眼内治療用賦形剤および医薬品の毒性評価のための臓器培養システム

要約

このプロトコルの目標は、実験的治療に応答した水晶体の代謝活性と屈折機能の変化を評価することです。

要約

失明の主な原因として、白内障は、この状態によって影響を受ける世界中の何千万人もの人々にとって大きな負担です。化学物質への曝露は、他の環境要因の中でも、白内障の確立された原因です。眼毒性試験では、医薬品とその成分が白内障につながる可能性のある水晶体の損傷に寄与する可能性があるかどうか、または白内障の治療を助ける可能性があるかどうかを評価できます。

in vitro 試験および in vivo 動物試験は、臨床試験に先立って化学物質の安全性を評価するために使用できます。ドレイズ試験(眼毒性および刺激性試験の現在の in vivo 標準)は、眼毒性を決定するための感度と客観的な測定が不足していると批判されてきました。細胞培養では無傷の機能レンズを適切にモデル化できないため、 in vitro 細胞ベースのアッセイは限られています。

ここで説明する方法は、動物実験に代わる高感度の in vitro 試験法であり、細胞活性レベルと全体的な屈折性能の両方で、無傷のウシ水晶体の治療に対する反応を評価するように設計されています。非毒性試薬のレサズリンは、細胞活性のレベルに比例して代謝されます。レンズレーザースキャナーアッセイは、入射光線を最小限の誤差で一点に屈折させるレンズの能力を測定し、その自然な機能に直接関連します。この方法は、水晶体の急性変化と遅延変化の両方、および化学的または環境的曝露からの水晶体の回復を決定するために使用できます。

概要

2,000万人以上が罹患している白内障は、世界中で失明の最も一般的な原因です^1,2。白内障は、最も一般的には水晶体の加齢に伴う変化によるものですが、外傷、遺伝的状態、病気、または毒物への曝露からも誘発されます²。現在、治療には水晶体を交換するための外科的介入が含まれ、主に先進国の人々が利用できる高価で侵襲的な手順です。白内障の広範な負担は、白内障の予防と非外科的治療法の開発に向けた数十年にわたる研究を導いてきました。いずれの場合も、眼科用医薬品の毒性、有効性、薬物動態に関する前臨床試験の重要性が最も重要です。この医薬品開発のプロセスは、動物で行われた研究によって提供される情報に大きく依存しています。

in vivoでの眼毒性試験の現在の標準は、生きた動物の結膜嚢に試験化合物を送達するドレイズ試験です。このテストは、特に動物倫理、主観性、再現性の低さ、および変動性に関して、大幅に批判されてきました³。さらに、ドレイズテストには、レンズに対する試験物質の影響を直接監視するコンポーネントはありません。代替のin vitroモデルの開発にはかなりの努力が払われてきました⁴。ただし、ドレイズテスト⁵を置き換えるのに十分な検証は行われていません。同様に、これらのモデルの多くは、白内障やその他の複雑な病状への直接的な適用に関して制限に直面しています⁶。たとえば、グリッド上に配置した場合のレンズの透明度を評価する方法は、本質的に主観的です⁷。細胞培養研究は信頼性が高く、高度に利用されていますが、細胞単層の特性は初代組織培養とは異なる場合があります⁸。

レンズ全体を動物の目から解剖し、培養して元の構造と機能を維持することができます。臓器の状態を維持しながら水晶体の機能を評価するのに有用なアッセイの1つが、カナダのウォータールー大学で開発されたスキャナーを用いたレンズレーザースキャナーアッセイです。このアッセイは、一連のレーザープロジェクションを使用してレンズの光学的品質または屈折性能を測定するスキャンシステムです。レンズは、カスタムの2セグメント培養チャンバーでスキャンされ、ビームがレンズを下から通過できるようにします(図1A)。スキャナー内部に固定されたカメラは、レーザーがレンズを多数のポイントで通過する画像をキャプチャします。スキャナーソフトウェアは、レンズが中心軸と交差するレンズの後ろの距離(後方頂点距離、BVD)を計算し、レンズが光を1点にどれだけ一貫して集束させるかを示す一連の測定値を生成します(図1)。

レンズの細胞特性、例えば、その細胞のタイトで整然とした配置は、レンズが機能^的に光を集束させることができるように、透明性を維持し、散乱を最小化するのを助ける。この尺度は、化学物質が屈折率勾配などのレンズの本質的な構造をどの程度乱すか、および誘発された混濁のためにどれだけ機能が損なわれるかを解釈するために使用できます。培養水晶体と水晶体小胞の応答を追跡した他の研究では、光散乱は代謝変化と比較して構造変化の産物であり、水晶体の脂質とタンパク質の混乱が屈折率に影響を及ぼし、その結果として散乱を増加させる可能性があることが示唆されています^10,11。

