안구 내 치료 부형제 및 의약품의 독성을 평가하기 위한 장기 배양 시스템

요약

이 프로토콜의 목표는 실험적 치료에 대한 반응으로 수정체의 대사 활동과 굴절 기능의 변화를 평가하는 것입니다.

초록

실명의 주요 원인인 백내장은 전 세계적으로 이 질환으로 고통받는 수천만 명의 사람들에게 큰 부담이 되고 있습니다. 다른 환경적 요인 중에서도 화학 물질 노출은 백내장의 확립된 원인입니다. 안구 독성 검사는 의약품 및 그 성분이 백내장을 유발하거나 백내장 치료를 도울 수 있는 렌즈 손상에 기여할 수 있는지 여부를 평가할 수 있습니다.

시험관 내 연구 및 생체 내 동물 실험은 임상 연구 전에 화학 물질의 안전성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 안구 독성 및 자극성 테스트에 대한 현재 생체 내 표준인 Draize 테스트는 안구 독성을 결정하기 위한 민감도와 객관적인 측정이 부족하다는 비판을 받았습니다. in vitro 세포 기반 분석은 세포 배양이 온전한 기능성 수정체를 적절하게 모델링할 수 없기 때문에 제한적입니다.

여기에 설명된 방법은 동물 실험에 대한 민감한 체외 대안으로, 세포 활성 수준과 전반적인 굴절 성능 모두에서 치료에 대한 온전한 소 수정체의 반응을 평가하도록 설계되었습니다. 무독성 시약인 레사주린은 세포 활성 수준에 비례하여 대사됩니다. 렌즈 레이저 스캐너 분석은 렌즈가 입사광을 최소한의 오류로 단일 지점으로 굴절시키는 능력을 측정하며, 이는 렌즈의 자연적인 기능과 직접적인 관련이 있습니다. 이 방법은 렌즈의 급성 및 지연성 변화뿐만 아니라 화학적 또는 환경적 노출로부터 렌즈의 회복을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

2,000만 명 이상의 사람들에게 영향을 미치는 백내장은 전 세계적으로 가장 흔한 실명 원인입니다 ^1,2. 백내장은 노화와 관련된 수정체의 변화로 인해 가장 흔하게 발생하지만 외상, 유전적 상태, 질병 또는 독성 노출로 인해 유발되기도 합니다². 현재 치료에는 수정체를 교체하기 위한 외과적 개입이 포함되며, 이는 주로 선진국 사람들이 이용할 수 있는 비용이 많이 들고 침습적인 절차입니다. 백내장으로 인한 광범위한 부담으로 인해 수십 년에 걸친 연구는 백내장 예방과 비수술적 치료법 개발을 위한 방향으로 이어졌습니다. 두 경우 모두 안과 약물의 독성, 효능 및 약동학에 대한 전임상 검사의 중요성이 가장 중요합니다. 이러한 약물 개발 과정은 동물을 대상으로 수행된 연구에서 제공하는 정보에 크게 의존합니다.

생체 내 안구 독성 검사에 대한 현재 표준은 살아있는 동물의 결막낭에 시험 화합물을 전달하는 것과 관련된 Draize 검사입니다. 이 테스트는 특히 동물 윤리, 주관성, 낮은 반복성 및 가변성과 관련하여 상당한 비판을 받았습니다³. 또한 Draize 테스트에는 테스트 물질이 렌즈에 미치는 영향을 직접 모니터링하는 구성 요소가 없습니다. 대체 체외 모델 개발에 상당한 노력이 투자되었습니다⁴. 그러나 Draize 테스트⁵를 대체할 만큼 충분히 검증된 것은 없습니다. 마찬가지로, 이러한 모델 중 다수는 백내장 및 기타 복잡한 병리학에 대한 직접적인 적용과 관련하여 한계에 직면해 있습니다⁶. 예를 들어, 격자 위에 놓았을 때 렌즈의 투명도를 등급화하는 방법은 본질적으로 주관적이다⁷. 세포 배양 연구는 신뢰할 수 있고 활용도가 높지만, 세포 단층 특성은 일차 조직 배양과 다를 수 있습니다⁸.

