Модифицированная методика использования неонатальных мышиных сердец в препарате Лангендорфа

Резюме

Настоящий протокол описывает канюляцию аорты и ретроградную перфузию неонатального мышиного сердца ex-vivo . Стратегия двух человек, использующая рассекающий микроскоп и притупленную маленькую калибровочную иглу, позволяет надежно каннюляцию. Количественная оценка продольного сократительного напряжения достигается с помощью силового преобразователя, подключенного к вершине левого желудочка.

Аннотация

Использование ретроградного перфузированного сердца ex-vivo уже давно является краеугольным камнем исследования ишемии-реперфузии с момента его разработки Оскаром Лангендорфом более века назад. Хотя этот метод применялся к мышам в течение последних 25 лет, его использование у этого вида было ограничено взрослыми животными. Разработка успешного метода последовательного каннуляции неонатальной мышиной аорты позволила бы систематически изучать изолированное ретроградное перфузированное сердце в критический период развития сердца у генетически модифицируемых и недорогих видов. Модификация препарата Лангендорфа позволяет канюляцию и установление реперфузии в неонатальном мышином сердце при минимизации ишемического времени. Оптимизация требует метода двух человек, чтобы обеспечить успешную канюляцию аорты новорожденной мыши с использованием рассекающего микроскопа и модифицированной коммерчески доступной иглы. Использование такого подхода позволит надежно установить ретроградную перфузию в течение 3 мин. Поскольку хрупкость сердца неонатальной мыши и размер полости желудочков препятствует прямому измерению внутрижелудочкового давления, создаваемого с помощью баллона, необходимо использовать датчик силы, соединенный швом с вершиной левого желудочка для количественной оценки продольного сократительного напряжения. Этот метод позволяет исследователям успешно установить изолированный ретроградно-перфузированный препарат сердца новорожденных мышей с постоянным потоком, что позволяет изучать биологию развития сердца ex-vivo . Важно отметить, что эта модель станет мощным инструментом для исследования физиологических и фармакологических реакций на ишемию-реперфузию в неонатальном сердце.

Введение

Сердечные препараты Ex-vivo были основным продуктом физиологических, патофизиологических и фармакологических исследований на протяжении более века. Основываясь на работе Элиаса Сайона в 1860-х годах, Оскар Лангендорф адаптировал изолированную модель лягушки для ретроградной перфузии, создавая давление на корень аорты, чтобы обеспечить коронарный поток насыщенным кислородом перфусатом¹. Используя свою адаптацию, Лангендорф смог продемонстрировать корреляцию между коронарным кровообращением и механической функцией². Ретроградное перфузированное сердце ex-vivo, позже одноименное названное техникой Лангендорфа, оставалось краеугольным камнем физиологических исследований, используя свою простоту для мощного изучения изолированного сердца в отсутствие потенциальных путаниц. Препарат Лангендорфа был дополнительно модифицирован, чтобы позволить сердцу выбрасываться (так называемое «работающее сердце») и позволять перфусату рециркулировать³. Однако первичные физиологические конечные точки, представляющие интерес, остались неизменными. Такие конечные точки включают меры сократительной функции, электрической проводимости, сердечного метаболизма и коронарного сопротивления⁴.

Чтобы оценить сердечную функцию в своем первоначальном препарате для сердца лягушки, Лангендорф измерил напряжение, создаваемое сокращением желудочков в продольной оси, используя шов, соединенный между вершиной сердца и датчиком силы. ⁵ Изометрическое сокращение количественно определяли таким образом с базальным напряжением, приложенным к сердцу при отсутствии желудочкового наполнения. Усовершенствование подхода привело к заполненным жидкостью баллонам, помещенным в левый желудочек через левое предсердие для оценки производительности миокарда во время изоволюмического сокращения⁶. Для оценки сердечного ритма и частоты сердечных сокращений поверхностные провода могут быть размещены на полюсах сердца, чтобы позволить исследователям записывать электрокардиограмму. Однако относительной брадикардии можно ожидать, учитывая обязательную денервацию. Внешняя кардиостимуляция может служить для преодоления этого и устранения вариабельности сердечного ритма между экспериментами¹. Другой показатель исхода, метаболизм миокарда, может быть оценен путем измерения содержания кислорода и метаболического субстрата в коронарном перфусате и сточных водах и расчета разницы между ними⁷. Количественная оценка лактата в коронарных стоках может помочь в характеристике периодов анаэробного метаболизма, как это наблюдается при гипоксии, гипоперфузии, ишемии-реперфузии или метаболических возмущениях⁷.

