגימות בשלוש עותקים.
   הערה: נדרש נפח מינימלי של 7 מ"ל כדי לכסות לחלוטין את העדשה במצב הקדמי עם הפנים כלפי מעלה. התנאים לבקרות במחקר הנוכחי היו 21 מ"ל של מדיום בקרה לא מטופל, 21 מ"ל של מדיום בקרה לרכב ו-7 מ"ל של מי מלח עם פוספט (PBS).
4. תרבית את העדשות במדיום בקרה למשך יומיים, ולאחר מכן החלף באמצעי בקרה חדש לפי סעיף 1. לחשיפות לטווח קצר, יש לשאוב את תמיסת הבקרה מהתאים ולבצע שטיפה לפחות שלוש פעמים עם תרבית ללא תוספת לפני חידוש פרוטוקול תרבית העדשות כמתואר בסעיף 1.0.
5. אפשר לעדשות להתאקלם בחממה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך 3.5 שעות לפחות לפני הערכת האיכות האופטית.

3. הליך חשיפה

1. הכן תמיסה עם הריכוז הרצוי של חומר מסיס התואם לתרכובת הכימית ולמדיום התרבית. שלב את הכימיקל עם החומר המסיס, מה שמאפשר את הזמן המתאים לאינטראקציה במידת הצורך.
   הערה: 2-הידרוקסיפרופיל-β-ציקלודקסטרין שימש במחקר הנוכחי כדי לשפר את המסיסות של לנוסטרול (0.033 גרם/ליטר) במדיום. תמיסת בנזלקוניום כלוריד (BAK 0.0075%) הוכנה באמצעות PBS.
2. שלבו את הכימיקל המסיס במדיום התרבית. הכן נפח כולל המספיק כדי לספק 21 מ"ל של מדיום לכל דגימות העדשות. מחממים את מדיום הניסוי למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס לפני הניסוי.
3. השתמש בפיפטה של פסטר המחוברת ליניקה כדי לשאוב את מדיום התרבית מתאי העדשות. מלאו מיד את התאים בתמיסת הבדיקה. לאחר מרווח החשיפה, החלף במדיום תרבית משלים, ובצע תחילה שטיפה במידת הצורך. במידת הצורך, בצע שלב זה עם דגימות בשלוש עותקים.
   הערה: במחקר הנוכחי, תנאי הבדיקה היו 21 מ"ל של מדיום בתוספת לנוסטרול ו-7 מ"ל של תמיסת BAK 0.0075%. נדרש נפח מינימלי של 7 מ"ל לכיסוי מלא של העדשה. במקרה זה, העדשות חייבות להיות מכוונות תחילה עם הפנים כלפי מעלה. ניתן להשתמש בפיפטה של פסטר כדי ליצור זרם בתא התרבות עם חלק ממדיום התרבות שמסביב כדי למקם מחדש את העדשה.
4. החזר את העדשות לחממה למשך 3.5 שעות לפחות כדי להתאקלם לפני הערכת האיכות האופטית.
   הערה: העדשות מכוונות עם הפנים כלפי מטה כהכנה לבדיקת סורק הלייזר.

4. בדיקת איכות אופטית (סורק לייזר עדשה)