レンズレーザースキャナーは、細胞毒性の生化学的測定値を決定するために、アッセイで代謝試薬と組み合わせて使用できます。レサズリンは、活性細胞によって代謝される無毒の化学試薬であり、測定可能な蛍光¹²で還元された生成物(レゾルフィン)を生成します。水晶体には、前皮細胞と表在性皮質線維細胞に集中する代謝活性ミトコンドリアを除いて、水晶体にはほとんど細胞小器官がなく、水晶体のエネルギー要件を満たしています^13,14。細胞レベルでの水晶体の損傷は、代謝を混乱させる可能性があり、多くの場合、病原性構造変化と白内障の発症に先行します¹⁵。

この方法の目的は、白内障の発症に寄与する可能性のある水晶体に対する生体異物および環境曝露の影響を評価することです。このプロトコルには、培養ウシレンズを使用した治療の効果を評価するための2つのアッセイが含まれます。このアプローチの利点は、一次組織としての水晶体が治療にどのように反応するかについて、細胞的および機能的評価を提供できることです。これは、他の一般的な方法16,17,18と比較したレンズの感度と客観的な評価です。

このモデルは、界面活性剤、消費者製品、アルコール、紫外線17,19,20など、さまざまな曝露の影響を評価するために成功裏に使用されています。光学品質の変化は、有毒な曝露に対する反応として、培養レンズに一貫して存在します²¹。この方法がレンズの培養を長期間維持する能力は、化合物の潜在的に遅延する効果、および誘発された損傷または白内障^22,23からのレンズの回復を監視するのに適している。このプロトコルの適用から得られる結果は、眼科用製品の開発における動物実験への依存を減らすために使用できます。

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プロトコル

すべての実験プロトコルは、動物組織を使用した研究に関するウォータールー大学の倫理方針に準拠して実施されました。現在の研究のウシの目は、屠殺場で提供され、死亡後数時間以内に非乳牛から採取され、すぐに解剖されましたが、これは眼球を取得してから最大8時間かかるプロセスです。無菌性と解剖品質を維持するために、目はすぐに解剖する必要があります。培地をpH 7.4に調製し、FBS²¹を添加する前に滅菌ろ過します。すべての手順は無菌条件下で行われ、材料と機器の供給源は 材料の表に記載されています。

1. ウシのレンズ培養

1. 強膜から眼球外筋と組織を切除し、球体と硝子体の後半分を切除し、虹彩と毛様体をレンズと一緒に除去し、次に帯状の付着物を切り取り、最終的なカットをレンズが培地で満たされた培養室に落ちるように配置して、レンズを解剖します。
2. レーザースキャンシステムに適合するように適合したベースを備えたカスタムチャンバーで、21 mLの滅菌ろ過媒体を使用して、37°Cおよび5%CO₂で解剖したレンズを培養します。1%ペニシリン-ストレプトマイシン、9.4 g / L M-199、0.1 g / L L-グルタミン、5.96 g / L HEPES、2.2 g / L重炭酸ナトリウム、および7 mL / L NaOHを含む3%ウシ胎児血清(FBS)添加培地を使用します。.未使用の培地は冷蔵庫で最大7日間保管してください。
3. 培地は1〜2日ごとに交換してください。使用前に培地を37°Cで1時間温めてください。吸引接続式滅菌パスツールピペットを使用して、個々の培養チャンバーから培地を吸引し、補充した培地をすぐに補充します。
4. 解剖後48時間レンズを培養して、物理的損傷が現れるまで待ちます。実験に含める前に、セクション4に従ってレンズの光学品質を検査し、スキャンします。
   注:レンズは、レーザースキャナーアッセイの準備のために下向きになっています。

2. 管理手順

1. 化合物および培地に適合した可溶化剤を所望の濃度で調製します。
2. 添加した培地に可溶化剤を添加して、車両制御溶液を調製します。実験前に、コントロール溶液を37°Cで1時間温めます。
3. 吸引に接続されたパスツールピペットを使用して、コントロールレンズチャンバーから培地を吸引します。チャンバーに制御溶液を補充します。必要に応じて、サンプルを 3 回に分けてこの手順を実行します。
   注:レンズを正面から上にした位置でレンズを完全に覆うには、最小7mLの容量が必要です。現在の研究における対照の条件は、21 mLの未処理の培地コントロール、21 mLのビヒクルコントロール培地、および7 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でした。
4. レンズをコントロールメディウムで2日間培養し、セクション1に従って新しいコントロールメディウムと交換します。短期間の曝露の場合は、チャンバーから制御溶液を吸引し、セクション1.0で説明されているようにレンズ培養プロトコルを再開する前に、未補充の培地で少なくとも3回すすぎを行います。
5. レンズをインキュベーター内で37°Cおよび5%CO₂ に少なくとも3.5時間順応させてから、光学品質を評価してください。