전체 수정체는 동물의 눈에서 해부하고 배양하여 원래의 구조와 기능을 유지할 수 있습니다. 장기의 상태를 유지하면서 수정체 기능을 평가하는 데 유용한 한 가지 분석법은 캐나다 워털루 대학에서 개발한 스캐너와 관련된 렌즈 레이저 스캐너 분석법입니다. 이 분석은 일련의 레이저 프로젝션을 사용하여 렌즈의 광학 품질 또는 굴절 성능을 측정하는 스캐닝 시스템입니다. 렌즈는 맞춤형 2-segment 배양 챔버에서 스캔되어 빔이 아래에서 렌즈를 통과할 수 있습니다(그림 1A). 스캐너 내부에 고정된 카메라는 여러 지점에서 렌즈를 통과하는 레이저의 이미지를 캡처합니다. 스캐너 소프트웨어는 렌즈가 중심 축과 교차하는 거리(back vertex distance, BVD)를 계산하여 렌즈가 단일 지점에 빛을 얼마나 일관되게 집중시키는지를 나타내는 일련의 측정값을 생성합니다(그림 1).

세포의 촘촘하고 질서 정연한 배열과 같은 렌즈의 세포 특성은 투명도를 유지하고 산란을 최소화하여 렌즈가 기능적으로 빛의 초점을 맞출 수 있도록 도와줍니다⁹. 이 측정은 화학 물질이 구배 굴절률과 같은 렌즈의 필수 구조를 얼마나 크게 방해하는지, 그리고 유도된 혼탁으로 인해 얼마나 많은 기능이 손상되는지를 해석하는 데 사용할 수 있습니다. 배양된 수정체와 수정체 소포의 반응을 추적한 다른 연구에서는 빛의 산란이 대사 변화와 비교하여 구조적 변화의 산물이며, 수정체 지질과 단백질의 파괴가 굴절률에 영향을 미쳐 결과적으로 산란을 증가시킬 수 있음을 시사합니다^10,11.

렌즈 레이저 스캐너는 세포 독성의 생화학적 측정을 결정하기 위해 분석에서 대사 시약과 함께 사용할 수 있습니다. 레사주린(Resazurin)은 활성 세포에 의해 대사되는 무독성 화학 시약으로, 측정 가능한 형광을 가진 환원된 생성물(레소루핀)을 생산합니다¹². 수정체에는 전방 상피와 표재성 피질 섬유 세포에 집중되어 있는 대사 활성 미토콘드리아를 제외하고는 세포소기관이 거의 없어 수정체 에너지 요구 사항^13,14를 충족합니다. 세포 수준에서 수정체가 손상되면 신진대사가 방해받을 수 있으며 종종 병원성 구조 변화 및 백내장이 시작되기 전에 발생합니다¹⁵.

이 방법의 목적은 백내장 발병에 기여할 수 있는 생체 이물 및 환경 노출이 렌즈에 미치는 영향을 평가하는 것입니다. 이 프로토콜에는 배양된 소 수정체를 사용하여 치료의 효과를 평가하기 위한 두 가지 분석이 포함됩니다. 이 접근법의 장점은 일차 조직인 수정체가 치료에 어떻게 반응하는지에 대한 세포 및 기능적 평가를 제공한다는 것입니다. 이는 다른 일반적인 방법과 비교하여 수정체에 대한 민감하고 객관적인 평가입니다 16,17,18.

이 모델은 계면 활성제, 소비재, 알코올 및 자외선을 포함한 다양한 노출의 영향을 평가하는 데 성공적으로 사용되었습니다 17,19,20. 광학 품질의 변화는 독성 노출에 대한 반응으로 배양 렌즈에서 일관되게 나타납니다²¹. 렌즈 배양을 장기간 유지할 수 있는 이 방법은 화합물의 잠재적인 지연 효과와 유도 손상 또는 백내장으로부터 수정체의 회복을 모니터링하는 데 매우 적합합니다^22,23. 이 프로토콜의 적용으로 생성된 결과는 안과 제품 개발에서 동물 실험에 대한 의존도를 줄이는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

모든 실험 프로토콜은 동물 조직을 사용한 연구에 대한 워털루 대학교 윤리 정책에 따라 수행되었습니다. 이번 연구를 위한 소의 눈은 도살장에서 제공되었고, 죽은 지 몇 시간 이내에 젖소가 아닌 젖소에서 얻었으며, 눈을 채취하는 데 최대 8시간이 걸리는 과정인 즉시 해부되었습니다. 무균 상태와 해부 품질을 유지하기 위해 눈을 즉시 절개해야 합니다. 배양 배지는 pH 7.4로 제조되고 FBS²¹을 보충하기 전에 멸균 여과됩니다. 모든 절차는 멸균 상태에서 수행되며, 재료 및 장비 소스 는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 소 렌즈 문화

