Tecnica modificata per l'uso di cuori murini neonatali nella preparazione di Langendorff

Riepilogo

Il presente protocollo descrive la cannulazione aortica e la perfusione retrograda del cuore murino neonatale ex-vivo . Una strategia per due persone, utilizzando un microscopio di dissezione e un ago smussato di piccolo calibro, consente una cannulazione affidabile. La quantificazione della tensione contrattile longitudinale si ottiene utilizzando un trasduttore di forza collegato all'apice del ventricolo sinistro.

Abstract

L'uso del cuore perfuso retrogrado ex-vivo è stato a lungo una pietra miliare dell'indagine sull'ischemia-riperfusione sin dal suo sviluppo da parte di Oskar Langendorff oltre un secolo fa. Sebbene questa tecnica sia stata applicata ai topi negli ultimi 25 anni, il suo uso in questa specie è stato limitato agli animali adulti. Lo sviluppo di un metodo di successo per cannulare costantemente l'aorta murina neonatale consentirebbe lo studio sistematico del cuore perfuso retrogrado isolato durante un periodo critico di sviluppo cardiaco in una specie geneticamente modificabile e a basso costo. La modifica della preparazione di Langendorff consente la cannulazione e l'instaurazione della riperfusione nel cuore murino neonatale riducendo al minimo il tempo ischemico. L'ottimizzazione richiede una tecnica a due persone per consentire il successo della cannulazione dell'aorta del topo appena nato utilizzando un microscopio di dissezione e un ago modificato disponibile in commercio. L'uso di questo approccio stabilirà in modo affidabile la perfusione retrograda entro 3 minuti. Poiché la fragilità del cuore del topo neonatale e delle dimensioni della cavità ventricolare impedisce la misurazione diretta della pressione intraventricolare generata utilizzando un palloncino, è necessario l'uso di un trasduttore di forza collegato da una sutura all'apice del ventricolo sinistro per quantificare la tensione contrattile longitudinale. Questo metodo consente ai ricercatori di stabilire con successo una preparazione isolata di cuore murino neonato retrogrado perfuso a flusso costante, consentendo lo studio della biologia cardiaca dello sviluppo in modo ex-vivo . È importante sottolineare che questo modello sarà un potente strumento per studiare le risposte fisiologiche e farmacologiche all'ischemia-riperfusione nel cuore neonatale.

Introduzione

I preparati cardiaci ex-vivo sono stati un punto fermo degli studi fisiologici, fisiopatologici e farmacologici per oltre un secolo. Derivando dal lavoro di Elias Cyon nel 1860, Oskar Langendorff ha adattato il modello di rana isolata per la perfusione retrograda, pressurizzando la radice aortica per fornire il flusso coronarico con un perfusato ossigenato¹. Usando il suo adattamento, Langendorff è stato in grado di dimostrare una correlazione tra circolazione coronarica e funzione meccanica². Il cuore perfuso retrogrado ex-vivo, in seguito soprannominato la tecnica Langendorff, è rimasto una pietra miliare dell'indagine fisiologica, sfruttando la sua semplicità per studiare potentemente il cuore isolato in assenza di potenziali fattori confondenti. La preparazione di Langendorff è stata ulteriormente modificata per consentire al cuore di espellere (il cosiddetto "cuore di lavoro") e consentire al perfusato di ricircolare³. Tuttavia, gli endpoint fisiologici primari di interesse sono rimasti invariati. Tali endpoint includono misure della funzione contrattile, della conduzione elettrica, del metabolismo cardiaco e della resistenza coronarica⁴.

