Système de culture d’organes pour l’évaluation de la toxicité d’excipients et de produits pharmaceutiques de traitement intraoculaire

Résumé

L’objectif de ce protocole est d’évaluer les changements dans l’activité métabolique et la fonction réfractive du cristallin en réponse à un traitement expérimental.

Résumé

En tant que principale cause de cécité, la cataracte représente un fardeau important pour les dizaines de millions de personnes touchées par cette maladie dans le monde. L’exposition aux produits chimiques, parmi d’autres facteurs environnementaux, est une cause établie de cataractes. Les tests de toxicité oculaire peuvent évaluer si les produits pharmaceutiques et leurs composants peuvent contribuer à des lésions du cristallin pouvant entraîner des cataractes ou faciliter le traitement de la cataracte.

Les études in vitro et les essais in vivo sur les animaux peuvent être utilisés pour évaluer l’innocuité des produits chimiques avant les études cliniques. Le test de Draize, la norme actuelle in vivo pour les tests de toxicité oculaire et d’irritance, a été critiqué pour son manque de sensibilité et de mesures objectives permettant de déterminer la toxicité oculaire. Les essais cellulaires in vitro sont limités, car les cultures cellulaires ne peuvent pas modéliser correctement un cristallin fonctionnel intact.

La méthode décrite ici est une alternative in vitro sensible à l’expérimentation animale, conçue pour évaluer la réponse du cristallin bovin intact au traitement à la fois au niveau de l’activité cellulaire et de la performance de réfraction globale. La résazurine, un réactif non toxique, est métabolisée proportionnellement au niveau d’activité cellulaire. Le test du scanner laser à lentille mesure la capacité de la lentille à réfracter les faisceaux de lumière incidents en un seul point avec une erreur minimale, directement liée à sa fonction naturelle. La méthode peut être utilisée pour déterminer les changements aigus et retardés du cristallin, ainsi que la récupération du cristallin à la suite d’expositions chimiques ou environnementales.

Introduction

Touchant plus de 20 millions de personnes, la cataracte est la cause la plus répandue de cécité dans le monde ^1,2. Les cataractes sont le plus souvent dues à des changements du cristallin liés à l’âge, mais sont également induites par un traumatisme, des conditions génétiques, une maladie ou une exposition toxique². Actuellement, le traitement implique une intervention chirurgicale pour remplacer le cristallin, une procédure coûteuse et invasive accessible principalement aux personnes des pays développés. Le lourd fardeau de la cataracte a orienté des décennies de recherche vers la prévention de la cataracte et le développement de traitements non chirurgicaux. Dans les deux cas, l’importance des tests précliniques pour la toxicité, l’efficacité et la pharmacocinétique des médicaments ophtalmiques est primordiale. Ce processus de développement de médicaments repose en grande partie sur les informations fournies par des études réalisées sur des animaux.

La norme actuelle pour les essais de toxicité oculaire in vivo est l’essai de Draize, qui consiste à administrer un composé d’essai dans le sac conjonctival d’un animal vivant. Le test a été considérablement critiqué, en particulier en ce qui concerne l’éthique animale, la subjectivité, la faible répétabilité et la variabilité³. De plus, aucun élément du test de Draize ne surveille directement les effets des substances d’essai sur le cristallin. Des efforts considérables ont été investis dans le développement de modèles alternatifs in vitro ⁴. Cependant, aucun n’a été suffisamment validé pour remplacer le test^de Draize 5. De même, beaucoup de ces modèles sont confrontés à des limites en ce qui concerne l’application directe à la cataracte et à d’autres pathologies complexes⁶. Par exemple, les méthodes d’étalonnage de la transparence de l’objectif lorsqu’elles sont placées sur une grille sont intrinsèquement subjectives⁷. Les études de culture cellulaire sont fiables et très utilisées, bien que les caractéristiques des monocouches cellulaires puissent diverger de celles de la culture tissulaire primaire⁸.

