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Resumen

El presente protocolo describe la canulación aórtica y la perfusión retrógrada del corazón murino neonatal ex vivo . Una estrategia de dos personas, utilizando un microscopio de disección y una aguja de calibre pequeño embotada, permite una canulación confiable. La cuantificación de la tensión contráctil longitudinal se logra utilizando un transductor de fuerza conectado al ápice del ventrículo izquierdo.

Resumen

El uso del corazón perfundido retrógrado ex vivo ha sido durante mucho tiempo una piedra angular de la investigación de la isquemia-reperfusión desde su desarrollo por Oskar Langendorff hace más de un siglo. Aunque esta técnica se ha aplicado a ratones en los últimos 25 años, su uso en esta especie se ha limitado a animales adultos. El desarrollo de un método exitoso para cannular consistentemente la aorta murina neonatal permitiría el estudio sistemático del corazón perfundido retrógrado aislado durante un período crítico de desarrollo cardíaco en una especie genéticamente modificable y de bajo costo. La modificación de la preparación de Langendorff permite la canulación y el establecimiento de la reperfusión en el corazón murino neonatal al tiempo que minimiza el tiempo isquémico. La optimización requiere una técnica de dos personas para permitir la canulación exitosa de la aorta de ratón recién nacido utilizando un microscopio de disección y una aguja modificada disponible comercialmente. El uso de este enfoque establecerá de manera confiable la perfusión retrógrada en 3 minutos. Debido a que la fragilidad del corazón del ratón neonatal y el tamaño de la cavidad ventricular impiden la medición directa de la presión intraventricular generada con un balón, es necesario el uso de un transductor de fuerza conectado por una sutura al ápice del ventrículo izquierdo para cuantificar la tensión contráctil longitudinal. Este método permite a los investigadores establecer con éxito una preparación aislada del corazón murino del recién nacido perfundido por flujo constante, lo que permite el estudio de la biología cardíaca del desarrollo de manera ex vivo . Es importante destacar que este modelo será una herramienta poderosa para investigar las respuestas fisiológicas y farmacológicas a la isquemia-reperfusión en el corazón neonatal.

Introducción

Las preparaciones cardíacas ex-vivo han sido un elemento básico de los estudios fisiológicos, fisiopatológicos y farmacológicos durante más de un siglo. A partir del trabajo de Elias Cyon en la década de 1860, Oskar Langendorff adaptó el modelo de rana aislada para la perfusión retrógrada, presurizando la raíz aórtica para proporcionar flujo coronario con un perfusato oxigenado1. Usando su adaptación, Langendorff pudo demostrar una correlación entre la circulación coronaria y la función mecánica2. El corazón perfundido retrógrado ex vivo, más tarde apodado epónimo la técnica de Langendorff, ha seguido siendo una piedra angular de la investigación fisiológica, aprovechando su simplicidad para estudiar poderosamente el corazón aislado en ausencia de posibles factores de confusión. La preparación de Langendorff se ha modificado aún más para permitir que el corazón se expulse (el llamado "corazón que funciona") y permitir que el perfusato recircule3. Sin embargo, los criterios de valoración fisiológicos primarios de interés se han mantenido sin cambios. Tales criterios de valoración incluyen medidas de la función contráctil, la conducción eléctrica, el metabolismo cardíaco y la resistencia coronaria4.

Para evaluar la función cardíaca en su preparación original de corazón de rana, Langendorff midió la tensión generada por la contracción ventricular en el eje longitudinal utilizando una sutura conectada entre el ápice del corazón y un transductor de fuerza. 5 La contracción isométrica se cuantificó de esta manera con tensión basal aplicada al corazón en ausencia de llenado ventricular. El refinamiento del abordaje ha llevado a balones llenos de líquido colocados en el ventrículo izquierdo a través de la aurícula izquierda para evaluar el rendimiento miocárdico durante la contracción isovolumétrica6. Para evaluar el ritmo cardíaco y la frecuencia cardíaca, se pueden colocar cables superficiales en los polos del corazón para permitir a los investigadores registrar el electrocardiograma. Sin embargo, se puede esperar bradicardia relativa, dada la denervación obligatoria. La estimulación extrínseca puede servir para superar esto y eliminar la variabilidad de la frecuencia cardíaca entre experimentos1. Otra medida de resultado, el metabolismo miocárdico, se puede evaluar midiendo el contenido de oxígeno y sustrato metabólico en el perfusato coronario y el efluente y calculando la diferencia entre ellos7. La cuantificación de lactato en el efluente coronario puede ayudar a caracterizar los períodos de metabolismo anaeróbico, como se observa con la hipoxia, la hipoperfusión, la isquemia-reperfusión o las perturbaciones metabólicas7.