Per valutare la funzione cardiaca nella sua preparazione originale del cuore di rana, Langendorff ha misurato la tensione generata dalla contrazione ventricolare nell'asse longitudinale utilizzando una sutura collegata tra l'apice del cuore e un trasduttore di forza. ⁵ La contrazione isometrica è stata quantificata in questo modo con tensione basale applicata al cuore in assenza di riempimento ventricolare. Il perfezionamento dell'approccio ha portato a palloncini pieni di liquido posizionati nel ventricolo sinistro attraverso l'atrio sinistro per valutare le prestazioni miocardiche durante la contrazione isovolumica⁶. Per valutare il ritmo cardiaco e la frequenza cardiaca, i cavi superficiali possono essere posizionati sui poli del cuore per consentire agli investigatori di registrare l'elettrocardiogramma. Tuttavia, ci si può aspettare una bradicardia relativa, data la denervazione obbligatoria. La stimolazione estrinseca può servire a superare questo ed eliminare la variabilità della frequenza cardiaca tra gli esperimenti¹. Un'altra misura di esito, il metabolismo miocardico, può essere valutata misurando il contenuto di ossigeno e substrato metabolico nel perfusato coronarico e nell'effluente e calcolando la differenza tra loro⁷. La quantificazione del lattato nell'effluente coronarico può aiutare a caratterizzare i periodi di metabolismo anaerobico come si vede con ipossia, ipoperfusione, ischemia-riperfusione o perturbazioni metaboliche⁷.

Il lavoro originale di Langendorff ha permesso lo studio del cuore dei mammiferi ex-vivo, utilizzando i gatti come soggetto principale⁵. La valutazione del cuore di ratto isolato ha guadagnato popolarità a metà del 1900 con Howard Morgan, che ha dettagliato il modello di ratto "cuore funzionante" nel 1967⁵. L'uso dei topi è iniziato solo 25 anni fa a causa della complessità tecnica, della fragilità dei tessuti e delle dimensioni relativamente piccole del cuore murino. Nonostante le sfide associate allo studio sui topi, i costi inferiori e la facilità di manipolazione genetica hanno aumentato l'attrattiva e la domanda di tali preparati murini ex-vivo. Sfortunatamente, l'applicazione della tecnica è stata limitata agli animali adulti, con i topi giovani di 4 settimane che sono i soggetti più giovani utilizzati per lo studio ex-vivo fino a poco tempo fa ^8,9. Mentre i topi giovani sono "relativamente immaturi" rispetto agli adulti, la loro utilità come soggetti per gli studi di biologia dello sviluppo è limitata perché, in generale, hanno svezzato dalla loro diga di nascita e presto inizieranno la pubertà¹⁰. L'adolescenza si verifica ben oltre la transizione postnatale nell'utilizzo del substrato miocardico da glucosio e lattato agli acidi grassi¹¹. Pertanto, la maggior parte delle informazioni sui cambiamenti metabolici nel cuore neonatale è storicamente il risultato di un lavoro ex-vivo in specie più grandi come conigli e porcellini d'India¹¹.

In effetti, esistono approcci alternativi alla preparazione di Langendorff. Questi includono la sperimentazione in vitro, che manca dei dati funzionali e del contesto dell'intero organo, o studi in vivo. Questo può essere tecnicamente impegnativo e complicato confondendo variabili come gli effetti cardiovascolari e respiratori di un agente anestetico richiesto, l'influenza dell'input neuroumorale, le conseguenze della temperatura interna, lo stato nutrizionale dell'animale e la disponibilità del substrato^12,13. Poiché l'approccio di Langendorff consente lo studio del cuore isolato-perfuso in modo ex-vivo in modo più controllato in assenza di tali fattori confondenti, è stato e continua ad essere considerato un potente strumento sperimentale. Pertanto, la tecnica qui presentata offre ai ricercatori un approccio sperimentale per lo studio ex-vivo del cuore murino appena nato e limita il tempo alla riperfusione.

