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Method Article
이 프로토콜의 목표는 실험적 치료에 대한 반응으로 수정체의 대사 활동과 굴절 기능의 변화를 평가하는 것입니다.
실명의 주요 원인인 백내장은 전 세계적으로 이 질환으로 고통받는 수천만 명의 사람들에게 큰 부담이 되고 있습니다. 다른 환경적 요인 중에서도 화학 물질 노출은 백내장의 확립된 원인입니다. 안구 독성 검사는 의약품 및 그 성분이 백내장을 유발하거나 백내장 치료를 도울 수 있는 렌즈 손상에 기여할 수 있는지 여부를 평가할 수 있습니다.
시험관 내 연구 및 생체 내 동물 실험은 임상 연구 전에 화학 물질의 안전성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 안구 독성 및 자극성 테스트에 대한 현재 생체 내 표준인 Draize 테스트는 안구 독성을 결정하기 위한 민감도와 객관적인 측정이 부족하다는 비판을 받았습니다. in vitro 세포 기반 분석은 세포 배양이 온전한 기능성 수정체를 적절하게 모델링할 수 없기 때문에 제한적입니다.
여기에 설명된 방법은 동물 실험에 대한 민감한 체외 대안으로, 세포 활성 수준과 전반적인 굴절 성능 모두에서 치료에 대한 온전한 소 수정체의 반응을 평가하도록 설계되었습니다. 무독성 시약인 레사주린은 세포 활성 수준에 비례하여 대사됩니다. 렌즈 레이저 스캐너 분석은 렌즈가 입사광을 최소한의 오류로 단일 지점으로 굴절시키는 능력을 측정하며, 이는 렌즈의 자연적인 기능과 직접적인 관련이 있습니다. 이 방법은 렌즈의 급성 및 지연성 변화뿐만 아니라 화학적 또는 환경적 노출로부터 렌즈의 회복을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.
2,000만 명 이상의 사람들에게 영향을 미치는 백내장은 전 세계적으로 가장 흔한 실명 원인입니다 1,2. 백내장은 노화와 관련된 수정체의 변화로 인해 가장 흔하게 발생하지만 외상, 유전적 상태, 질병 또는 독성 노출로 인해 유발되기도 합니다2. 현재 치료에는 수정체를 교체하기 위한 외과적 개입이 포함되며, 이는 주로 선진국 사람들이 이용할 수 있는 비용이 많이 들고 침습적인 절차입니다. 백내장으로 인한 광범위한 부담으로 인해 수십 년에 걸친 연구는 백내장 예방과 비수술적 치료법 개발을 위한 방향으로 이어졌습니다. 두 경우 모두 안과 약물의 독성, 효능 및 약동학에 대한 전임상 검사의 중요성이 가장 중요합니다. 이러한 약물 개발 과정은 동물을 대상으로 수행된 연구에서 제공하는 정보에 크게 의존합니다.
생체 내 안구 독성 검사에 대한 현재 표준은 살아있는 동물의 결막낭에 시험 화합물을 전달하는 것과 관련된 Draize 검사입니다. 이 테스트는 특히 동물 윤리, 주관성, 낮은 반복성 및 가변성과 관련하여 상당한 비판을 받았습니다3. 또한 Draize 테스트에는 테스트 물질이 렌즈에 미치는 영향을 직접 모니터링하는 구성 요소가 없습니다. 대체 체외 모델 개발에 상당한 노력이 투자되었습니다4. 그러나 Draize 테스트5를 대체할 만큼 충분히 검증된 것은 없습니다. 마찬가지로, 이러한 모델 중 다수는 백내장 및 기타 복잡한 병리학에 대한 직접적인 적용과 관련하여 한계에 직면해 있습니다6. 예를 들어, 격자 위에 놓았을 때 렌즈의 투명도를 등급화하는 방법은 본질적으로 주관적이다7. 세포 배양 연구는 신뢰할 수 있고 활용도가 높지만, 세포 단층 특성은 일차 조직 배양과 다를 수 있습니다8.