Оригинальная работа Лангендорфа позволила изучить сердце млекопитающих ex-vivo, используя кошек в качестве основного предмета⁵. Оценка изолированного сердца крысы приобрела популярность в середине 1900-х годов у Говарда Моргана, который подробно описал модель крысы «рабочего сердца» в 1967^{году 5}. Использование мышей началось только 25 лет назад из-за технической сложности, хрупкости тканей и относительно небольшого размера сердца мышей. Несмотря на проблемы, связанные с исследованием на мышах, более низкие затраты и простота генетических манипуляций увеличили привлекательность и спрос на такие мышиные препараты ex-vivo. К сожалению, применение метода было ограничено взрослыми животными, причем молодые 4-недельные мыши были самыми молодыми субъектами, используемыми для исследования ex-vivo до недавнего^{времени 8,9}. В то время как молодые мыши «относительно незрелые» по сравнению со взрослыми, их полезность в качестве субъектов для исследований биологии развития ограничена, потому что они, по большому счету, отлучены от своей родовой плотины и скоро начнут половое созревание¹⁰. Подростковый возраст наступает далеко за пределами постнатального перехода в использовании субстрата миокарда от глюкозы и лактата к жирным кислотам¹¹. Таким образом, большая часть информации о метаболических изменениях в сердце новорожденных исторически была получена в результате работы ex-vivo у более крупных видов, таких как кролики и морская свинка¹¹.

Действительно, существуют альтернативные подходы к подготовке Лангендорфа. К ним относятся эксперименты in vitro, в которых отсутствуют все функциональные данные и контекст органа, или исследования in vivo. Это может быть технически сложным и сложным из-за смешивания переменных, таких как сердечно-сосудистые и респираторные эффекты необходимого анестетика, влияние нейрогуморального ввода, последствия температуры ядра, питательный статус животного и доступность субстрата^12,13. Поскольку подход Лангендорфа позволяет изучать изолированно-перфузированное сердце ex-vivo более контролируемым образом в отсутствие таких путаниц, он считался и продолжает считаться мощным инструментом исследования. Таким образом, представленная здесь методика дает исследователям экспериментальный подход к исследованию ex-vivo сердца новорожденных мышей и ограничивает время до реперфузии.

Исследование сердца в периоды развития является важным соображением, учитывая широкий спектр биохимических, физиологических и анатомических переходов, которые происходят во время созревания миокарда. Переход от анаэробного метаболизма к окислительному фосфорилированию, изменения в использовании субстрата и прогрессирование от пролиферации клеток к гипертрофии являются динамическими процессами, которые уникально происходят в незрелом сердце^11,14. Другим важным аспектом развивающегося сердца является то, что стрессоры, встречающиеся в течение необходимых периодов, могут вызывать повышенные реакции в сердце новорожденного и изменять будущую восприимчивость к оскорблениям во взрослом возрасте¹⁵. Хотя предыдущая работа использовала новорожденных крыс, ягнят и кроликов для изучения неонатального сердца, перфузированного Лангендорфом, достижения, разрешающие использование мышей, необходимы, учитывая важность этого вида для исследований биологии развития¹⁶. Чтобы удовлетворить эту потребность, недавно была создана первая модель сердца новорожденного с перфузией Лангендорфа с использованием 10-дневных животных⁶. Здесь представлен метод, позволяющий обеспечить успешную канюляцию аорты и установить ретроградную перфузию изолированного сердца новорожденных мышей. Этот подход может быть использован для фармакологии, ишемии-реперфузии или исследований метаболизма, ориентированных на функцию всего органа, или может быть адаптирован для выделения кардиомиоцитов.

протокол

Институциональный комитет по уходу за животными и их использованию Медицинского центра Колумбийского университета получил одобрение для всех описанных методов. Для исследования использовались дикие самцы мышей C57Bl/6 послеродового дня 10.