1. 공막에서 안구 외 근육과 조직을 제거하고, 지구의 뒤쪽 절반과 유리체를 제거하고, 수정체와 함께 홍채와 섬모체를 제거한 다음, 수정체가 매체로 채워진 배양실로 떨어지도록 최종 절단을 배치하여 구역 부착물을 잘라냅니다.
2. 37°C 및 5% CO₂에서 21mL의 멸균 여과 매체를 사용하여 레이저 스캐닝 시스템에 맞게 조정된 베이스를 사용하여 절개된 렌즈를 맞춤형 챔버에서 배양합니다. 1% 페니실린-스트렙토마이신, 9.4g/L M-199, 0.1g/L L-글루타민, 5.96g/L HEPES, 2.2g/L 중탄산나트륨 및 7mL/L NaOH와 함께 3% 소 태아 혈청(FBS) 보충 배양 배지를 사용합니다. 사용하지 않은 배양 배지는 최대 7일 동안 냉장고에 보관하십시오.
3. 배양 배지는 1-2일마다 교체하십시오. 사용하기 전에 배양 배지를 37°C에서 한 시간 동안 데우십시오. 흡입 연결 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 개별 배양 챔버에서 배지를 흡입하고 보충된 배지로 즉시 보충합니다.
4. 물리적 손상이 나타날 시간을 허용하기 위해 해부 후 48시간 동안 렌즈를 배양합니다. 실험에 포함시키기 전에 섹션 4에 따라 광학 품질을 위해 렌즈를 검사하고 스캔합니다.
   참고: 렌즈는 레이저 스캐너 분석을 준비하기 위해 앞면이 아래를 향하도록 합니다.

2. 제어 절차

1. 화합물 및 배양 매체와 호환되는 가용화제의 원하는 농도로 용액을 준비합니다.
2. 보충된 매체에 가용화제를 첨가하여 차량 제어 용액을 제조합니다. 실험하기 전에 대조 용액을 37°C에서 한 시간 동안 가열합니다.
3. 흡입에 연결된 파스퇴르 피펫을 사용하여 대조 렌즈 챔버에서 배양 배지를 흡인합니다. 챔버에 제어 용액을 보충하십시오. 필요한 경우 샘플을 세 번 사용하여 이 단계를 수행합니다.
   참고: 앞쪽이 위로 향하게 한 자세로 렌즈를 완전히 덮으려면 최소 7mL의 부피가 필요합니다. 현재 연구에서 대조군의 조건은 처리되지 않은 배지 대조군 21mL, 차량 제어 배지 21mL 및 인산염 완충 식염수(PBS) 7mL였습니다.
4. 대조 매체에서 렌즈를 2일 동안 배양한 다음 섹션 1에 따라 새 대조 매체로 교체합니다. 단기 노출의 경우, 챔버에서 대조 용액을 흡인하고 섹션 1.0에 설명된 대로 렌즈 배양 프로토콜을 재개하기 전에 보충되지 않은 배양 배지로 최소 3회 헹굼을 수행합니다.
5. 광학 품질을 평가하기 전에 최소 3.5시간 동안 37°C 및 5% CO₂ 의 인큐베이터에서 렌즈가 적응하도록 합니다.

3. 노출 절차

1. 화합물 및 배양 매체와 호환되는 가용화제의 원하는 농도로 용액을 준비합니다. 화학 물질을 가용화제와 결합하여 필요한 경우 상호 작용에 적절한 시간을 허용합니다.
   참고 : 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin은 배지에서 lanosterol (0.033 g / L)의 용해도를 향상시키기 위해 현재 연구에서 사용되었습니다. 염화벤잘코늄(BAK 0.0075%) 용액은 PBS를 사용하여 제조하였다.
2. 용해된 화학 물질을 배양 배지에 통합합니다. 21 mL의 medium에서 모든 렌즈 샘플을 제공하기에 충분한 총 부피를 준비합니다. 실험하기 전에 실험 배지를 37°C에서 한 시간 동안 가열합니다.
3. 흡입에 연결된 파스퇴르 피펫을 사용하여 수정체 챔버에서 배양 배지를 흡인합니다. 즉시 챔버에 테스트 용액을 보충하십시오. 노출 간격 후에는 보충된 배양 배지로 교체하고 필요한 경우 먼저 헹굼을 수행합니다. 필요한 경우 샘플을 세 번 사용하여 이 단계를 수행합니다.
   참고: 현재 연구에서 테스트 조건은 라노스테롤이 보충된 배지 21mL와 BAK 0.0075% 용액 7mL였습니다. 렌즈를 완전히 덮으려면 최소 7mL의 부피가 필요합니다. 이 경우 렌즈는 먼저 앞쪽이 위로 향하게 해야 합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 주변 배양 배지 중 일부와 함께 배양 챔버에 전류를 생성하여 렌즈의 위치를 변경할 수 있습니다.
4. 광학 품질을 평가하기 전에 렌즈를 인큐베이터에 최소 3.5시간 동안 다시 넣어 적응시킵니다.
   참고: 렌즈는 레이저 스캐너 분석을 준비하기 위해 앞면이 아래를 향하도록 합니다.