Studiare il cuore durante i periodi di sviluppo è una considerazione importante date le transizioni biochimiche, fisiologiche e anatomiche ad ampio raggio che si verificano durante la maturazione miocardica. I passaggi dal metabolismo anaerobico alla fosforilazione ossidativa, i cambiamenti nell'utilizzo del substrato e la progressione dalla proliferazione cellulare all'ipertrofia sono processi dinamici che si verificano in modo univoco nel cuore immaturo^11,14. Un altro aspetto critico del cuore in via di sviluppo è che i fattori di stress incontrati durante i periodi necessari possono produrre risposte intensificate nel cuore neonato e alterare la futura suscettibilità agli insulti in età adulta¹⁵. Sebbene il lavoro precedente abbia utilizzato ratti appena nati, agnelli e conigli per studiare il cuore neonatale perfuso di Langendorff, i progressi che consentono l'uso di topi sono necessari data l'importanza di questa specie per la ricerca sulla biologia dello sviluppo¹⁶. Per rispondere a questa esigenza, il primo modello murino di cuore neonato perfuso di Langendorff che utilizza animali di 10 giorni è stato recentemente istituito⁶. Qui viene presentato un metodo per consentire il successo della cannulazione aortica e stabilire la perfusione retrograda del cuore murino neonato isolato. Questo approccio può essere utilizzato per la farmacologia, l'ischemia-riperfusione o studi sul metabolismo incentrati sulla funzione dell'intero organo o può essere adattato per l'isolamento dei cardiomiociti.

Protocollo

Le approvazioni del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Columbia University Medical Center sono state ottenute per tutti i metodi descritti. Per lo studio sono stati utilizzati topi maschi wild-type C57Bl/6 maschi del giorno 10.

1. Preparazione dell'apparato langendorff

1. Per ridurre al minimo la complessità, utilizzare perfusato ossigenato non ricircolante all'interno dell'apparato Langendorff (vedere Tabella dei materiali) tramite flusso costante o pressione costante.
   1. Utilizzare il tampone Krebs-Henseleit (KHB), contenente 120 mmol/L di NaCl, 4,7 mmol/L di KCl, 1,2 mmol/L di MgSO₄, 1,2 mmol/L di KH₂PO₄, 1,25 mmol/L di CaCl₂, 25 mmol/L di NaHCO₃ e 11 mmol/L di glucosio a pH 7,4 (vedere Tabella dei materiali), equilibrare con il 95% di O_{2 e il} 5% di CO₂ all'interno dell'apparato Langendorff e mantenere a 37 °C.
2. Per l'approccio a flusso costante, mantenere una portata continua a ~ 2,5 ml ∙ ^min-1.
   NOTA: questa portata approssima il flusso coronarico di ~ 75-80 ml / g ∙ min, dato che il peso medio di un cuore di topo di 10 giorni (P10) è ~ 30 mg^17,18.

2. Fabbricazione di cannula aortica

1. Fabbricare la cannula aortica del topo appena nato da un ago in acciaio inossidabile da 26 G (vedi Tabella dei materiali). Usando forbici affilate, tagliare la punta dell'ago per smussare l'estremità. Fare attenzione a non crimpare o limitare il diametro del lume dell'ago. Lisciare il bordo tagliato e rimuovere eventuali frese raschiando delicatamente l'estremità smussata sul banco di laboratorio con un movimento avanti e indietro.
   NOTA: le frese microscopiche e gli spigoli vivi devono essere rimossi perché possono strappare l'aorta del topo appena nato e danneggiare la valvola aortica. In alternativa, utilizzare carta vetrata a grana fine.
2. Collegare la cannula fabbricata all'apparecchio Langendorff e valutare il flusso e la resistenza. Misurare le portate attraverso la cannula raccogliendo e misurando la quantità del tampone in un periodo di tempo noto. Assicurarsi che il flusso effettivo sia uguale alla portata impostata di 2,5 ml ^min-1.
3. Quantificare il differenziale di pressione attraverso la cannula con KHB che scorre seguendo i passaggi seguenti.
   1. Misurare la pressione nel sistema con e senza la cannula fabbricata collegata.
   2. Dividere il differenziale di pressione attraverso la cannula per la portata per ottenere la resistenza della cannula secondo la legge¹⁵ di Ohm.
   3. Assicurarsi che la resistenza della cannula fabbricata comprenda ~ 16,0 ± 1,9 mmHg∙min∙^mL-1 della resistenza totale⁶. L'eccessiva resistenza suggerisce un lume di cannula potenzialmente compromesso.
      NOTA: Calcolo del campione: P_{con cannula} - P _{senza cannula} = ΔP. Se P_con = 48 e P_senza = 8 allora ΔP = 40. A una portata (Q) di 2,5 mL ^min-1 e ΔP di 40 resistenza della cannula è pari a 16 mmHg∙min∙^mL-1 usando R = ΔP/Q = 40 / 2,5 = 16.
4. Rimuovere la cannula da 26 G e fissare il tubo ad alta pressione (vedi Tabella dei materiali) al sito di cannulazione sull'apparecchio Langendorff. Attaccare la cannula aortica all'estremità distale del tubo. De-arieggiare il tubo e la cannula con tampone ossigenato, assicurando che tutte le bolle vengano rimosse.
   NOTA: L'uso di tubi ad alta pressione in questo modo consente di estendere la cannula in una posizione più remota. Ciò è necessario per consentire la cannulazione aortica con un microscopio sezionante adiacente alla configurazione (Figura 1).

