Система культивирования органов для оценки токсичности вспомогательных веществ и фармацевтических препаратов для внутриглазного лечения

Резюме

Целью данного протокола является оценка изменений метаболической активности и преломляющей функции хрусталика в ответ на экспериментальное лечение.

Аннотация

Катаракта, являющаяся основной причиной слепоты, является серьезным бременем для десятков миллионов людей во всем мире, страдающих этим заболеванием. Воздействие химических веществ, наряду с другими факторами окружающей среды, является установленной причиной катаракты. Тестирование на офтальмологическую токсичность может оценить, могут ли фармацевтические препараты и их компоненты способствовать повреждению хрусталика, которое может привести к катаракте или помочь в лечении катаракты.

Исследования in vitro и испытания на животных in vivo могут быть использованы для оценки безопасности химических веществ до начала клинических исследований. Тест Дрейза — текущий стандарт in vivo для тестирования глазной токсичности и раздражения — подвергся критике за недостаточную чувствительность и объективные измерения определения глазной токсичности. Клеточные анализы in vitro ограничены, поскольку клеточные культуры не могут надлежащим образом смоделировать неповрежденный функциональный хрусталик.

Описанный здесь метод представляет собой чувствительную альтернативу испытаниям на животных in vitro , предназначенную для оценки реакции неповрежденного бычьего хрусталика на лечение как на уровне клеточной активности, так и на уровне общей рефракции. Нетоксичный реагент резазурин метаболизируется пропорционально уровню активности клеток. Лазерно-сканерный анализ линзы измеряет способность линзы преломлять падающие лучи света в одну точку с минимальной погрешностью, непосредственно связанной с его естественной функцией. Метод может быть использован для определения как острых, так и отсроченных изменений хрусталика, а также восстановления хрусталика после химических воздействий или воздействий окружающей среды.

Введение

Катаракта, поражающая более 20 миллионов человек, является наиболее распространенной причиной слепоты во всем мире ^1,2. Катаракта чаще всего возникает из-за возрастных изменений хрусталика, но также вызвана травмой, генетическими состояниями, болезнями или токсическим воздействием². В настоящее время лечение включает в себя хирургическое вмешательство по замене хрусталика, дорогостоящую и инвазивную процедуру, доступную в основном в развитых странах. Обширное бремя катаракты направило десятилетия исследований на профилактику катаракты и разработку нехирургических методов лечения. В обоих случаях важность доклинических испытаний на токсичность, эффективность и фармакокинетику офтальмологических препаратов имеет первостепенное значение. Этот процесс разработки лекарств в значительной степени опирается на информацию, полученную в ходе исследований, проведенных на животных.

В настоящее время стандартом для тестирования глазной токсичности in vivo является тест Дрейза, включающий доставку исследуемого соединения в конъюнктивальный мешок живого животного. Тест подвергся значительной критике, особенно в отношении этики животных, субъективности, плохой повторяемости и^{изменчивости}. Кроме того, в тесте Дрейза нет компонента, который напрямую отслеживал бы воздействие исследуемых веществ на объектив. Значительные усилия были вложены в разработку альтернативных моделей in vitro ⁴. Тем не менее, ни один из них не был достаточно валидирован, чтобы заменить тест Дрейза⁵. Аналогичным образом, многие из этих моделей сталкиваются с ограничениями в отношении прямого применения к катаракте и другим сложным патологиям⁶. Например, методы оценки прозрачности объектива при размещении над сеткой по своей сути субъективны⁷. Исследования клеточных культур надежны и широко используются, хотя характеристики монослоя клеток могут отличаться от характеристик первичной культуры тканей⁸.