1. ודא שהעדשות מכוונות עם הפנים הקדמיות כלפי מטה וברמה החזותית בתא התרבית, תוך שימוש בטכניקה משלב 3.3 כדי להתאים את מיקום העדשה במידת הצורך.
   הערה: מיקום זה מבטיח שקרן האירוע תשתקף למעלה דרך תחתית החדר ותעבור דרך העדשה מהמשטח הקדמי לאחורי.
2. מקם תא תרבית עדשה לתוך סורק הלייזר כך שסיכת עגלת התא תתאים לחריץ בבסיס החדר.
3. בחר את העדשה ונקודת הסריקה שעבורם יש לבצע סריקה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על עדשת הסריקה והמתן עד שהסורק יבקש למצוא וליישר את האלומה. בחר התחלה ונקודות קצה מרוחקות היטב עבור הקרן שמאחורי העדשה. ודא שהקרן המרכזית מיושרת באמצעות לחצני הכוונון הגסים והעדינים בתוכנת הסורק וכפתור הכוונון בסורק. כאשר הקרן מיושרת, לחץ על כיול והזן מבחר מתאים של צעדים רדיאליים והפרדת אלומה.
   הערה: עבור מחקר זה באמצעות עדשת בקר, ההגדרות לצעדים רדיאליים והפרדת אלומה נקבעו ל-10 צעדים ו-0.5 מ"מ, בהתאמה. הסריקה הראשונה שהסורק מבצע משמשת לכיול סורק הלייזר. זה נדרש פעם אחת, וכל סריקות העדשות הנוספות עשויות להתבצע ישירות לאחר היישור.
4. לאחר כיול הסורק, לחץ על סריקה. המתן ליצירת ערכים עבור ממוצע BVD, סטיית תקן ושגיאה לאורך ציר אחד לאחר השלמת סריקת העדשה, והיקף הקרן נקבע. הגדר את ההיקף מהמקום שבו הקרניים יוצאות מהעדשה לנקודת הקצה הרצויה, ובחר את המרחק המרבי מאחורי העדשה תוך אי הכללת כל הפרעה נראית לעין.
5. השתמש בתרשים שנוצר כדי להציג את מרחקי הקודקוד האחורי הבודדים עבור כל קרן.
   הערה: אל תכלול קרניים העוברות דרך תפרי העדשה. כדי לא לכלול אלומה, השתמש במקרא שעל המסך כדי ללחוץ לחיצה ימנית על קרן בודדת ולבחור אל תכלול.
6. סובב ידנית את מיקום בסיס תא התרבות בתוך הסורק ב-90°, כך שהסריקה השנייה לאורך משטח העדשה הקדמית תהיה בניצב לסריקה הקודמת. ודא שהקרן המרכזית מיושרת כמפורט בשלב 4.3, ולאחר מכן סרוק את העדשה.

5. בדיקת פעילות מטבולית (רזזורין)

1. הכן בינוני ללא FBS. מחממים את המדיום למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס. הכן 50 מ"ל של מגיב רזזורין 8% במדיום ללא תוספת.
   הערה: מספיק להכין 50 מ"ל כדי למלא את כל הבארות בצלחת של 12 בארות. יש להכין את התמיסה סטרילית בתנאים עמומים במיכל אטום, מכיוון שרזזורין רגיש לאור.
2. הוסף 3.8 מ"ל של תמיסת רזזורין 8% לכל באר בתוך צלחת שקופה וסטרילית של 12 בארות כדי לכסות את העדשה.
3. השתמש בכפות מתכת סטריליות כדי להרים בזהירות עדשות מתחת למשטח האחורי ובצע שטיפה באמצעות פיפטה של פסטר כדי לשטוף את העדשה עם נפח קטן של מדיום תרבית ללא תוספת. הנח את העדשות בנפרד בכל באר.
4. דגרו את צלחת הבאר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך 5 שעות. לאחר הדגירה, הסר את העדשות בעזרת כפות מתכת מהבארות והניח אותן במיכל לסילוק פסולת בעלי חיים. העבירו דגימה של 100 מיקרוליטר מכל באר לצלחת סטרילית, שקופה, עם 96 בארות.
   הערה: ניתן להעריך עדשות מספר פעמים באמצעות בדיקת הפעילות המטבולית. במקרה זה, החזירו את העדשות לתאי התרבות עם מדיום טרי לדגירה. בדיקת הפעילות המטבולית מבוצעת בצורה הטובה ביותר לאחר השלמת כל הסריקות, מכיוון שהצבע עשוי להשפיע על מדידות ה-BVD.
5. מדוד את הקרינה של נקודת הקצה של דגימות 100 מיקרוליטר באמצעות קורא לוחות פלורסנט, כאשר אורכי גל העירור והפליטה מוגדרים ל-560 ננומטר ו-590 ננומטר, בהתאמה.