3. Prelievo di organi

1. Topi anticoagulanti tramite iniezione intraperitoneale (IP) di eparina (10 kU/kg) (vedere Tabella dei materiali) per prevenire la formazione di microtrombi coronarici utilizzando un ago da 26 G su una siringa da 1 mL. Lasciare circolare diversi minuti affinché l'eparina circoli prima di procedere con l'iniezione di qualsiasi anestetico.
2. Anestetizzare l'animale con un'iniezione IP utilizzando un ago da 26 G su una siringa da 1 mL.
   NOTA: È essenziale monitorare attentamente l'animale dopo l'iniezione di anestetico per evitare l'apnea e la successiva ipossia. Pentobarbital (70 mg/kg) è una scelta affidabile di anestetico, in quanto consente una rapida insorgenza di sedazione senza indurre apnea^19,20. Altri agenti anestetici possono essere utilizzati, a condizione che le dosi utilizzate non causino apnea²¹. I ricercatori devono considerare gli effetti dei sedativi-ipnotici alternativi sulla funzione cardiaca^22,23. La lussazione cervicale come modalità primaria di eutanasia può prolungare l'ipossia e l'ischemia pre-cannuolamento.
3. Posizionare il mouse in posizione supina e fissare gli arti immediatamente dopo la perdita di coscienza. Utilizzare aghi ipodermici di piccolo calibro per fissare ogni arto. Inizia la raccolta non appena l'animale non risponde al pizzico; l'animale dovrebbe respirare spontaneamente durante la dissezione iniziale.
4. Fai un'incisione subxifoide trasversale attraverso la larghezza dell'animale per esporre la cavità addominale usando forbici da dissezione diritte (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: La tecnica sterile non è necessaria dato che la procedura rappresenta un intervento chirurgico non sopravvissuto.
   1. Identificare il diaframma in modo superiore e incidere completamente la porzione anteriore. Tagliare la cassa toracica bilateralmente lungo la linea ascellare media in direzione cefalade. Chiedi a un assistente di afferrare il processo xifoide con una pinza e di riflettere cranicamente lo sterno e le costole per esporre gli organi toracici.
5. Identificare la vena cava inferiore infra-diaframmatica (IVC) sopra il fegato. Transettare l'IVC con una forbice dell'iride curva mantenendo una leggera tensione anteriore e cefalade sul segmento prossimale con pinza dell'iride (vedi Tabella dei materiali).
   1. Tagliare posteriormente lungo la superficie anteriore della colonna vertebrale usando forbici dell'iride curve mentre si tira l'IVC su e fuori dalla cavità toracica. Mentre il cuore viene mobilitato, inclina le forbici anteriormente e taglia i grandi vasi in modo superiore per rimuovere completamente il cuore e i polmoni.
      NOTA: Questo metodo consente un rapido espianto del cuore e dei polmoni in blocco.
6. Immergere immediatamente il campione in KHB ghiacciato o soluzione salina. Il cuore dovrebbe smettere di battere in pochi secondi.