Целые хрусталики могут быть отделены от глаз животных и культивированы для сохранения их первоначальной структуры и функции. Одним из анализов, который полезен для оценки функции хрусталика при сохранении состояния органа, является анализ с помощью лазерного сканера хрусталика с использованием сканера, разработанного в Университете Ватерлоо в Канаде. Анализ представляет собой сканирующую систему, в которой используется серия лазерных проекций для измерения оптического качества или преломляющих характеристик хрусталика. Линзы сканируются в специальных двухсегментных камерах для культивирования, что позволяет лучам проходить снизу через линзу (рис. 1A). Камера, установленная внутри сканера, фиксирует изображение лазера, проходящего через объектив в многочисленных точках. Программное обеспечение сканера вычисляет расстояние за линзой, на котором она пересекается с центральной осью (расстояние до задней вершины, BVD), производя серию измерений, которые показывают, насколько последовательно линза фокусирует свет в одной точке (рис. 1).

Ячеистые свойства хрусталика, такие как плотное и упорядоченное расположение его ячеек, помогают поддерживать прозрачность и минимизировать рассеяние, чтобы линза могла функционально^{фокусировать свет.} Эта мера может быть использована для интерпретации того, насколько сильно химическое вещество нарушает основную структуру хрусталика, такую как градиентный показатель преломления, и насколько функция нарушается из-за индуцированных помутнений. Другие исследования, в которых изучалась реакция культивируемых хрусталиков и везикул хрусталика, показывают, что рассеяние света является продуктом структурных изменений, по сравнению с метаболическими изменениями, и что нарушения липидов и белков хрусталика могут повлиять на показатель преломления и, следовательно, увеличить рассеяние^10,11.

Линзовый лазерный сканер может быть использован в сочетании с метаболическими реагентами в анализах для определения биохимических показателей токсичности клеток. Резазурин представляет собой нетоксичный химический реагент, метаболизируемый активными клетками с образованием восстановленного продукта (резоруфина) с измеряемой флуоресценцией¹². Хрусталик в значительной степени лишен органелл, за исключением метаболически активных митохондрий, сосредоточенных в переднем эпителии и поверхностных корковых волокнах, удовлетворяющих энергетические потребности хрусталика^13,14. Повреждение хрусталика на клеточном уровне может нарушить обмен веществ и часто предшествует возникновению патогенных структурных изменений и катаракты¹⁵.

Целью данного метода является оценка влияния ксенобиотиков и воздействия окружающей среды на хрусталик, которые могут способствовать развитию катаракты. Протокол включает в себя два анализа для оценки эффекта лечения с использованием культивируемого бычьего хрусталика. Преимущество этого подхода заключается в том, что он обеспечивает как клеческую, так и функциональную оценку того, как хрусталик как первичная ткань реагирует на лечение. Это чувствительная и объективная оценка хрусталика по сравнению с другими распространенными методами 16,17,18.

Модель была успешно использована для оценки эффектов различных воздействий, включая поверхностно-активные вещества, потребительские товары, алкоголь и ультрафиолетовое излучение 17,19,20. Изменения оптического качества постоянно присутствуют в культивируемых линзах в ответ на токсическое воздействие²¹. Способность этого метода поддерживать долгосрочную культуру хрусталика хорошо подходит для мониторинга потенциально отсроченного эффекта соединения и восстановления хрусталика от индуцированного повреждения или катаракты^22,23. Результаты, полученные в результате применения этого протокола, могут быть использованы для снижения зависимости от испытаний на животных при разработке офтальмологических продуктов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все протоколы экспериментов были проведены в соответствии с этической политикой Университета Ватерлоо в отношении исследований с использованием тканей животных. Бычьи глаза для данного исследования были получены от немолочных коров в течение нескольких часов после смерти и немедленно препарированы, что занимает до 8 часов с момента получения глаз. Глаза должны быть немедленно рассечены для сохранения стерильности и качества диссекции. Питательную среду подготавливают до рН 7,4 и стерильно фильтруют перед добавлением FBS²¹. Все процедуры проводятся в стерильных условиях, при этом источники материалов и оборудования указаны в Таблице материалов.