1. Подготовка аппарата Лангендорфа

1. Чтобы свести к минимуму сложность, используйте нерециркуляционный оксигенированный перфусат в аппарате Лангендорфа (см. Таблицу материалов) через постоянный поток или постоянное давление.
   1. Используйте буфер Кребса-Генселеита (KHB), содержащий 120 ммоль/л NaCl, 4,7 ммоль/л KCl, 1,2 ммоль/л MgSO₄, 1,2 ммоль/л KH₂PO₄, 1,25 ммоль/л CaCl₂, 25 ммоль/л NaHCO₃ и 11 ммоль/л глюкозы при рН 7,4 (см. Таблицу материалов), уравновешивайте с 95%_O2 и 5% CO₂ в аппарате Лангендорфа и поддерживайте 37 °C.
2. Для подхода с постоянным потоком поддерживайте непрерывный расход на уровне ~2,5 мл∙^мин-1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта скорость потока будет приближаться к коронарному потоку ~ 75-80 мл / г∙мин, учитывая, что средний вес сердца мыши в возрасте 10 дней (P10) составляет ~ 30 мг^17,18.

2. Изготовление канюли аорты

1. Изготовьте аортальную канюлю новорожденной мыши из иглы из нержавеющей стали весом 26 г (см. Таблицу материалов). Используя острые ножницы, отрежьте кончик иглы, чтобы затупить конец. Следите за тем, чтобы не обжать и не ограничивать диаметр просвета иглы. Разгладьте срезанный край и удалите все буры, аккуратно соскребая затупленный конец на лабораторной столешнице движением туда-сюда.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Микроскопические ожоги и острые края должны быть удалены, потому что они могут разорвать аорту новорожденной мыши и повредить аортальный клапан. В качестве альтернативы используйте мелкозернистую наждачную бумагу.
2. Прикрепите изготовленную канюлю к аппарату Лангендорфа и оцените расход и сопротивление. Измерьте скорость потока через канюлю, собирая и измеряя количество буфера за известный период времени. Убедитесь, что фактический расход равен заданному расходу 2,5 мл ^мин-1.
3. Количественно оцените перепад давления по канюле с протеканием KHB, выполнив следующие шаги.
   1. Измерьте давление в системе с прикрепленной канюлей и без нее.
   2. Разделите перепад давления по канюле на скорость потока, чтобы получить сопротивление канюли в соответствии с законом^{Ома 15}.
   3. Убедитесь, что изготовленное сопротивление канюли составляет ~16,0 ± 1,9 мм рт.ст.∙мин∙^мл-1 от общего сопротивления⁶. Чрезмерная резистентность предполагает потенциально скомпрометированный просвет канюли.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выборочный расчет: P_{с канюлей} - P _{без канюли} = ΔP. Если P_с = 48 и P_без = 8, то ΔP = 40. При расходе (Q) 2,5 мл ^мин-1 и ΔP 40 сопротивление канюли равно 16 мм рт.ст.∙мин∙^мл-1 при использовании R = ΔP/Q = 40 / 2,5 = 16.
4. Снимите канюлю весом 26 Г и прикрепите трубку высокого давления (см. Таблицу материалов) к месту канюляции на аппарате Лангендорфа. Прикрепите канюлю аорты к дистальному концу трубки. Обезвреживание трубки и канюли с помощью насыщенного кислородом буфера, гарантируя, что все пузырьки удалены.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование таким образом труб высокого давления позволяет вытянуть канюлю в более отдаленное положение. Это необходимо для обеспечения канюляции аорты с помощью рассекающего микроскопа, прилегающего к установке (рисунок 1).

