Modifizierte Technik zur Verwendung von neonatalen Murinherzen im Langendorff-Präparat

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Aortenkanülierung und die retrograde Perfusion des ex-vivo neonatalen murinen Herzens. Eine Zwei-Personen-Strategie mit einem Seziermikroskop und einer abgestumpften kleinen Messnadel ermöglicht eine zuverlässige Kanülierung. Die Quantifizierung der longitudinalen kontraktilen Spannung erfolgt mit einem Kraftaufnehmer, der mit der Spitze des linken Ventrikels verbunden ist.

Zusammenfassung

Die Verwendung des ex-vivo retrograden perfundierten Herzens ist seit seiner Entwicklung durch Oskar Langendorff vor über einem Jahrhundert ein Eckpfeiler der Ischämie-Reperfusionsuntersuchung. Obwohl diese Technik in den letzten 25 Jahren auf Mäuse angewendet wurde, war ihre Verwendung bei dieser Art auf erwachsene Tiere beschränkt. Die Entwicklung einer erfolgreichen Methode zur konsequenten Kanülierung der neonatalen murinen Aorta würde die systematische Untersuchung des isolierten retrograden perfundierten Herzens während einer kritischen Phase der kardialen Entwicklung in einer genetisch veränderbaren und kostengünstigen Spezies ermöglichen. Die Modifikation des Langendorff-Präparats ermöglicht die Kanülierung und Etablierung der Reperfusion im neonatalen murinen Herzen bei gleichzeitiger Minimierung der ischämischen Zeit. Die Optimierung erfordert eine Zwei-Personen-Technik, um eine erfolgreiche Kanülierung der neugeborenen Mausaorta mit einem Seziermikroskop und einer modifizierten handelsüblichen Nadel zu ermöglichen. Die Verwendung dieses Ansatzes wird die retrograde Perfusion innerhalb von 3 Minuten zuverlässig etablieren. Da die Zerbrechlichkeit des neonatalen Mausherzens und der Ventrikelhöhle die direkte Messung des mit einem Ballon erzeugten intraventrikulären Drucks verhindert, ist die Verwendung eines Kraftwandlers erforderlich, der durch eine Naht mit der Spitze des linken Ventrikels verbunden ist, um die kontraktile Längsspannung zu quantifizieren. Diese Methode ermöglicht es den Forschern, erfolgreich eine isolierte retrograde-perfundierte Neugeborenen-Herzvorbereitung für Neugeborene zu etablieren, die das Studium der Entwicklungskardiologie in einer Ex-vivo-Weise ermöglicht. Wichtig ist, dass dieses Modell ein leistungsfähiges Werkzeug sein wird, um die physiologischen und pharmakologischen Reaktionen auf die Ischämie-Reperfusion im neonatalen Herzen zu untersuchen.

Einleitung

Ex-vivo-Herzpräparate sind seit über einem Jahrhundert ein fester Bestandteil physiologischer, pathophysiologischer und pharmakologischer Studien. Ausgehend von der Arbeit von Elias Cyon in den 1860er Jahren passte Oskar Langendorff das isolierte Froschmodell für die retrograde Perfusion an und setzte die Aortenwurzel unter Druck, um den Koronarfluss mit einem sauerstoffhaltigen Perfusat¹ zu gewährleisten. Mit seiner Adaption konnte Langendorff einen Zusammenhang zwischen Koronarzirkulation und mechanischer Funktion² nachweisen. Das ex-vivo retrograde perfundierte Herz, später namensgebend als Langendor....

Protokoll

Für alle beschriebenen Methoden wurden die Zulassungen des Institutional Animal Care and Use Committee des Columbia University Medical Center eingeholt. Wildtyp C57Bl/6 männliche postnatale Tag 10 Mäuse wurden für die Studie verwendet.

1. Vorbereitung der Langendorff-Apparatur

1. Um die Komplexität zu minimieren, verwenden Sie nicht rezirkulierendes oxygeniertes Perfusat innerhalb der Langendorff-Apparatur (siehe Materialtabelle) über konstanten Durchfluss oder konstanten Druck.
   1. Verwenden Sie Krebs-Henseleit-Puffer (KHB), der 120 mmol/L NaCl, 4,7 mmol/L KCl, 1,2 mmol/L_MgSO4

Ergebnisse

P10-Mäuse wurden verwendet, um einen Zeitpunkt im menschlichen Säuglingsalter zu modellieren^26,27. Fünfzehn isolierte C57Bl/6 neugeborene Mausherzen wurden erfolgreich geerntet und kanüliert. Die Herzen wurden mit einem kontinuierlichen Fluss von 2,5 ml ^min-1 erwärmtem sauerstoffhaltigem KHB durchblutet. Metabolische Parameter, einschließlich Glukoseextraktion, Sauerstoffverbrauch, Laktatproduktion und physiologische Parameter wie Herzfrequenz, P.......

Diskussion

Die vorliegende Arbeit beschreibt eine erfolgreiche Aortenkanülierung und retrograde Perfusion im isolierten neugeborenen Mausherzen. Wichtig ist, dass es den Forschern ermöglicht, die Barrieren zu überwinden, die das Alter junger Mäuse und die geringe Herzgröße zuvor⁸ dargestellt haben. Obwohl der Ansatz im Design nicht komplex ist, erfordert er ein erhebliches Maß an technischem Können. Schlüsselschritte, die selbst die technisch versiertesten Ermittler unweigerlich herausfordern werden.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rodent Langendorff Apparatus	Radnoti	130102EZ
24 G catheter	BD	381511
26 G needle on 1 mL syringe combo	BD	309597
26 G steel needle	BD	305111
5-0 Silk Suture	Ethicon	S1173
Bio Amp	ADInstruments	FE135
Bio Cable	ADInstruments	MLA1515
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901-100G
Circulating heating water Bath	Haake	DC10
curved iris scissor	Medline	MDS10033Z
dissecting microscope	Nikon	SMZ-2B
find spring scissors	Kent	INS600127
Force Transducer	ADInstruments	MLT1030/D
glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G
Heparin	Sagent	400-01
High pressure tubing	Edwards Lifesciences	50P184
iris dressing forceps	Kent	INS650915-4
Jeweler-style curved fine forceps	Miltex	17-307-MLTX
KCl	Sigma-Aldrich	P3911-25G
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662-25G
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506-500G
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888-25G
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014-25G
Roller Pump	Gilson	Minipuls 3
straight dissecting scissors	Kent	INS600393-G
Temporary cardiac pacing wire	Ethicon	TPW30
Wide Range Force Transducer	ADInstruments	MLT1030/A