Des lentilles entières peuvent être disséquées à partir des yeux d’animaux et cultivées pour conserver leur structure et leur fonction d’origine. Un test utile pour évaluer la fonction du cristallin tout en maintenant l’état de l’organe est le test au scanner laser à lentille impliquant un scanner développé à l’Université de Waterloo au Canada. Le test est un système de balayage qui utilise une série de projections laser pour mesurer la qualité optique ou les performances de réfraction de la lentille. Les lentilles sont balayées dans leurs chambres de culture personnalisées à deux segments, ce qui permet aux faisceaux de passer par le bas à travers la lentille (Figure 1A). Une caméra fixée à l’intérieur du scanner capture l’image du laser passant à travers l’objectif en de nombreux points. Le logiciel du scanner calcule la distance derrière l’objectif à laquelle elle intersecte un axe central (distance au sommet arrière, BVD), produisant une série de mesures qui indiquent la cohérence avec laquelle l’objectif focalise la lumière sur un seul point (Figure 1).

Les propriétés cellulaires de la lentille, telles que la disposition serrée et ordonnée de ses cellules, aident à maintenir la transparence et à minimiser la diffusion afin que la lentille puisse focaliser la lumière de manière fonctionnelle⁹. Cette mesure peut être utilisée pour interpréter l’importance de la perturbation de la structure essentielle du cristallin, comme l’indice de réfraction du gradient, et la quantité de fonction compromise en raison des opacités induites. D’autres études qui ont suivi la réponse des lentilles cultivées et des vésicules du cristallin suggèrent que la diffusion de la lumière est le produit de changements structurels, par rapport aux changements métaboliques, et que les perturbations des lipides et des protéines du cristallin peuvent affecter l’indice de réfraction et, par conséquent, augmenter la diffusion^10,11.

Le scanner laser à lentille peut être utilisé en conjonction avec des réactifs métaboliques dans des tests pour déterminer les mesures biochimiques de la toxicité cellulaire. La résazurine est un réactif chimique non toxique métabolisé par les cellules actives, produisant un produit réduit (résorufine) avec une fluorescence mesurable¹². Le cristallin est en grande partie dépourvu d’organites, à l’exception des mitochondries métaboliquement actives concentrées dans l’épithélium antérieur et les cellules corticales superficielles des fibres, répondant aux besoins énergétiques du cristallin^13,14. Les lésions du cristallin au niveau cellulaire peuvent perturber le métabolisme et précèdent souvent l’apparition de changements structurels pathogènes et de la cataracte¹⁵.

Le but de cette méthode est d’évaluer l’effet des expositions aux xénobiotiques et à l’environnement sur le cristallin, ce qui peut contribuer au développement de la cataracte. Le protocole comprend deux essais pour évaluer l’effet d’un traitement utilisant le cristallin bovin en culture. L’avantage de cette approche est qu’elle fournit une évaluation à la fois cellulaire et fonctionnelle de la façon dont le cristallin en tant que tissu primaire répond au traitement. Il s’agit d’une évaluation sensible et objective de l’objectif par rapport à d’autres méthodes courantes 16,17,18.

Le modèle a été utilisé avec succès pour évaluer les effets de diverses expositions, y compris les tensioactifs, les produits de consommation, les alcools et les rayons ultraviolets 17,19,20. Des changements dans la qualité optique sont constamment présents dans les lentilles de culture en réponse à une exposition toxique²¹. La capacité de cette méthode à maintenir la culture à long terme du cristallin est bien adaptée pour surveiller l’effet potentiellement retardé d’un composé et la récupération du cristallin après des dommages induits ou une cataracte^22,23. Les résultats obtenus grâce à l’application de ce protocole peuvent être utilisés pour réduire la dépendance à l’égard de l’expérimentation animale dans le développement de produits ophtalmiques.

Protocole

Tous les protocoles expérimentaux ont été réalisés conformément aux politiques d’éthique de l’Université de Waterloo pour la recherche utilisant des tissus animaux. Les yeux de bovins de la présente étude ont été fournis par l’abattoir, obtenus à partir de vaches non laitières quelques heures après la mort, et ont été disséqués immédiatement, un processus qui prend jusqu’à 8 heures à partir de l’obtention des yeux. Les yeux doivent être disséqués immédiatement pour préserver la stérilité et la qualité de la dissection. Le milieu de culture est préparé à un pH de 7,4 et filtré stérilement avant d’être complété par FBS²¹. Toutes les procédures sont effectuées dans des conditions stériles, les sources de matériaux et d’équipements étant répertoriées dans la table des matériaux.