El trabajo original de Langendorff permitió el estudio del corazón de mamífero ex vivo, utilizando gatos como tema principal5. La evaluación del corazón de rata aislado ganó popularidad a mediados de la década de 1900 con Howard Morgan, quien detalló el modelo de rata de "corazón de trabajo" en 19675. El uso de ratones comenzó hace solo 25 años debido a la complejidad técnica, la fragilidad del tejido y el tamaño relativamente pequeño del corazón murino. A pesar de los desafíos asociados con el estudio con ratones, los menores costos y la facilidad de la manipulación genética han aumentado el atractivo y la demanda de tales preparaciones murinas ex-vivo. Desafortunadamente, la aplicación de la técnica se ha limitado a animales adultos, siendo ratones juveniles de 4 semanas de edad los sujetos más jóvenes utilizados para el estudio ex vivo hasta hace muypoco 8,9. Si bien los ratones juveniles son "relativamente inmaduros" en comparación con los adultos, su utilidad como sujetos para los estudios de biología del desarrollo es limitada porque, en general, se han destetado de su presa de nacimiento y pronto comenzarán la pubertad10. La adolescencia ocurre mucho más allá de la transición postnatal en la utilización del sustrato miocárdico de glucosa y lactato a ácidos grasos11. Por lo tanto, la mayor parte de la información sobre los cambios metabólicos en el corazón neonatal ha resultado históricamente del trabajo ex vivo en especies más grandes como conejos y conejillos de indias11.

De hecho, existen enfoques alternativos a la preparación de Langendorff. Estos incluyen la experimentación in vitro, que carece de datos funcionales y contexto de todo el órgano, o estudios in vivo. Esto puede ser técnicamente desafiante y complicado al confundir variables como los efectos cardiovasculares y respiratorios de un agente anestésico requerido, la influencia de la entrada neurohumoral, las consecuencias de la temperatura central, el estado nutricional del animal y la disponibilidad de sustrato12,13. Debido a que el enfoque de Langendorff permite el estudio del corazón perfundido aislado de una manera ex-vivo de una manera más controlada en ausencia de tales factores de confusión, ha sido y sigue siendo considerado una poderosa herramienta de investigación. Por lo tanto, la técnica presentada aquí ofrece a los investigadores un enfoque experimental para el estudio ex vivo del corazón murino recién nacido y limita el tiempo de reperfusión.

Investigar el corazón durante los períodos de desarrollo es una consideración importante dadas las amplias transiciones bioquímicas, fisiológicas y anatómicas que ocurren durante la maduración del miocardio. Los cambios del metabolismo anaeróbico a la fosforilación oxidativa, los cambios en la utilización del sustrato y la progresión de la proliferación celular a la hipertrofia son procesos dinámicos que ocurren de manera única en el corazón inmaduro11,14. Otro aspecto crítico del corazón en desarrollo es que los factores estresantes que se encuentran durante los períodos necesarios pueden producir respuestas aumentadas en el corazón del recién nacido y alterar la susceptibilidad futura a los insultos en la edad adulta15. Aunque trabajos anteriores han utilizado ratas, corderos y conejos recién nacidos para estudiar el corazón neonatal perfundido por Langendorff, los avances que permiten el uso de ratones son necesarios dada la importancia de esta especie para la investigación de la biología del desarrollo16. Para abordar esta necesidad, recientemente se estableció el primer modelo de corazón neonatal murino perfundido por Langendorff utilizando animales de 10 díasde edad 6. Aquí se presenta un método para permitir la canulación aórtica exitosa y establecer la perfusión retrógrada del corazón murino recién nacido aislado. Este enfoque se puede utilizar para estudios de farmacología, isquemia-reperfusión o metabolismo centrados en la función de todo el órgano o se puede adaptar para el aislamiento de cardiomiocitos.

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Protocolo

Se obtuvieron las aprobaciones del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico de la Universidad de Columbia para todos los métodos descritos. Para el estudio se utilizaron ratones machos de tipo salvaje C57Bl / 6 postnatal del día 10.