4. 광학 품질 분석(렌즈 레이저 스캐너)

1. 렌즈가 앞쪽이 아래를 향하도록 하고 배양실에서 시각적으로 수평을 이루도록 하고 필요한 경우 3.3단계의 기술을 사용하여 렌즈의 위치를 조정합니다.
   알림: 이 위치는 입사 빔이 챔버 바닥을 통해 위로 반사되고 렌즈를 통해 전방에서 후방 표면으로 통과하도록 합니다.
2. 렌즈 배양 챔버를 레이저 스캐너에 배치하여 챔버 캐리지 핀이 챔버 베이스의 슬롯에 맞도록 합니다.
3. 스캔을 수행할 렌즈 와 스캔 포인트를 선택하고 스캔 렌즈를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음 스캐너에서 빔을 찾아 정렬하라는 메시지를 표시할 때까지 기다립니다. 렌즈 뒤에 있는 빔에 대해 잘 떨어진 시작점과 끝점을 선택합니다. 스캐너 소프트웨어의 총 및 미세 조정 버튼과 스캐너의 조정 손잡이를 사용하여 중앙 빔이 정렬되었는지 확인합니다. 빔이 정렬되면 calibrate(보정 )를 클릭하고 방사형 단계 및 빔 분리를 적절하게 선택합니다.
   참고: 소 렌즈를 사용한 이 연구에서는 방사형 계단 및 빔 분리 설정이 각각 10단계 및 0.5mm로 설정되었습니다. 스캐너가 수행하는 첫 번째 스캔은 레이저 스캐너를 보정하는 역할을 합니다. 이는 한 번만 필요하며, 모든 추가 렌즈 스캔은 정렬 직후에 수행할 수 있습니다.
4. 스캐너가 보정되면 스캔을 클릭합니다. 렌즈 스캔이 완료된 후 한 축을 따라 BVD 평균, 표준 편차 및 오류에 대한 값이 생성될 때까지 기다렸다가 빔의 범위를 설정합니다. 빔이 렌즈에서 나오는 위치에서 원하는 끝점까지 범위를 설정하고, 명백한 간섭을 제외하면서 렌즈 뒤의 최대 거리를 선택합니다.
5. 생성된 차트를 사용하여 각 빔에 대한 개별 후방 정점 거리를 볼 수 있습니다.
   알림: 렌즈 봉합사를 통과하는 빔을 제외합니다. 빔을 제외하려면 화면의 범례를 사용하여 개별 빔을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 제외를 선택합니다.
6. 스캐너 내부의 배양 챔버 베이스의 위치를 수동으로 90° 회전하여 수정체 표면을 따라 두 번째 스캔이 이전 스캔과 수직이 되도록 합니다. 중앙 빔이 4.3단계에 설명된 대로 정렬되었는지 확인한 다음 렌즈를 스캔합니다.

5. 대사 활성 분석법(레사주린)

1. FBS가 없는 매체를 준비합니다. 37 °C에서 한 시간 동안 매체를 데웁니다. 8% 레사주린 시약 50mL를 비보충 배지에 준비합니다.
   참고: 50웰 플레이트의 모든 웰을 채우기 위해 12mL를 준비하는 것으로 충분합니다. 용액은 resazurin이 빛에 민감하기 때문에 불투명한 용기에서 희미한 조건에서 무균으로 준비해야 합니다.
2. 바닥이 투명한 멸균 12웰 플레이트 내의 각 웰에 8% 레사주린 용액 3.8mL를 추가하여 렌즈를 덮습니다.
3. 멸균 금속 스쿱을 사용하여 뒤쪽 표면 아래에서 렌즈를 조심스럽게 들어 올리고 파스퇴르 피펫을 사용하여 소량의 보충되지 않은 배양 배지로 렌즈를 세척하여 헹굽니다. 각 웰에 렌즈를 개별적으로 놓습니다.
4. 웰 플레이트를 37°C 및 5% CO₂ 에서 5시간 동안 배양합니다. 배양 후 우물에서 금속 스쿱으로 렌즈를 제거하고 동물 배설물 처리 용기에 넣습니다. 각 웰에서 100μL 샘플을 바닥이 투명한 멸균 96웰 플레이트로 옮깁니다.
   참고: 렌즈는 대사 활동 분석법으로 여러 번 평가할 수 있습니다. 이 경우 배양을 위해 렌즈를 새로운 배지가 있는 배양실로 되돌려 놓습니다. 대사 활성 분석은 염료가 BVD 측정에 영향을 미칠 수 있으므로 모든 스캔이 완료된 후에 가장 잘 수행됩니다.
5. 여기 파장과 방출 파장을 각각 560nm 및 590nm로 설정하여 형광 플레이트 리더를 사용하여 100μL 샘플의 종말점 형광을 측정합니다.