1. Culture du cristallin bovin

1. Disséquez les lentilles en enlevant les muscles et les tissus extraoculaires de la sclère, en enlevant la moitié postérieure du globe et du vitré, en enlevant l’iris et le corps ciliaire avec le cristallin, puis en coupant les attaches zonulaires, la coupe finale étant positionnée de telle sorte que le cristallin tombera dans la chambre de culture remplie de moyen.
2. Cultivez les lentilles disséquées dans des chambres personnalisées avec une base adaptée au système de balayage laser, avec 21 mL de milieu filtré stérile, à 37 °C et 5 % de CO₂. Utiliser un milieu de culture supplémenté en sérum de bovin fœtal à 3 % avec 1 % de pénicilline-streptomycine, 9,4 g/L de M-199, 0,1 g/L de L-glutamine, 5,96 g/L de HEPES, 2,2 g/L de bicarbonate de sodium et 7 mL/L de NaOH. Conservez le milieu de culture inutilisé au réfrigérateur jusqu’à 7 jours.
3. Remplacez le milieu de culture tous les 1 à 2 jours. Réchauffez le milieu de culture pendant une heure à 37 °C avant de l’utiliser. À l’aide d’une pipette Pasteur stérile raccordée à l’aspiration, aspirez le milieu d’une chambre de culture individuelle et remplissez-le immédiatement avec le milieu supplémenté.
4. Cultivez le cristallin pendant 48 h après la dissection pour laisser le temps aux dommages physiques de se manifester. Inspectez et scannez les lentilles pour en vérifier la qualité optique conformément à la section 4 avant de les inclure dans une expérience.
   REMARQUE : Les lentilles sont orientées face vers le bas en préparation du test par scanner laser.

2. Procédure de contrôle

1. Préparez une solution avec la concentration souhaitée d’un agent solubilisant compatible avec le composé chimique et le milieu de culture.
2. Préparez une solution de contrôle du véhicule en ajoutant l’agent solubilisant au milieu supplémenté. Réchauffez la solution de contrôle pendant une heure à 37 °C avant l’expérimentation.
3. À l’aide d’une pipette Pasteur reliée à l’aspiration, aspirer le milieu de culture à partir des chambres des lentilles de contrôle. Remplissez les chambres avec la solution de contrôle. Si nécessaire, effectuez cette étape avec des échantillons en trois exemplaires.
   REMARQUE : Un volume minimum de 7 ml est nécessaire pour couvrir complètement la lentille en position antérieure face vers le haut. Les conditions pour les témoins dans la présente étude étaient de 21 mL de milieu témoin non traité, de 21 mL d’un milieu témoin de véhicule et de 7 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
4. Cultivez les lentilles dans le milieu témoin pendant 2 jours, puis remplacez-les par un nouveau milieu témoin conformément à la section 1. Pour les expositions à court terme, aspirer la solution de contrôle des chambres et effectuer un rinçage au moins trois fois avec un milieu de culture non supplémenté avant de reprendre le protocole de culture du cristallin tel que décrit à la section 1.0.
5. Laisser les lentilles s’acclimater dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant au moins 3,5 h avant l’évaluation de la qualité optique.

3. Procédure d’exposition

1. Préparez une solution avec la concentration souhaitée d’un agent solubilisant compatible avec le composé chimique et le milieu de culture. Combinez le produit chimique avec l’agent solubilisant, en laissant le temps approprié pour l’interaction si nécessaire.
   REMARQUE : La 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrine a été utilisée dans l’étude actuelle pour améliorer la solubilité du lanostérol (0,033 g/L) dans le milieu. Une solution de chlorure de benzalkonium (BAK 0,0075 %) a été préparée à l’aide de PBS.
2. Incorporer le produit chimique solubilisé dans le milieu de culture. Préparez un volume total suffisant pour fournir 21 ml de support à tous les échantillons de lentilles. Réchauffez le milieu expérimental pendant une heure à 37 °C avant l’expérimentation.
3. À l’aide d’une pipette Pasteur reliée à l’aspiration, aspirer le milieu de culture des chambres de la lentille. Remplissez immédiatement les chambres avec la solution d’essai. Après l’intervalle d’exposition, remplacer par un milieu de culture supplémenté, en effectuant d’abord un rinçage si nécessaire. Si nécessaire, effectuez cette étape avec des échantillons en trois exemplaires.
   REMARQUE : Dans la présente étude, les conditions d’essai étaient de 21 mL de milieu supplémenté en lanostérol et de 7 mL d’une solution de BAK à 0,0075 %. Un volume minimum de 7 ml est nécessaire pour couvrir complètement la lentille. Dans ce cas, les verres doivent d’abord être orientés vers l’avant, face vers le haut. Une pipette Pasteur peut être utilisée pour créer un courant dans la chambre de culture avec une partie du milieu de culture environnant pour repositionner la lentille.
4. Remettez les lentilles dans l’incubateur pendant au moins 3,5 h pour qu’elles s’acclimatent avant l’évaluation de la qualité optique.
   REMARQUE : Les lentilles sont orientées face vers le bas en préparation du test par scanner laser.