1. Preparación del aparato de Langendorff

  1. Para minimizar la complejidad, utilice perfusato oxigenado no recirculante dentro del aparato de Langendorff (consulte la Tabla de materiales) a través de flujo constante o presión constante.
    1. Utilice el tampón Krebs-Henseleit (KHB), que contiene 120 mmol/L de NaCl, 4,7 mmol/L de KCl, 1,2 mmol/L de MgSO4, 1,2 mmol/L de KH2PO4, 1,25 mmol/L de CaCl2, 25 mmol/L de NaHCO3 y 11 mmol/L de glucosa a pH 7,4 (véase la Tabla de Materiales), equilibre con el 95% de O2 y el 5% de CO2 dentro del aparato de Langendorff y manténgalo a 37 °C.
  2. Para el enfoque de flujo constante, mantenga un caudal continuo a ~2.5 mL∙min-1.
    NOTA: Este caudal se aproximará al flujo coronario de ~75-80 mL/g∙min, dado que el peso promedio de un corazón de ratón de 10 días de edad (P10) es de ~30 mg17,18.

2. Fabricación de cánula aórtica

  1. Fabrique la cánula aórtica de ratón recién nacido a partir de una aguja de acero inoxidable de 26 G (consulte la Tabla de materiales). Usando tijeras afiladas, corte la punta de la aguja para embotar el extremo. Tenga cuidado de no engarzar o restringir el diámetro de la luz de la aguja. Alise el borde cortado y retire las fresas raspando suavemente el extremo embotado en la mesa de trabajo del laboratorio con un movimiento de ida y vuelta.
    NOTA: Se deben eliminar las fresas microscópicas y los bordes afilados porque pueden desgarrar la aorta del ratón recién nacido y dañar la válvula aórtica. Alternativamente, use papel de lija de grano fino.
  2. Conecte la cánula fabricada al aparato de Langendorff y evalúe el flujo y la resistencia. Mida los caudales a través de la cánula recolectando y midiendo la cantidad de amortiguación durante un período de tiempo conocido. Asegúrese de que el flujo real sea igual al caudal establecido de 2,5 ml min-1.
  3. Cuantifique el diferencial de presión a través de la cánula con KHB fluyendo siguiendo los pasos a continuación.
    1. Mida la presión en el sistema con y sin la cánula fabricada conectada.
    2. Divida el diferencial de presión a través de la cánula por el caudal para obtener resistencia a la cánula según la ley de Ohm15.
    3. Asegúrese de que la resistencia de la cánula fabricada comprenda ~ 16.0 ± 1.9 mmHg ∙min∙mL-1 de la resistencia total6. La resistencia excesiva sugiere una luz de cánula potencialmente comprometida.
      NOTA: Cálculo de la muestra: Pcon cánula - P sin cánula = ΔP. Si Pcon = 48 y Psin = 8 entonces ΔP = 40. A un caudal (Q) de 2,5 mL min-1 y ΔP de 40 cánulas la resistencia es igual a 16 mmHg∙min∙mL-1 usando R = ΔP/Q = 40 / 2,5 = 16.
  4. Retire la cánula de 26 G y conecte el tubo de alta presión (consulte la Tabla de materiales) al sitio de canulación en el aparato de Langendorff. Fije la cánula aórtica al extremo distal del tubo. Desairear el tubo y la cánula con tampón oxigenado, asegurando que se eliminen todas las burbujas.
    NOTA: El uso de tubos de alta presión de esta manera permite que la cánula se extienda a una posición más remota. Esto es necesario para permitir la canulación aórtica con un microscopio de disección adyacente a la configuración (Figura 1).