3. 曝露手順

1. 化合物および培地に適合した可溶化剤を所望の濃度で調製します。化学物質を可溶化剤と組み合わせ、必要に応じて相互作用のための適切な時間を確保します。
   注:2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンは、現在の研究では、ラノステロール(0.033 g / L)の媒体への溶解性を高めるために使用されました。塩化ベンザルコニウム(BAK 0.0075%)溶液は、PBSを使用して調製しました。
2. 可溶化した化学物質を培地に組み込みます。すべてのレンズサンプルに21 mLの培地を提供するのに十分な総容量を準備します。実験前に、実験用培地を37°Cで1時間温めます。
3. 吸引に接続されたパスツールピペットを使用して、レンズチャンバーから培地を吸引します。すぐにチャンバーに試験液を補充します。曝露間隔の後、補充した培地と交換し、必要に応じて最初にすすぎを行います。必要に応じて、サンプルを 3 回に分けてこの手順を実行します。
   注:現在の研究では、試験条件は21 mLのラノステロール添加培地と7 mLのBAK 0.0075%溶液でした。レンズを完全に覆うには、最低7mLの容量が必要です。この場合、レンズは最初に正面を上に向ける必要があります。パスツールピペットを使用して、周囲の培地の一部と培養チャンバー内に電流を作り、レンズの位置を変えることができます。
4. レンズをインキュベーターに少なくとも3.5時間戻し、光学品質を評価する前に順応させます。
   注:レンズは、レーザースキャナーアッセイの準備のために下向きになっています。

4. 光学品質アッセイ(レンズレーザースキャナー)

1. レンズが前部を下にして培養室内で視覚的に水平になるようにし、必要に応じてステップ3.3の手法を使用してレンズの位置を調整します。
   注:この位置により、入射ビームがチャンバー底部を通って反射され、レンズを前面から後面に通過します。
2. レンズ培養チャンバーをレーザースキャナーに配置し、チャンバーキャリッジピンがチャンバーベースのスロットに収まるようにします。
3. スキャンを実行する レンズ と スキャンポイント を選択し、 スキャンレンズを右クリックして、ビームを見つけて位置合わせするためのスキャナープロンプトを待ちます。レンズの後ろのビームの始点と終点が適切になるように選択します。スキャナーソフトウェアの グロス 調整ボタンと 微調整 ボタン、およびスキャナーの調整ノブを使用して、中央のビームが位置合わせされていることを確認します。ビームが位置合わせされたら、[ キャリブレーション ]をクリックし、 半径方向のステップ と ビーム分離の適切な選択を入力します。
   注:ウシレンズを使用したこの研究では、 ラジアルステップ と ビーム分離 の設定をそれぞれ 10ステップ と 0.5mmに設定しました。スキャナーが実行する最初のスキャンは、レーザースキャナーのキャリブレーションに役立ちます。これは一度必要であり、すべての追加のレンズスキャンはアライメントの直後に実行できます。
4. スキャナーのキャリブレーションが完了したら、[ スキャン]をクリックします。レンズスキャンの完了後、1つの軸に沿ったBVD平均、標準偏差、および誤差の値が生成されるのを待ち、ビームのスコープが設定されました。ビームがレンズから出る位置から目的の終点までスコープを設定し、明らかな干渉を排除しながらレンズの後ろの最大距離を選択します。
5. 生成されたチャートを使用して、各ビームの個々の後方頂点の距離を表示します。
   注:レンズ縫合糸を通過するビームは除外します。ビームを除外するには、画面上の凡例を使用して個々のビームを右クリックし、[ 除外] を選択します。
6. スキャナー内の培養チャンバーベースの位置を手動で90°回転させ、水晶体前面に沿った2回目のスキャンが前のスキャンに対して垂直になるようにします。中央のビームが手順4.3で詳しく説明されているように位置合わせされていることを確認してから、レンズをスキャンします。

5. メタボリックアクティビティアッセイ(レサズリン)