1. Культура хрусталика крупного рогатого скота

1. Препарируйте хрусталик путем удаления экстраокулярных мышц и тканей склеры, удаления задней половины глазного яблока и стекловидного тела, удаления радужки и цилиарного тела вместе с хрусталиком, затем отрезания зонулярных креплений, при этом окончательный разрез расположить таким образом, чтобы хрусталик опустился в камеру для культуры, заполненную средой.
2. Препарированные линзы культивируют в специальных камерах с основанием, адаптированным для системы лазерного сканирования, с 21 мл стерильно отфильтрованной среды при 37 °C и 5%_CO2. Используйте питательную среду с добавлением 3% фетальной бычьей сыворотки (FBS) с 1% пенициллин-стрептомицина, 9,4 г/л M-199, 0,1 г/л L-глютамина, 5,96 г/л HEPES, 2,2 г/л бикарбоната натрия и 7 мл/л NaOH. Неиспользованную питательную среду хранить в холодильнике до 7 дней.
3. Заменяйте питательную среду каждые 1-2 дня. Перед использованием питательную среду прогрейте в течение часа при температуре 37 °C. С помощью стерильной пастеровской пипетки, подключенной к всасыванию, отсасывайте среду из индивидуальной камеры для культивирования и немедленно пополняйте ее с помощью добавленной среды.
4. Культивируйте хрусталики в течение 48 часов после вскрытия, чтобы дать время для проявления физического повреждения. Осмотрите и отсканируйте линзы на предмет оптического качества в соответствии с разделом 4 перед включением в эксперимент.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Линзы ориентированы лицевой стороной вниз при подготовке к лазерному сканированию.

2. Порядок действий

1. Приготовьте раствор с нужной концентрацией солюбилизирующего агента, совместимого с химическим соединением и питательной средой.
2. Приготовьте раствор для управления транспортным средством, добавив солюбилизирующий агент в добавку. Перед экспериментом нагрейте контрольный раствор в течение часа до 37 °C.
3. Используйте пастеровский пипетку, подключенную к отсасыванию, для аспирации питательной среды из камер контрольных линз. Пополните камеры раствором для контроля. При необходимости выполните этот шаг с образцами в трех экземплярах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальный объем 7 мл необходим для полного покрытия линзы в переднем положении лицевой стороной вверх. Условия для контроля в данном исследовании составляли 21 мл необработанной среды контроля, 21 мл контрольной среды для транспортного средства и 7 мл фосфатно-солевого буфера (PBS).
4. Заквашивайте линзы в контрольной среде в течение 2 дней, затем замените новой контрольной средой в соответствии с разделом 1. При кратковременном воздействии отсасывайте контрольный раствор из камер и промывайте его не менее трех раз питательной средой без добавок, прежде чем возобновить протокол культивирования хрусталика, как описано в разделе 1.0.
5. Дайте линзам акклиматизироваться в инкубаторе при температуре 37 °C и 5%_CO2 в течение не менее 3,5 часов до оценки оптического качества.

3. Процедура воздействия

1. Приготовьте раствор с нужной концентрацией солюбилизирующего агента, совместимого с химическим соединением и питательной средой. Смешайте химическое вещество с солюбилизирующим агентом, при необходимости предоставив соответствующее время для взаимодействия.
   Примечание: 2-гидроксипропил-β-циклодекстрин был использован в настоящем исследовании для повышения растворимости ланостерола (0,033 г/л) в среде. Раствор бензалкония хлорида (БАК 0,0075%) готовили с использованием ПБС.
2. Добавьте солюбилизированное химическое вещество в питательную среду. Подготовьте общий объем, достаточный для обеспечения 21 мл среды для всех образцов объективов. Перед экспериментом нагрейте испытуемую среду в течение часа при температуре 37 °C.
3. Используйте пипетку Пастера, подключенную к отсасыванию, для аспирации питательной среды из камер линз. Немедленно пополните камеры тестовым раствором. По истечении интервала воздействия замените на добавленную питательную среду, предварительно выполнив полоскание при необходимости. При необходимости выполните этот шаг с образцами в трех экземплярах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании условия тестирования составляли 21 мл среды, обогащенной ланостерином, и 7 мл 0,0075% раствора BAK. Минимальный объем 7 мл необходим для полного покрытия объектива. В этом случае линзы в первую очередь должны быть ориентированы передней лицевой стороной вверх. Пипетка Пастера может быть использована для создания тока в камере для культивирования с некоторой частью окружающей питательной среды для изменения положения хрусталика.
4. Верните линзы в инкубатор не менее чем на 3,5 ч для акклиматизации перед оценкой оптического качества.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Линзы ориентированы лицевой стороной вниз при подготовке к лазерному сканированию.