3. Sustracción de órganos

  1. Ratones anticoagulados mediante inyección intraperitoneal (IP) de heparina (10 kU/kg) (ver Tabla de Materiales) para prevenir la formación de microtrombis coronarios utilizando una aguja de 26 G en una jeringa de 1 ml. Espere varios minutos para que la heparina circule antes de proceder con la inyección de cualquier anestésico.
  2. Anestesiar al animal con una inyección IP utilizando una aguja de 26 G en una jeringa de 1 ml.
    NOTA: Es esencial controlar cuidadosamente al animal después de la inyección anestésica para evitar la apnea y la hipoxia posterior. El pentobarbital (70 mg/kg) es una opción fiable de anestésico, ya que permite la aparición rápida de la sedación sin inducir apnea 19,20. Se pueden utilizar otros agentes anestésicos, siempre que las dosis utilizadas no causen apnea21. Los investigadores deben considerar los efectos de los sedantes-hipnóticos alternativos sobre la función cardíaca22,23. La dislocación cervical como modo primario de eutanasia puede prolongar la hipoxia y la isquemia previas a la canulación.
  3. Coloque el ratón en posición supina y asegure las extremidades inmediatamente después de la pérdida del conocimiento. Use agujas hipodérmicas de calibre pequeño para asegurar cada extremidad. Comience a cosechar tan pronto como el animal no responda al pellizco del dedo del pie; el animal debe respirar espontáneamente durante la disección inicial.
  4. Haga una incisión subxifoidea transversal a través del ancho del animal para exponer la cavidad abdominal usando tijeras de disección rectas (ver Tabla de Materiales).
    NOTA: La técnica estéril no es necesaria dado que el procedimiento representa una cirugía no sobreviviente.
    1. Identifique el diafragma superiormente e incite la porción anterior por completo. Corte la caja torácica bilateralmente a lo largo de la línea axilar media en dirección cefálica. Pídale a un asistente que agarre el proceso xifoideo con fórceps y refleje el esternón y las costillas cranealmente para exponer los órganos torácicos.
  5. Identificar la vena cava inferior infradiafragmática (CIV) por encima del hígado. Transecte el IVC con una tijera de iris curva mientras mantiene una ligera tensión anterior y cefálica en el segmento proximal con pinzas de iris (ver Tabla de Materiales).
    1. Corte posteriormente a lo largo de la superficie anterior de la columna vertebral con tijeras de iris curvadas mientras tira de la IVC hacia arriba y fuera de la cavidad torácica. A medida que el corazón se moviliza, incline las tijeras hacia arriba y corte los grandes vasos de manera superior para eliminar completamente el corazón y los pulmones.
      NOTA: Este método permite la explantación rápida del corazón y los pulmones en bloque.
  6. Sumerja inmediatamente la muestra en KHB o solución salina helada. El corazón debe dejar de latir en cuestión de segundos.

4. Canulación

  1. Corte un trozo de toalla de papel y colóquelo en el fondo de una placa de Petri poco profunda para proporcionar fricción para estabilizar el corazón durante la canulación. Humedezca con KHB helado para evitar que el corazón se adhiera a él.
    1. Coloque la placa de Petri preparada bajo el microscopio de disección y ajuste el foco. Coloque la cánula aórtica unida al tubo de extensión de alta presión bajo el microscopio de disección junto con una sutura de seda 5-0 atada libremente alrededor de su cubo (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: Se debe tener cuidado de limitar la cantidad de líquido en la placa de Petri porque los pulmones llenos de aire pueden flotar y hacer que los órganos extirpados se muevan.
  2. Coloque los órganos torácicos extirpados en la placa de Petri. Bajo el microscopio, identifique el timo por su brillo blanco y dos lóbulos y oriente el espécimen de tal manera que el timo sea anterior y superior24. Esto asegurará la orientación adecuada del corazón.
  3. Usando fórceps, separe sin rodeos los lóbulos del timo para exponer los grandes vasos. Identifique la aorta localizando las características ramificadas distintivas del arco aórtico.
    NOTA: Un tono púrpura oscuro a menudo demarca el ventrículo derecho y la arteria pulmonar. La aorta ascendente se encuentra entre la arteria pulmonar principal y la aurícula derecha.
  4. Transecte la aorta con tijeras finas y afiladas (ver Tabla de Materiales) justo proximal al despegue de la arteria subclavia.
    NOTA: Si la aorta se transecta demasiado cerca de la válvula aórtica, no habrá suficiente tejido aórtico para permitir que la cánula se asegure. Alternativamente, si la aorta se transecta demasiado alto, el perfusato puede filtrarse de una o más ramas aórticas (como la arteria subclavia).
  5. Agarre suavemente la aorta transectada con pinzas curvas finas de estilo joyero (consulte la Tabla de materiales). Cannulate cuidadosamente la aorta con una aguja roma de 26 G, teniendo cuidado de no dañar la válvula aórtica. Manténgase en su lugar agarrando la aorta con las finas pinzas curvas alrededor de la cánula. Una vez establecido el control de la aorta, iniciar la perfusión retrógrada para limitar el tiempo isquémico.
    NOTA: El corazón debe comenzar a latir y se pálida a medida que la sangre se drena del miocardio y KHB perfunde las arterias coronarias. La falta de latidos espontáneos, la presencia de congestión ventricular o la falta de cambio de color del corazón indican una cánula mal posicionada.
  6. Pídale al asistente que agarre los extremos de la sutura poco atada y que enganche cuidadosamente la aorta alrededor de la cánula. Cinch la sutura por encima o por debajo de los fórceps finos curvos (manteniendo la cánula en su lugar), dependiendo de la cantidad de tejido aórtico y las consideraciones anatómicas. Apriete la sutura y confirme la adecuación del flujo coronario.
  7. Desconecte el tubo de alta presión del aparato de Langendorff. Agarre el cubo de la cánula y desconecte la aguja roma del tubo de extensión de alta presión. Conecte rápidamente el cubo de la cánula al aparato.
    NOTA: Se debe tener cuidado de no desalojar el corazón o arrastrar aire hacia la cánula.
  8. Una vez que el corazón esté colgado en el aparato de Langendorff en la posición habitual, y se confirme la perfusión adecuada, recorte cuidadosamente el pulmón, el timo y el exceso de tejido. Incise la aurícula derecha para permitir que el efluente del seno coronario gotee libremente.