3. Извлечение органов

1. Антикоагулянтные мыши с помощью внутрибрюшинной (IP) инъекции гепарина (10 кЕд/кг) (см. Таблицу материалов) для предотвращения образования коронарных микротромбов с использованием иглы 26 Г на шприце 1 мл. Дайте несколько минут гепарину циркулировать, прежде чем приступить к инъекции любого анестетика.
2. Обезболить животное с помощью инъекции IP с помощью иглы 26 г на шприце 1 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно тщательно наблюдать за животным после инъекции анестетика, чтобы избежать апноэ и последующей гипоксии. Пентобарбитал (70 мг/кг) является надежным выбором анестетика, так как позволяет быстро начать седацию без индуцирования апноэ^19,20. Другие анестетики могут быть использованы при условии, что используемые дозы не вызывают апноэ²¹. Исследователи должны рассмотреть влияние альтернативных седативно-снотворных средств на сердечную функцию^22,23. Вывих шейки матки как первичный способ эвтаназии может продлить предканнуляционную гипоксию и ишемию.
3. Поместите мышь в лежачее положение и закрепите конечности сразу после потери сознания. Используйте небольшие подкожные иглы, чтобы закрепить каждую конечность. Начинайте сбор урожая, как только животное перестанет реагировать на ущемление пальца ноги; животное должно дышать спонтанно во время первоначального рассечения.
4. Сделайте поперечный подксифоидный разрез по всей ширине животного, чтобы обнажить брюшную полость, используя прямые рассекающие ножницы (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильная техника не является необходимой, учитывая, что процедура представляет собой несмертельную хирургию.
   1. Определите диафрагму лучше и полностью вырежьте переднюю часть. Режут грудную клетку двусторонне вдоль средне-подмышечной линии в цефаладном направлении. Попросите помощника схватить мечевидный отросток щипцами и отразить грудину и ребра кранизно, чтобы обнажить органы грудной клетки.
5. Выявляют инфрадиафрагмальную нижнюю полую вену (IVC) над печенью. Трансектируйте IVC изогнутыми ножницами радужной оболочки, сохраняя при этом незначительное переднее и цефаладное напряжение на проксимальном сегменте щипцами радужной оболочки (см. Таблицу материалов).
   1. Разрезать сзади вдоль передней поверхности позвоночника с помощью изогнутых ножниц радужной оболочки при вытягивании ИВК вверх и из грудной полости. Когда сердце мобилизуется, наклоните ножницы кпереди и разрежьте большие сосуды, чтобы полностью удалить сердце и легкие.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод позволяет быстро эксплантировать сердце и легкие в блоке.
6. Немедленно погрузите экземпляр в ледяной КХБ или физиологический раствор. Сердце должно перестать биться в течение нескольких секунд.

4. Каннуляция

1. Вырежьте лист бумажного полотенца и поместите его на дно неглубокой чашки Петри, чтобы обеспечить трение для стабилизации сердца во время канюляции. Смочите ледяным KHB, чтобы сердце не прилипало к нему.
   1. Поместите подготовленную чашку Петри под рассекающий микроскоп и отрегулируйте фокус. Поместите аортальную канюлю, прикрепленную к удлинительной трубке высокого давления, под рассекающим микроскопом вместе с шелковым швом 5-0, свободно связанным вокруг ее ступицы (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо соблюдать осторожность, чтобы ограничить количество жидкости в чашке Петри, потому что наполненные воздухом легкие могут плавать и вызывать движение иссеченных органов.
2. Поместите иссеченные органы грудной клетки в чашку Петри. Под микроскопом идентифицируйте тимус по его белому блеску и двум долям и ориентируйте образец так, чтобы тимус был передним и превосходящим²⁴. Это обеспечит правильную ориентацию сердца.
3. Используя щипцы, тупо отделите доли тимуса, чтобы обнажить большие сосуды. Определите аорту, обнаружив отличительные ветвящиеся особенности дуги аорты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Темно-фиолетовый оттенок часто разграничивает правый желудочек и легочную артерию. Восходящая аорта расположена между главной легочной артерией и правым предсердием.
4. Трансекция аорты тонкими острыми ножницами (см. Таблицу материалов) непосредственно вблизи взлета подключичной артерии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если аорта трансецируется слишком близко к аортальному клапану, не будет достаточно ткани аорты, чтобы канюля могла быть закреплена. В качестве альтернативы, если аорта транссектирована слишком высоко, перфусат может просачиваться из одной или нескольких ветвей аорты (таких как подключичная артерия).
5. Осторожно захватите трансективную аорту, используя тонкие изогнутые щипцы ювелирного типа (см. Таблицу материалов). Осторожно канюльируйте аорту тупой иглой весом 26 г, следя за тем, чтобы не повредить аортальный клапан. Держитесь на месте, захватывая аорту тонкими изогнутыми щипцами вокруг канюли. Как только контроль аорты установлен, инициируйте ретроградную перфузию, чтобы ограничить ишемическое время.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сердце должно начать биться и станет бледным, поскольку кровь дренируется из миокарда, а KHB перфузирует коронарные артерии. Неспособность самопроизвольно биться, наличие желудочкового нагрубания или отсутствие изменения цвета сердца указывает на неправильно поставленную канюлю.
6. Попросите помощника схватить концы свободно завязанного шва и аккуратно зафиксировать аорту вокруг канюли. Зажмите шов выше или ниже изогнутых тонких щипцов (удерживая канюлю на месте), в зависимости от количества ткани аорты и анатомических соображений. Затяните шов и подтвердите адекватность коронарного потока.
7. Отсоедините трубку высокого давления от аппарата Лангендорфа. Возьмитесь за ступицу канюли и отсоедините тупую иглу от удлинительной трубки высокого давления. Быстро прикрепите ступицу канюли к аппарату.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не выбить сердце и не втянуть воздух в канюлю.
8. После того, как сердце повешено на аппарат Лангендорфа в обычном положении, и адекватная перфузия подтверждена, аккуратно обрезают легкие, тимус и лишнюю ткань. Разрезайте правое предсердие, чтобы позволить стокам коронарных пазух свободно капать.