4. Оптический контроль качества (линзовый лазер-сканер)

1. Убедитесь, что линзы ориентированы передней стороной вниз и визуально выровнены в камере для культивирования, используя технику из шага 3.3 для корректировки положения хрусталика, если это необходимо.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Такое положение гарантирует, что падающий луч будет отражаться вверх через дно камеры и проходить через линзу от передней поверхности к задней.
2. Поместите камеру для культивирования линз в лазерный сканер таким образом, чтобы штифт каретки камеры вошел в паз в основании камеры.
3. Выберите объектив и точку сканирования , для которых необходимо выполнить сканирование, щелкните правой кнопкой мыши по объективу сканирования и дождитесь, пока сканер предложит найти и выровнять луч. Выберите начало и конечные точки на достаточном расстоянии для луча за объективом. Убедитесь, что центральный луч выровнен с помощью кнопок грубой и точной регулировки в программном обеспечении сканера и ручки регулировки на сканере. Когда луч будет выровнен, нажмите кнопку «Калибровка» и введите соответствующий выбор радиальных ступеней и разделения луча.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для данного исследования с использованием бычьего хрусталика настройки радиальных ступеней и разделения луча были установлены на 10 ступеней и 0,5 мм соответственно. Первое сканирование, которое выполняет сканер, служит для калибровки лазерного сканера. Это требуется один раз, и все дополнительные сканирования линз могут быть выполнены сразу после юстировки.
4. После калибровки сканера нажмите кнопку «Сканировать». Подождите, пока будут сгенерированы значения среднего значения BVD, стандартного отклонения и ошибки по одной оси после завершения сканирования объектива, а также установки области луча. Установите осциллограф с места, откуда лучи выходят из объектива, в нужную конечную точку, выбрав максимальное расстояние за линзой, исключив при этом любые видимые помехи.
5. Используйте созданную диаграмму для просмотра отдельных обратных вершинных расстояний для каждого луча.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Исключите прохождение лучей через шовные материалы линз. Чтобы исключить балку, используйте условные обозначения на экране, щелкните правой кнопкой мыши отдельную балку и выберите «Исключить».
6. Вручную поверните положение основания камеры для культивирования внутри сканера на 90° таким образом, чтобы второе сканирование вдоль передней поверхности хрусталика было перпендикулярно предыдущему сканированию. Убедитесь, что центральный луч выровнен, как описано в шаге 4.3, а затем отсканируйте линзу.

5. Анализ метаболической активности (резазурин)

1. Приготовьте среду без FBS. Прогрейте среду в течение часа при температуре 37 °C. Приготовьте 50 мл 8% реагента резазурина в необогащенной среде.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Достаточно подготовить 50 мл для заполнения всех лунок в 12-луночной пластине. Раствор следует готовить стерильно при тусклых условиях в непрозрачной емкости, так как резазурин светочувствительный.
2. Добавьте 3,8 мл 8% раствора резазурина в каждую лунку в стерильном 12-луночном планшете с прозрачным дном, чтобы покрыть линзу.
3. С помощью стерильных металлических совков осторожно приподнимайте линзы из-под задней поверхности и промывайте линзу с помощью пипетки Пастера небольшим объемом питательной среды без добавок. Поместите линзы по отдельности в каждую лунку.
4. Инкубируйте лунку при 37 °C и 5%_CO2 в течение 5 часов. После инкубации извлеките из лунок линзы с металлическими совками и поместите их в контейнер для утилизации отходов животного происхождения. Перелейте образец объемом 100 мкл из каждой лунки в стерильный 96-луночный планшет с прозрачным дном.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Линзы могут быть оценены несколько раз с помощью анализа метаболической активности. В этом случае верните линзы в камеры культуры со свежей средой для инкубации. Анализ метаболической активности лучше всего проводить после завершения всех сканирований, так как краситель может повлиять на измерения BVD.
5. Измерьте конечную флуоресценцию образцов объемом 100 мкл с помощью считывателя флуоресцентных пластин с длинами волн возбуждения и излучения 560 нм и 590 нм соответственно.