5. Medición funcional

  1. Haga un pequeño nudo al final de una sutura de seda 5-0 (unida a una aguja curva). Perfore un pequeño trozo de película de parafina (2-3 mm x 2-3 mm) con la aguja y deslice la parafina hasta el extremo anudado. Pase cuidadosamente la aguja a través del ápice del ventrículo y tire de la sutura a través del corazón hasta que la película de parafina se ajuste contra la pared lateral del ventrículo.
    NOTA: La película de parafina ayuda a evitar que el nudo desgarre el corazón y tire a través del ventrículo.
  2. Pase la aguja a través de la abertura de la camisa de calentamiento llena de agua del aparato de Langendorff. El corazón ahora puede ser encerrado y calentado.
  3. Conecte la aguja al transductor de fuerza (consulte la Tabla de materiales) de tal manera que evite el goteo del seno coronario. Ajuste la sutura para aplicar 1-2 g de tensión basal, según lo indicado por la tensión diastólica o nadir en el rastreo de tensión.
    NOTA: Evite arrancar el corazón de la cánula o torcer la aorta, comprometiendo así la perfusión coronaria.
  4. Coloque electrodos de superficie en los polos superior e inferior del corazón para registrar el electrocardiograma.
    NOTA: Use alambre de estimulación epicárdica temporal pediátrico con la aguja extraída para electrodo de superficie flexible conectado a Bio Amp (consulte la Tabla de materiales).
  5. Muestree el efluente del seno coronario para su análisis utilizando un catéter 24 G IV (ver Tabla de Materiales).
  6. Reste la resistencia de la cánula de la resistencia total del sistema para obtener resistencia coronaria según la ley25 de Kirchhoff.

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Resultados

Se utilizaron ratones P10 para modelar un punto de tiempo en la infancia humana26,27. Quince corazones de ratón recién nacidos C57Bl/6 aislados fueron cosechados y canulados con éxito. Los corazones fueron perfundidos con un flujo continuo de 2.5 mL min-1 de KHB oxigenado calentado. Se midieron los parámetros metabólicos, incluida la extracción de glucosa, el consumo de oxígeno, la producción de lactato y los parámetros fisiológicos como la f...

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Discusión

El presente trabajo describe la canulación aórtica exitosa y la perfusión retrógrada en el corazón aislado de ratón recién nacido. Es importante destacar que permite a los investigadores superar las barreras que la edad murina joven y el pequeño tamaño del corazón presentaban anteriormente8. Si bien no es complejo en diseño, el enfoque requiere un grado significativo de habilidad técnica. Los pasos clave que inevitablemente desafiarán incluso a los investigadores más competentes téc...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

NIH/NINDS R01NS112706 (R.L.)

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Rodent Langendorff ApparatusRadnoti130102EZ
24 G catheterBD381511
26 G needle on 1 mL syringe comboBD309597
26 G steel needleBD305111
5-0 Silk SutureEthiconS1173
Bio AmpADInstrumentsFE135
Bio CableADInstrumentsMLA1515
CaCl2Sigma-AldrichC4901-100G
Circulating heating water BathHaakeDC10
curved iris scissorMedlineMDS10033Z
dissecting microscopeNikonSMZ-2B
find spring scissorsKentINS600127
Force TransducerADInstrumentsMLT1030/D
glucoseSigma-AldrichG8270-100G
HeparinSagent400-01
High pressure tubingEdwards Lifesciences50P184
iris dressing forcepsKentINS650915-4
Jeweler-style curved fine forcepsMiltex17-307-MLTX
KClSigma-AldrichP3911-25G
KH2PO4Sigma-AldrichP0662-25G
MgSO4Sigma-AldrichM7506-500G
NaClSigma-AldrichS9888-25G
NaHCO3Sigma-AldrichS6014-25G
Roller PumpGilsonMinipuls 3
straight dissecting scissorsKentINS600393-G
Temporary cardiac pacing wireEthiconTPW30
Wide Range Force TransducerADInstrumentsMLT1030/A

Referencias

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