1. FBSを含まない媒体を準備します。中温を37°Cで1時間温めます。 50 mLの8%レサズリン試薬を未添加の培地で調製します。.
   注:12ウェルプレートにすべてのウェルを充填するには、50 mLを調製するだけで十分です。溶液は、レサズリンが光感受性であるため、不透明な容器で薄暗い条件下で滅菌して調製する必要があります。.
2. 透明底の滅菌済み12ウェルプレート内の各ウェルに3.8 mLの8%レサズリン溶液を加えて、レンズを覆います。
3. 滅菌金属スコップを使用して、レンズを後面の下から慎重に持ち上げ、パスツールピペットを使用してすすぎを行い、少量の未添加培地でレンズを洗浄します。レンズを各ウェルに個別に配置します。
4. ウェルプレートを37°Cおよび5%CO₂ で5時間インキュベートします。インキュベーション後、金属製のスコップが付いたレンズをウェルから取り外し、動物の排泄物処理容器に入れます。各ウェルから100 μLのサンプルを無菌の透明底の96ウェルプレートに移します。
   注:レンズは、代謝活性アッセイで複数回評価できます。この場合、レンズを新鮮な培地で培養室に戻してインキュベーションします。代謝活性アッセイは、色素がBVD測定に影響を与える可能性があるため、すべてのスキャンが完了した後に実行するのが最適です。
5. 蛍光プレートリーダーを使用して、励起波長と発光波長をそれぞれ560 nmと590 nmに設定して、100 μLサンプルの終点蛍光を測定します。

6. データ分析

1. 光学品質アッセイでは、各時点で実行された 2 つのスキャンから、ソフトウェアで計算された BVD エラー²⁴ の値の平均を計算します。この計算は、すべてのレンズとすべてのスキャンポイントに対して実行します。
2. 代謝活性アッセイでは、プレートリーダーによって生成されたエンドポイントの相対蛍光値を収集します。スキャンポイントでのすべての制御値の平均を100%に設定して、データを正規化します。各レンズのアクティビティを、そのスキャンポイントの平均制御値に対するパーセンテージとして計算します。
3. すべての実験グループに対して正規性検定を実行します。データが正常であると仮定して、二元配置分散分析を使用して、対照レンズと実験レンズの BVD 誤差差を解析します。さらに、Tukey の事後多重比較検定を実行します。代謝活動データに対して、一元配置分散分析とダネットの事後検定を実行します。

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結果

図2 および 図3 (n = 6)は、ウシの水晶体に対する化学処理(ラノステロール)の効果をテストした研究の結果を示しています。ラノステロールは、水晶体に自然に発生するステロールであり、かつては白内障の潜在的な医薬品介入として有望な結果を示しました²⁵、これはまだ証明されていません

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ディスカッション

このプロトコルの目的は、初代組織培養におけるレンズに対する化学物質または環境曝露の影響を直接評価することです。まず、レンズを解剖し、光学品質のためにスキャンします。コンタミネーションの防止と解剖品質の確保は非常に重要です。レンズは定期的にスキャンされ、対照群または露光前条件に対する屈折機能の変化を継続的に監視します。代謝活性ア...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
(2-Hydroxypropyl)-β-cyclodextrin	Sigma-Aldrich	H107	Powder
1 L bottle-top filtration system	VWR	97066-204	Full Assembly, bottle-top, 0.2 μm
100 mm Petri dish	VWR	89022-320	Slippable, media saver style, sterile
12 well-plate	Corning	353043	Sterile, clear-bottom
35 mm petri dish	VWR	25373-041	Falcon disposable petri dishes, sterile, Corning
96 well-plate	VWR	29442-072	Sterile, clear-bottom
Alamar blue (resazurin)	Fischer Scientific	DAL1100	Molecular Probes cell viability reagent
Benzalkonium chloride solution	Sigma-Aldrich	63249	50% in H20
Biosafety cabinet
Cytation 5 plate reader	BioTek	CYT5MPV	Cell imaging multi-mode reader
Fetal bovine serum	ThermoFischer Scientific	12484028	Qualified, heat inactivated, Canada
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	For cell culture, powder
Incubator
Lanosterol	Sigma-Aldrich	L5768	≥93%, powder
L-glutamine	Sigma-Aldrich		For cell culture, powder
Medium (M-199)	Sigma-Aldrich	M3769	Modified, with Earle′s salts, without L-glutamine, sodium bicarbonate, and phenol red, powder, suitable for cell culture
Pasteur pipettes			5 3/4'', with and without cotton
Penicillin-Streptomycin	ThermoFischer Scientific	15140122	Liquid (10,000 U/mL)
Phospate buffer saline (PBS)			liquid, sterile, suitable for cell culture
Pipette tips (100 µL, 1,000 µL, 5,000 µL)	VWR		Sterile
ScanTox (lens laser-scanner)	Specially developed in-house	N/A	Scans lens with a laser to determine lens optical quality
ScanTox culture chamber	Specially developed in-house	N/A	Holds bovine lens in place during testing and culturing
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	For cell culture, powder
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S2770	1.0 N, BioReagent, suitable for cell culture