6. Анализ данных

1. Для анализа оптического качества рассчитайте среднее арифметическое значений, рассчитанных программным обеспечением для ошибки BVD²⁴ на основе двух сканирований, выполненных в каждой временной точке. Выполните этот расчет для всех объективов и всех точек сканирования.
2. Для анализа метаболической активности соберите конечные значения относительной флуоресценции, полученные с помощью планшетного ридера. Нормализуйте данные, установив среднее значение всех контрольных значений на scanpoint на 100%. Рассчитайте активность каждой линзы в процентах от среднего контрольного значения для этой точки сканирования.
3. Проведите тест на нормальность для всех экспериментальных групп. Предполагая, что данные в норме, проанализируйте разницу в ошибках BVD между контрольными и экспериментальными объективами с помощью двустороннего ANOVA. Кроме того, выполните тест множественных сравнений Тьюки post-hoc. Выполните однофакторный ANOVA и апостериорный тест Даннетта для получения данных о метаболической активности.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

На рисунках 2 и 3 (n = 6) представлены результаты исследования, в котором изучалось влияние химической обработки (ланостерола) на бычий хрусталик. Ланостерол – это природный стерол в хрусталике, который когда-то показал многообещающие рез...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Целью данного протокола является непосредственная оценка воздействия химических веществ или окружающей среды на хрусталик в первичной культуре тканей. Сначала линзы препарируются и сканируются на оптическое качество. Предотвращение загрязнения и обеспечение каче...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
(2-Hydroxypropyl)-β-cyclodextrin	Sigma-Aldrich	H107	Powder
1 L bottle-top filtration system	VWR	97066-204	Full Assembly, bottle-top, 0.2 μm
100 mm Petri dish	VWR	89022-320	Slippable, media saver style, sterile
12 well-plate	Corning	353043	Sterile, clear-bottom
35 mm petri dish	VWR	25373-041	Falcon disposable petri dishes, sterile, Corning
96 well-plate	VWR	29442-072	Sterile, clear-bottom
Alamar blue (resazurin)	Fischer Scientific	DAL1100	Molecular Probes cell viability reagent
Benzalkonium chloride solution	Sigma-Aldrich	63249	50% in H20
Biosafety cabinet
Cytation 5 plate reader	BioTek	CYT5MPV	Cell imaging multi-mode reader
Fetal bovine serum	ThermoFischer Scientific	12484028	Qualified, heat inactivated, Canada
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	For cell culture, powder
Incubator
Lanosterol	Sigma-Aldrich	L5768	≥93%, powder
L-glutamine	Sigma-Aldrich		For cell culture, powder
Medium (M-199)	Sigma-Aldrich	M3769	Modified, with Earle′s salts, without L-glutamine, sodium bicarbonate, and phenol red, powder, suitable for cell culture
Pasteur pipettes			5 3/4'', with and without cotton
Penicillin-Streptomycin	ThermoFischer Scientific	15140122	Liquid (10,000 U/mL)
Phospate buffer saline (PBS)			liquid, sterile, suitable for cell culture
Pipette tips (100 µL, 1,000 µL, 5,000 µL)	VWR		Sterile
ScanTox (lens laser-scanner)	Specially developed in-house	N/A	Scans lens with a laser to determine lens optical quality
ScanTox culture chamber	Specially developed in-house	N/A	Holds bovine lens in place during testing and culturing
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	For cell culture, powder
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S2770	1.0 N, BioReagent, suitable for cell culture