6. ניתוח נתונים

1. עבור בדיקת האיכות האופטית, חשב את ממוצע הערכים המחושבים על ידי התוכנה עבור שגיאת BVD²⁴ משתי הסריקות שבוצעו בכל נקודת זמן. בצע חישוב זה עבור כל העדשות וכל נקודות הסריקה.
2. לבדיקת הפעילות המטבולית, אסוף את ערכי הקרינה היחסית של נקודת הקצה שנוצרו על ידי קורא הצלחות. נרמל את הנתונים על-ידי הגדרת הממוצע של כל ערכי הבקרה בנקודת סריקה ל- 100%. חשב את הפעילות של כל עדשה כאחוז מערך הבקרה הממוצע עבור אותה נקודת סריקה.
3. בצע בדיקת נורמליות עבור כל קבוצות הניסוי. בהנחה שהנתונים תקינים, נתח את הבדלי השגיאות של BVD בין עדשות בקרה לניסוי באמצעות ANOVA הדו-כיווני. בנוסף, בצע את מבחן ההשוואות המרובות הפוסט-הוק של Tukey. בצע ANOVA חד כיווני ובדיקת פוסט-הוק של Dunnett לנתוני הפעילות המטבולית.

תוצאות

איור 2 ואיור 3 (n = 6) מדגימים את תוצאות המחקר שבדק את השפעת הטיפול הכימי (לנוסטרול) על עדשת הבקר. לנוסטרול הוא סטרול טבעי בעדשה שבעבר הראה תוצאות מבטיחות כהתערבות תרופתית פוטנציאלית לקטרקט²⁵, אם כי זה עדיין לא הוכח²⁶. ?...

Discussion

מטרת פרוטוקול זה היא להעריך ישירות את ההשפעות של כימיקלים או חשיפות סביבתיות על העדשה בתרבית רקמה ראשונית. ראשית, העדשות מנותחות ונסרקות לאיכות אופטית. מניעת זיהום והבטחת איכות הנתיחה הם קריטיים. העדשות נסרקות במרווחי זמן תקופתיים כדי לנטר באופן רציף שינויים בתפקוד השב...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(2-Hydroxypropyl)-β-cyclodextrin	Sigma-Aldrich	H107	Powder
1 L bottle-top filtration system	VWR	97066-204	Full Assembly, bottle-top, 0.2 μm
100 mm Petri dish	VWR	89022-320	Slippable, media saver style, sterile
12 well-plate	Corning	353043	Sterile, clear-bottom
35 mm petri dish	VWR	25373-041	Falcon disposable petri dishes, sterile, Corning
96 well-plate	VWR	29442-072	Sterile, clear-bottom
Alamar blue (resazurin)	Fischer Scientific	DAL1100	Molecular Probes cell viability reagent
Benzalkonium chloride solution	Sigma-Aldrich	63249	50% in H20
Biosafety cabinet
Cytation 5 plate reader	BioTek	CYT5MPV	Cell imaging multi-mode reader
Fetal bovine serum	ThermoFischer Scientific	12484028	Qualified, heat inactivated, Canada
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	For cell culture, powder
Incubator
Lanosterol	Sigma-Aldrich	L5768	≥93%, powder
L-glutamine	Sigma-Aldrich		For cell culture, powder
Medium (M-199)	Sigma-Aldrich	M3769	Modified, with Earle′s salts, without L-glutamine, sodium bicarbonate, and phenol red, powder, suitable for cell culture
Pasteur pipettes			5 3/4'', with and without cotton
Penicillin-Streptomycin	ThermoFischer Scientific	15140122	Liquid (10,000 U/mL)
Phospate buffer saline (PBS)			liquid, sterile, suitable for cell culture
Pipette tips (100 µL, 1,000 µL, 5,000 µL)	VWR		Sterile
ScanTox (lens laser-scanner)	Specially developed in-house	N/A	Scans lens with a laser to determine lens optical quality
ScanTox culture chamber	Specially developed in-house	N/A	Holds bovine lens in place during testing and culturing
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	For cell culture, powder
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S2770	1.0 N, BioReagent, suitable for cell culture