4. Dosage de la qualité optique (scanner laser à lentille)

1. Assurez-vous que les lentilles sont orientées avec l’avant vers le bas et visuellement au niveau dans la chambre de culture, en utilisant la technique de l’étape 3.3 pour ajuster la position de la lentille si nécessaire.
   REMARQUE : Cette position garantit que le faisceau incident sera réfléchi vers le haut à travers le fond de la chambre et passera à travers la lentille de la surface antérieure à la surface postérieure.
2. Positionnez une chambre de culture de lentille dans le scanner laser de manière à ce que la goupille du chariot de la chambre s’insère dans la fente de la base de la chambre.
3. Sélectionnez l’objectif et le point de balayage pour lesquels effectuer un balayage, cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’objectif de balayage et attendez que le scanner vous invite à trouver le faisceau et à l’aligner. Sélectionnez des points de départ et d’arrivée bien éloignés pour le faisceau derrière l’objectif. Assurez-vous que le faisceau central est aligné à l’aide des boutons de réglage brut et fin du logiciel du scanner et du bouton de réglage du scanner. Lorsque la poutre est alignée, cliquez sur calibrer et saisissez une sélection appropriée de pas radiaux et de séparation de poutre.
   REMARQUE : Pour cette étude utilisant la lentille bovine, les réglages des pas radiaux et de la séparation du faisceau ont été réglés à 10 pas et 0,5 mm, respectivement. Le premier balayage effectué par le scanner sert à calibrer le scanner laser. Ceci est nécessaire une seule fois, et tous les balayages supplémentaires de l’objectif peuvent être effectués directement après l’alignement.
4. Une fois le scanner calibré, cliquez sur scan. Attendez que des valeurs soient générées pour la moyenne BVD, l’écart-type et l’erreur le long d’un axe après la fin du balayage de l’objectif, et que la portée du faisceau ait été définie. Réglez la lunette à partir de laquelle les faisceaux sortent de la lentille jusqu’au point final souhaité, en sélectionnant la distance maximale derrière la lentille tout en excluant toute interférence apparente.
5. Utilisez le graphique généré pour afficher les distances individuelles des sommets arrière de chaque poutre.
   REMARQUE : Exclure les faisceaux passant à travers les sutures du cristallin. Pour exclure une ligature, utilisez la légende à l’écran pour cliquer avec le bouton droit de la souris sur une poutre individuelle et sélectionner Exclure.
6. Faites pivoter manuellement la position de la base de la chambre de culture à l’intérieur du scanner de 90°, de sorte que le deuxième balayage le long de la surface antérieure de la lentille soit perpendiculaire au balayage précédent. Assurez-vous que le faisceau central est aligné comme indiqué à l’étape 4.3, puis balayez l’objectif.

5. Dosage de l’activité métabolique (résazurine)

1. Préparez un milieu sans FBS. Réchauffez le milieu pendant une heure à 37 °C. Préparer 50 ml de réactif de résazurine à 8 % dans un milieu non supplémenté.
   REMARQUE : Il suffit de préparer 50 mL pour remplir tous les puits dans une plaque de 12 puits. La solution doit être préparée stérile dans des conditions sombres dans un récipient opaque, car la résazurine est sensible à la lumière.
2. Ajouter 3,8 ml de solution de résazurine à 8 % dans chaque puits à l’intérieur d’une plaque stérile à 12 puits à fond transparent pour couvrir le cristallin.
3. À l’aide de cuillères métalliques stériles, soulevez soigneusement les lentilles sous la surface postérieure et rincez-les à l’aide d’une pipette Pasteur pour laver la lentille avec un petit volume de milieu de culture non supplémenté. Placez les lentilles individuellement dans chaque puits.
4. Incuber la plaque du puits à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 5 h. Après l’incubation, retirez les lentilles avec des pelles métalliques des puits et placez-les dans un conteneur d’élimination des déchets animaux. Transvaser un échantillon de 100 μL de chaque puits dans une plaque stérile, à fond transparent et à 96 puits.
   REMARQUE : Les lentilles peuvent être évaluées plusieurs fois avec le test d’activité métabolique. Dans ce cas, retournez les lentilles dans les chambres de culture avec un milieu frais pour l’incubation. Il est préférable d’effectuer le test d’activité métabolique une fois que tous les examens sont terminés, car le colorant peut affecter les mesures de BVD.
5. Mesurez la fluorescence finale des échantillons de 100 μL à l’aide d’un lecteur de plaques fluorescentes, avec les longueurs d’onde d’excitation et d’émission réglées à 560 nm et 590 nm, respectivement.