전체 수정체는 동물의 눈에서 해부하고 배양하여 원래의 구조와 기능을 유지할 수 있습니다. 장기의 상태를 유지하면서 수정체 기능을 평가하는 데 유용한 한 가지 분석법은 캐나다 워털루 대학에서 개발한 스캐너와 관련된 렌즈 레이저 스캐너 분석법입니다. 이 분석은 일련의 레이저 프로젝션을 사용하여 렌즈의 광학 품질 또는 굴절 성능을 측정하는 스캐닝 시스템입니다. 렌즈는 맞춤형 2-segment 배양 챔버에서 스캔되어 빔이 아래에서 렌즈를 통과할 수 있습니다(그림 1A). 스캐너 내부에 고정된 카메라는 여러 지점에서 렌즈를 통과하는 레이저의 이미지를 캡처합니다. 스캐너 소프트웨어는 렌즈가 중심 축과 교차하는 거리(back vertex distance, BVD)를 계산하여 렌즈가 단일 지점에 빛을 얼마나 일관되게 집중시키는지를 나타내는 일련의 측정값을 생성합니다(그림 1).
세포의 촘촘하고 질서 정연한 배열과 같은 렌즈의 세포 특성은 투명도를 유지하고 산란을 최소화하여 렌즈가 기능적으로 빛의 초점을 맞출 수 있도록 도와줍니다9. 이 측정은 화학 물질이 구배 굴절률과 같은 렌즈의 필수 구조를 얼마나 크게 방해하는지, 그리고 유도된 혼탁으로 인해 얼마나 많은 기능이 손상되는지를 해석하는 데 사용할 수 있습니다. 배양된 수정체와 수정체 소포의 반응을 추적한 다른 연구에서는 빛의 산란이 대사 변화와 비교하여 구조적 변화의 산물이며, 수정체 지질과 단백질의 파괴가 굴절률에 영향을 미쳐 결과적으로 산란을 증가시킬 수 있음을 시사합니다10,11.
렌즈 레이저 스캐너는 세포 독성의 생화학적 측정을 결정하기 위해 분석에서 대사 시약과 함께 사용할 수 있습니다. 레사주린(Resazurin)은 활성 세포에 의해 대사되는 무독성 화학 시약으로, 측정 가능한 형광을 가진 환원된 생성물(레소루핀)을 생산합니다12. 수정체에는 전방 상피와 표재성 피질 섬유 세포에 집중되어 있는 대사 활성 미토콘드리아를 제외하고는 세포소기관이 거의 없어 수정체 에너지 요구 사항13,14를 충족합니다. 세포 수준에서 수정체가 손상되면 신진대사가 방해받을 수 있으며 종종 병원성 구조 변화 및 백내장이 시작되기 전에 발생합니다15.
이 방법의 목적은 백내장 발병에 기여할 수 있는 생체 이물 및 환경 노출이 렌즈에 미치는 영향을 평가하는 것입니다. 이 프로토콜에는 배양된 소 수정체를 사용하여 치료의 효과를 평가하기 위한 두 가지 분석이 포함됩니다. 이 접근법의 장점은 일차 조직인 수정체가 치료에 어떻게 반응하는지에 대한 세포 및 기능적 평가를 제공한다는 것입니다. 이는 다른 일반적인 방법과 비교하여 수정체에 대한 민감하고 객관적인 평가입니다 16,17,18.
이 모델은 계면 활성제, 소비재, 알코올 및 자외선을 포함한 다양한 노출의 영향을 평가하는 데 성공적으로 사용되었습니다 17,19,20. 광학 품질의 변화는 독성 노출에 대한 반응으로 배양 렌즈에서 일관되게 나타납니다21. 렌즈 배양을 장기간 유지할 수 있는 이 방법은 화합물의 잠재적인 지연 효과와 유도 손상 또는 백내장으로부터 수정체의 회복을 모니터링하는 데 매우 적합합니다22,23. 이 프로토콜의 적용으로 생성된 결과는 안과 제품 개발에서 동물 실험에 대한 의존도를 줄이는 데 사용할 수 있습니다.