4. Cannulazione

1. Tagliare un pezzo di carta assorbente e posizionarlo sul fondo di una capsula di Petri poco profonda per fornire attrito per stabilizzare il cuore durante la cannulazione. Inumidire con KHB ghiacciato per impedire al cuore di aderire ad esso.
   1. Posizionare la capsula di Petri preparata sotto il microscopio di dissezione e regolare la messa a fuoco. Posizionare la cannula aortica attaccata al tubo di estensione ad alta pressione sotto il microscopio di dissezione insieme a una sutura di seta 5-0 liberamente legata attorno al suo mozzo (vedi Tabella dei materiali).
      NOTA: Bisogna fare attenzione a limitare la quantità di liquido nella capsula di Petri perché i polmoni pieni d'aria possono galleggiare e causare il movimento degli organi asportati.
2. Posizionare gli organi toracici asportati nella capsula di Petri. Al microscopio, identificare il timo dalla sua lucentezza bianca e due lobi e orientare il campione in modo tale che il timo sia anteriore e superiore²⁴. Ciò garantirà un corretto orientamento del cuore.
3. Usando una pinza, separa senza mezzi termini i lobi del timo per esporre i grandi vasi. Identificare l'aorta individuando le caratteristiche distintive di ramificazione dell'arco aortico.
   NOTA: Una tonalità viola scuro spesso delimita il ventricolo destro e l'arteria polmonare. L'aorta ascendente si trova tra l'arteria polmonare principale e l'atrio destro.
4. Trasmetti l'aorta con forbici affilate (vedi Tabella dei materiali) appena prossimale al decollo dell'arteria succlavia.
   NOTA: se l'aorta viene transettata troppo vicino alla valvola aortica, non ci sarà abbastanza tessuto aortico per consentire il fissaggio della cannula. In alternativa, se l'aorta viene transettata troppo in alto, il perfusato può fuoriuscire da uno o più rami aortici (come l'arteria succlavia).
5. Afferrare delicatamente l'aorta transettata usando una pinza curva fine in stile gioielliere (vedi Tabella dei materiali). Cannulare accuratamente l'aorta con un ago smussato da 26 G, facendo attenzione a non danneggiare la valvola aortica. Tenere in posizione afferrando l'aorta con la pinza curva fine attorno alla cannula. Una volta stabilito il controllo dell'aorta, avviare la perfusione retrograda per limitare il tempo ischemico.
   NOTA: Il cuore dovrebbe iniziare a battere e diventerà pallido quando il sangue viene drenato dal miocardio e KHB perfonde le arterie coronarie. Il mancato battito spontaneo, la presenza di ingorgo ventricolare o la mancanza di cambiamento di colore del cuore indicano una cannula mal posizionata.
6. Chiedi all'assistente di afferrare le estremità della sutura legata liberamente e di intrappolare con cura l'aorta attorno alla cannula. Stringere la sutura sopra o sotto la pinza fine curva (tenendo la cannula in posizione), a seconda della quantità di tessuto aortico e delle considerazioni anatomiche. Stringere la sutura e confermare l'adeguatezza del flusso coronarico.
7. Scollegare il tubo ad alta pressione dall'apparecchio Langendorff. Afferrare il mozzo della cannula e scollegare l'ago smussato dal tubo di estensione ad alta pressione. Collegare rapidamente il mozzo della cannula all'apparecchio.
   NOTA: Bisogna fare attenzione a non rimuovere il cuore o trascinare l'aria nella cannula.
8. Una volta che il cuore è appeso all'apparato di Langendorff nella posizione abituale e viene confermata un'adeguata perfusione, tagliare con cura il polmone, il timo e il tessuto in eccesso. Incidere l'atrio destro per consentire all'effluente del seno coronarico di gocciolare liberamente.