6. 데이터 분석

1. 광학 품질 분석의 경우, 각 시점에서 수행된 두 스캔에서 BVD 오류²⁴ 에 대해 소프트웨어로 계산된 값의 평균을 계산합니다. 모든 렌즈와 모든 스캔 포인트에 대해 이 계산을 수행합니다.
2. 대사 활성 분석을 위해 플레이트 리더에서 생성된 종말점 상대 형광 값을 수집합니다. 스캔 지점에서 모든 제어 값의 평균을 100%로 설정하여 데이터를 정규화합니다. 각 렌즈의 활성을 해당 스캔포인트에 대한 평균 control value의 백분율로 계산합니다.
3. 모든 실험 그룹에 대해 정규성 검정을 수행합니다. 데이터가 정상이라고 가정하고 양방향 ANOVA를 사용하여 대조 렌즈와 실험 렌즈 간의 BVD 오차 차이를 분석합니다. 또한 Tukey의 사후 다중 비교 검정을 수행합니다. 대사 활동 데이터에 대해 일원 분산 분석과 Dunnett의 사후 검정을 수행합니다.

결과

그림 2 와 그림 3 (n = 6)은 소 수정체에 대한 화학적 처리(라노스테롤)의 효과를 테스트한 연구 결과를 보여줍니다. 라노스테롤(Lanosterol)은 수정체에서 자연적으로 발생하는 스테롤로, 한때 백내장에 대한 잠재적인 약물 개입으로 유망한 결과를 보였으나²⁵ 아직 입증되지는 않았지만²⁶. 연구 ?...

토론

이 프로토콜의 목적은 1차 조직 배양에서 수정체에 대한 화학 물질 또는 환경 노출의 영향을 직접 평가하는 것입니다. 먼저, 렌즈를 해부하고 스캔하여 광학 품질을 확인합니다. 오염을 방지하고 해부 품질을 보장하는 것은 매우 중요합니다. 렌즈는 대조군 또는 노출 전 상태와 관련된 굴절 기능의 변화를 지속적으로 모니터링하기 위해 주기적으로 스캔됩니다. 대사 활성...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
(2-Hydroxypropyl)-β-cyclodextrin	Sigma-Aldrich	H107	Powder
1 L bottle-top filtration system	VWR	97066-204	Full Assembly, bottle-top, 0.2 μm
100 mm Petri dish	VWR	89022-320	Slippable, media saver style, sterile
12 well-plate	Corning	353043	Sterile, clear-bottom
35 mm petri dish	VWR	25373-041	Falcon disposable petri dishes, sterile, Corning
96 well-plate	VWR	29442-072	Sterile, clear-bottom
Alamar blue (resazurin)	Fischer Scientific	DAL1100	Molecular Probes cell viability reagent
Benzalkonium chloride solution	Sigma-Aldrich	63249	50% in H20
Biosafety cabinet
Cytation 5 plate reader	BioTek	CYT5MPV	Cell imaging multi-mode reader
Fetal bovine serum	ThermoFischer Scientific	12484028	Qualified, heat inactivated, Canada
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	For cell culture, powder
Incubator
Lanosterol	Sigma-Aldrich	L5768	≥93%, powder
L-glutamine	Sigma-Aldrich		For cell culture, powder
Medium (M-199)	Sigma-Aldrich	M3769	Modified, with Earle′s salts, without L-glutamine, sodium bicarbonate, and phenol red, powder, suitable for cell culture
Pasteur pipettes			5 3/4'', with and without cotton
Penicillin-Streptomycin	ThermoFischer Scientific	15140122	Liquid (10,000 U/mL)
Phospate buffer saline (PBS)			liquid, sterile, suitable for cell culture
Pipette tips (100 µL, 1,000 µL, 5,000 µL)	VWR		Sterile
ScanTox (lens laser-scanner)	Specially developed in-house	N/A	Scans lens with a laser to determine lens optical quality
ScanTox culture chamber	Specially developed in-house	N/A	Holds bovine lens in place during testing and culturing
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	For cell culture, powder
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S2770	1.0 N, BioReagent, suitable for cell culture