모든 실험 프로토콜은 동물 조직을 사용한 연구에 대한 워털루 대학교 윤리 정책에 따라 수행되었습니다. 이번 연구를 위한 소의 눈은 도살장에서 제공되었고, 죽은 지 몇 시간 이내에 젖소가 아닌 젖소에서 얻었으며, 눈을 채취하는 데 최대 8시간이 걸리는 과정인 즉시 해부되었습니다. 무균 상태와 해부 품질을 유지하기 위해 눈을 즉시 절개해야 합니다. 배양 배지는 pH 7.4로 제조되고 FBS21을 보충하기 전에 멸균 여과됩니다. 모든 절차는 멸균 상태에서 수행되며, 재료 및 장비 소스 는 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 소 렌즈 문화
2. 제어 절차
3. 노출 절차
4. 광학 품질 분석(렌즈 레이저 스캐너)
5. 대사 활성 분석법(레사주린)
6. 데이터 분석
그림 2 와 그림 3 (n = 6)은 소 수정체에 대한 화학적 처리(라노스테롤)의 효과를 테스트한 연구 결과를 보여줍니다. 라노스테롤(Lanosterol)은 수정체에서 자연적으로 발생하는 스테롤로, 한때 백내장에 대한 잠재적인 약물 개입으로 유망한 결과를 보였으나25 아직 입증되지는 않았지만26. 연구 ?...
이 프로토콜의 목적은 1차 조직 배양에서 수정체에 대한 화학 물질 또는 환경 노출의 영향을 직접 평가하는 것입니다. 먼저, 렌즈를 해부하고 스캔하여 광학 품질을 확인합니다. 오염을 방지하고 해부 품질을 보장하는 것은 매우 중요합니다. 렌즈는 대조군 또는 노출 전 상태와 관련된 굴절 기능의 변화를 지속적으로 모니터링하기 위해 주기적으로 스캔됩니다. 대사 활성...
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
이 프로젝트를 위한 기금을 제공해 주신 NSERC(Natural Sciences and Engineering Research Council)와 COETF(Canadian Optometric Education Trust Fund)에 감사드립니다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
(2-Hydroxypropyl)-β-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | H107 | Powder |
1 L bottle-top filtration system | VWR | 97066-204 | Full Assembly, bottle-top, 0.2 μm |
100 mm Petri dish | VWR | 89022-320 | Slippable, media saver style, sterile |
12 well-plate | Corning | 353043 | Sterile, clear-bottom |
35 mm petri dish | VWR | 25373-041 | Falcon disposable petri dishes, sterile, Corning |
96 well-plate | VWR | 29442-072 | Sterile, clear-bottom |
Alamar blue (resazurin) | Fischer Scientific | DAL1100 | Molecular Probes cell viability reagent |
Benzalkonium chloride solution | Sigma-Aldrich | 63249 | 50% in H20 |
Biosafety cabinet | |||
Cytation 5 plate reader | BioTek | CYT5MPV | Cell imaging multi-mode reader |
Fetal bovine serum | ThermoFischer Scientific | 12484028 | Qualified, heat inactivated, Canada |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | For cell culture, powder |
Incubator | |||
Lanosterol | Sigma-Aldrich | L5768 | ≥93%, powder |
L-glutamine | Sigma-Aldrich | For cell culture, powder | |
Medium (M-199) | Sigma-Aldrich | M3769 | Modified, with Earle′s salts, without L-glutamine, sodium bicarbonate, and phenol red, powder, suitable for cell culture |
Pasteur pipettes | 5 3/4'', with and without cotton | ||
Penicillin-Streptomycin | ThermoFischer Scientific | 15140122 | Liquid (10,000 U/mL) |
Phospate buffer saline (PBS) | liquid, sterile, suitable for cell culture | ||
Pipette tips (100 µL, 1,000 µL, 5,000 µL) | VWR | Sterile | |
ScanTox (lens laser-scanner) | Specially developed in-house | N/A | Scans lens with a laser to determine lens optical quality |
ScanTox culture chamber | Specially developed in-house | N/A | Holds bovine lens in place during testing and culturing |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | For cell culture, powder |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S2770 | 1.0 N, BioReagent, suitable for cell culture |
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