5. Функциональное измерение

1. Сделайте небольшой узелок на конце 5-0 шелкового шва (прикрепленного к изогнутой игле). Проткните иглой небольшой кусочек парафиновой пленки (2-3 мм х 2-3 мм) и сдвиньте парафин к завязанному концу. Осторожно пропустите иглу через верхушку желудочка и потяните шов через сердце до тех пор, пока парафиновая пленка не прижмется к боковой стенке желудочка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Парафиновая пленка помогает предотвратить разрыв узла сердца и вытягивание через желудочек.
2. Пропустите иглу через отверстие заполненной водой согревающей рубашки аппарата Лангендорфа. Теперь сердце можно заключить в оболочку и согреть.
3. Прикрепите иглу к преобразователю силы (см. Таблицу материалов) таким образом, чтобы избежать капельницы коронарного синуса. Отрегулируйте шов, чтобы наложить 1-2 г базального натяжения, о чем свидетельствует диастолическое натяжение или надир в отслеживании натяжения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте отрыва сердца от канюли или скручивания аорты, тем самым ставя под угрозу коронарную перфузию.
4. Поместите поверхностные электроды на верхний и нижний полюса сердца для записи электрокардиограммы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте педиатрическую временную эпикардиальную проволоку с удаленной иглой для гибкого поверхностного электрода, подключенного к Bio Amp (см. Таблицу материалов).
5. Образец сточных вод коронарных пазух для анализа с использованием катетера 24 Г IV (см. Таблицу материалов).
6. Вычтите сопротивление канюли из общего сопротивления системы, чтобы получить коронарное сопротивление в соответствии с законом Кирхгофа²⁵.

Результаты

Мыши P10 использовались для моделирования временной точки в младенчестве человека ^26,27. Пятнадцать изолированных сердец новорожденных мышей C57Bl/6 были собраны и успешно каннулированы. Сердца перфузировали непрерывным потоком 2,5 мл ^мин-1 нагретого нас...

Обсуждение

Настоящая работа описывает успешную канюляцию аорты и ретроградную перфузию в изолированном сердце новорожденной мыши. Важно отметить, что это позволяет исследователям преодолеть барьеры, которые молодой мышиный возраст и небольшой размер сердца ранее^{представляли 8}. Хо?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rodent Langendorff Apparatus	Radnoti	130102EZ
24 G catheter	BD	381511
26 G needle on 1 mL syringe combo	BD	309597
26 G steel needle	BD	305111
5-0 Silk Suture	Ethicon	S1173
Bio Amp	ADInstruments	FE135
Bio Cable	ADInstruments	MLA1515
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901-100G
Circulating heating water Bath	Haake	DC10
curved iris scissor	Medline	MDS10033Z
dissecting microscope	Nikon	SMZ-2B
find spring scissors	Kent	INS600127
Force Transducer	ADInstruments	MLT1030/D
glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G
Heparin	Sagent	400-01
High pressure tubing	Edwards Lifesciences	50P184
iris dressing forceps	Kent	INS650915-4
Jeweler-style curved fine forceps	Miltex	17-307-MLTX
KCl	Sigma-Aldrich	P3911-25G
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662-25G
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506-500G
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888-25G
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014-25G
Roller Pump	Gilson	Minipuls 3
straight dissecting scissors	Kent	INS600393-G
Temporary cardiac pacing wire	Ethicon	TPW30
Wide Range Force Transducer	ADInstruments	MLT1030/A