6. Analyse des données

1. Pour le test de qualité optique, calculez la moyenne des valeurs calculées par logiciel pour l’erreur^{BVD 24} à partir des deux balayages effectués à chaque point temporel. Effectuez ce calcul pour tous les objectifs et tous les points de balayage.
2. Pour le test d’activité métabolique, recueillir les valeurs de fluorescence relatives du point final générées par le lecteur de plaques. Normalisez les données en fixant la moyenne de toutes les valeurs de contrôle à un point de balayage sur 100 %. Calculez l’activité de chaque objectif en pourcentage de la valeur de contrôle moyenne pour ce point de balayage.
3. Effectuez un test de normalité pour tous les groupes de tests. En supposant que les données sont normales, analysez les différences d’erreur BVD entre les lentilles de contrôle et expérimentales à l’aide de l’ANOVA à deux facteurs. De plus, effectuez le test de comparaisons multiples post-hoc de Tukey. Effectuez une ANOVA à sens unique et un test post-hoc de Dunnett pour les données d’activité métabolique.

Résultats

Les figures 2 et 3 (n = 6) présentent les résultats d’une étude testant l’effet d’un traitement chimique (lanostérol) sur le cristallin bovin. Le lanostérol est un stérol naturellement présent dans le cristallin qui a déjà montré des résultats prometteurs en tant qu’intervention pharmaceutique potentielle pour la cataracte²⁵, bien que cela n’ait pas encore été prouvé

Discussion

L’objectif de ce protocole est d’évaluer directement les effets des expositions chimiques ou environnementales sur le cristallin dans la culture de tissus primaires. Tout d’abord, les objectifs sont disséqués et scannés pour en vérifier la qualité optique. La prévention de la contamination et la qualité de la dissection sont essentielles. Les lentilles sont balayées à intervalles réguliers pour surveiller en permanence les changements de la fonction de réfraction par ra...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
(2-Hydroxypropyl)-β-cyclodextrin	Sigma-Aldrich	H107	Powder
1 L bottle-top filtration system	VWR	97066-204	Full Assembly, bottle-top, 0.2 μm
100 mm Petri dish	VWR	89022-320	Slippable, media saver style, sterile
12 well-plate	Corning	353043	Sterile, clear-bottom
35 mm petri dish	VWR	25373-041	Falcon disposable petri dishes, sterile, Corning
96 well-plate	VWR	29442-072	Sterile, clear-bottom
Alamar blue (resazurin)	Fischer Scientific	DAL1100	Molecular Probes cell viability reagent
Benzalkonium chloride solution	Sigma-Aldrich	63249	50% in H20
Biosafety cabinet
Cytation 5 plate reader	BioTek	CYT5MPV	Cell imaging multi-mode reader
Fetal bovine serum	ThermoFischer Scientific	12484028	Qualified, heat inactivated, Canada
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	For cell culture, powder
Incubator
Lanosterol	Sigma-Aldrich	L5768	≥93%, powder
L-glutamine	Sigma-Aldrich		For cell culture, powder
Medium (M-199)	Sigma-Aldrich	M3769	Modified, with Earle′s salts, without L-glutamine, sodium bicarbonate, and phenol red, powder, suitable for cell culture
Pasteur pipettes			5 3/4'', with and without cotton
Penicillin-Streptomycin	ThermoFischer Scientific	15140122	Liquid (10,000 U/mL)
Phospate buffer saline (PBS)			liquid, sterile, suitable for cell culture
Pipette tips (100 µL, 1,000 µL, 5,000 µL)	VWR		Sterile
ScanTox (lens laser-scanner)	Specially developed in-house	N/A	Scans lens with a laser to determine lens optical quality
ScanTox culture chamber	Specially developed in-house	N/A	Holds bovine lens in place during testing and culturing
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	For cell culture, powder
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S2770	1.0 N, BioReagent, suitable for cell culture