5. Misurazione funzionale

1. Fai un piccolo nodo alla fine di una sutura di seta 5-0 (attaccata a un ago curvo). Forare un piccolo pezzo di pellicola di paraffina (2-3 mm x 2-3 mm) con l'ago e far scorrere la paraffina fino all'estremità annodata. Passare con attenzione l'ago attraverso l'apice del ventricolo e tirare la sutura attraverso il cuore fino a quando il film di paraffina è aderente alla parete laterale del ventricolo.
   NOTA: Il film di paraffina aiuta a evitare che il nodo strappi il cuore e tiri attraverso il ventricolo.
2. Passare l'ago attraverso l'apertura della camicia riscaldante piena d'acqua dell'apparato Langendorff. Il cuore può ora essere racchiuso e riscaldato.
3. Attaccare l'ago al trasduttore di forza (vedi Tabella dei materiali) in modo tale da evitare la flebo del seno coronarico. Regolare la sutura per applicare 1-2 g di tensione basale, come indicato dalla tensione diastolica o nadir nel tracciamento della tensione.
   NOTA: Evitare di estrarre il cuore dalla cannula o torcere l'aorta, compromettendo così la perfusione coronarica.
4. Posizionare gli elettrodi di superficie sui poli superiore e inferiore del cuore per registrare l'elettrocardiogramma.
   NOTA: Utilizzare un filo di stimolazione epicardica temporaneo pediatrico con l'ago rimosso per l'elettrodo di superficie flessibile collegato a Bio Amp (vedere Tabella dei materiali).
5. Campionare l'effluente del seno coronarico per l'analisi utilizzando un catetere IV 24 G (vedere Tabella dei materiali).
6. Sottrarre la resistenza della cannula dalla resistenza totale del sistema per ottenere la resistenza coronarica secondo la legge di Kirchhoff²⁵.

Risultati

I topi P10 sono stati utilizzati per modellare un timepoint nell'infanzia umana^26,27. Quindici cuori di topo appena nati C57Bl/6 isolati sono stati raccolti e cannulati con successo. I cuori sono stati perfusi con un flusso continuo di 2,5 ml ^min-1 di KHB ossigenato riscaldato. Sono stati misurati i parametri metabolici, tra cui l'estrazione del glucosio, il consumo di ossigeno, la produzione di lattato e parametri fisiologici come la frequenza cardiac...

Discussione

Il presente lavoro descrive il successo della cannulazione aortica e della perfusione retrograda nel cuore isolato del topo appena nato. È importante sottolineare che consente ai ricercatori di superare le barriere che i giovani di età murina e le piccole dimensioni del cuore hanno precedentemente presentato⁸. Sebbene non sia complesso nella progettazione, l'approccio richiede un grado significativo di abilità tecnica. I passaggi chiave che inevitabilmente sfideranno anche i ricercatori tecnica...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rodent Langendorff Apparatus	Radnoti	130102EZ
24 G catheter	BD	381511
26 G needle on 1 mL syringe combo	BD	309597
26 G steel needle	BD	305111
5-0 Silk Suture	Ethicon	S1173
Bio Amp	ADInstruments	FE135
Bio Cable	ADInstruments	MLA1515
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901-100G
Circulating heating water Bath	Haake	DC10
curved iris scissor	Medline	MDS10033Z
dissecting microscope	Nikon	SMZ-2B
find spring scissors	Kent	INS600127
Force Transducer	ADInstruments	MLT1030/D
glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G
Heparin	Sagent	400-01
High pressure tubing	Edwards Lifesciences	50P184
iris dressing forceps	Kent	INS650915-4
Jeweler-style curved fine forceps	Miltex	17-307-MLTX
KCl	Sigma-Aldrich	P3911-25G
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662-25G
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506-500G
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888-25G
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014-25G
Roller Pump	Gilson	Minipuls 3
straight dissecting scissors	Kent	INS600393-G
Temporary cardiac pacing wire	Ethicon	TPW30
Wide Range Force Transducer	ADInstruments	MLT1030/A