Técnica modificada para o uso de corações murinos neonatais na preparação de Langendorff

Resumo

O presente protocolo descreve a canonização aórtica e a perfusão retrógrada do coração murino neonatal ex-vivo . Uma estratégia de duas pessoas, usando um microscópio de dissecação e uma agulha de bitola pequena, permite a cannulação confiável. A quantificação da tensão contítil longitudinal é alcançada usando um transdutor de força conectado ao ápice do ventrículo esquerdo.

Resumo

O uso do coração perfumado ex-vivo tem sido uma pedra angular da investigação isquemia-reperfusão desde o seu desenvolvimento por Oskar Langendorff há mais de um século. Embora essa técnica tenha sido aplicada a camundongos nos últimos 25 anos, seu uso nesta espécie tem sido limitado a animais adultos. O desenvolvimento de um método bem-sucedido para cannular consistentemente a aorta murina neonatal permitiria o estudo sistemático do coração isolado perfusado retrógrado durante um período crítico de desenvolvimento cardíaco em uma espécie geneticamente modificável e de baixo custo. A modificação da preparação de Langendorff permite a canulação e o estabelecimento de reperfusão no coração murino neonatal, minimizando o tempo isquêmico. A otimização requer uma técnica de duas pessoas para permitir a cannulação bem sucedida da aorta do rato recém-nascido usando um microscópio de dissecação e uma agulha modificada comercialmente disponível. O uso desta abordagem estabelecerá de forma confiável a perfusão retrógrada dentro de 3 minutos. Como a fragilidade do coração do camundongo neonatal e o tamanho da cavidade ventricular impedem a medição direta da pressão intraventricular gerada usando um balão, é necessário o uso de um transdutor de força conectado por uma sutura ao ápice do ventrículo esquerdo para quantificar a tensão contratitil longitudinal. Este método permite aos pesquisadores estabelecer com sucesso uma preparação isolada de coração murino de fluxo constante, permitindo o estudo da biologia cardíaca do desenvolvimento de forma ex-vivo . É importante ressaltar que este modelo será uma poderosa ferramenta para investigar as respostas fisiológicas e farmacológicas à isquemia-reperfusão no coração neonatal.

Introdução

Os preparativos do coração ex-vivo têm sido um grampo de estudos fisiológicos, fisiopatológicos e farmacológicos há mais de um século. Decorrente do trabalho de Elias Cyon na década de 1860, Oskar Langendorff adaptou o modelo isolado de sapo para perfusão retrógrada, pressurizando a raiz aórtica para fornecer fluxo coronário com um perfusado oxigenado¹. Usando sua adaptação, Langendorff foi capaz de demonstrar uma correlação entre circulação coronária e função mecânica². O ex-vivo coração retrógrado perfumado, mais tarde homônimo apelidado de técnica Langendorff, tem permanecido uma pedra angular da investigação fisiológica, aproveitando sua simplicidade para estudar poderosamente o coração isolado na ausência de potenciais confundidores. A preparação de Langendorff foi modificada ainda mais para permitir que o coração ejete (o chamado "coração de trabalho") e permita que o perfusato recircular³. No entanto, os principais pontos de interesse fisiológicos permaneceram inalterados. Tais pontos finais incluem medidas de função contratil, condução elétrica, metabolismo cardíaco e resistência coronariana⁴.

Para avaliar a função cardíaca em sua preparação cardíaca original, Langendorff mediu a tensão gerada pela contração ventricular no eixo longitudinal usando uma sutura conectada entre o ápice do coração e um transdutor de força. ⁵ A contração isométrica foi quantificada desta forma com tensão basal aplicada ao coração na ausência de preenchimento ventricular. O refinamento da abordagem levou a balões cheios de fluidos colocados no ventrículo esquerdo através do átrio esquerdo para avaliar o desempenho do miocárdio durante a contração isovolumica⁶. Para avaliar o ritmo cardíaco e a frequência cardíaca, os condutores de superfície podem ser colocados nos polos do coração para permitir que os investigadores gravem o eletrocardiograma. No entanto, pode-se esperar bradicardia relativa, dada a denervação obrigatória. O ritmo extrínseco pode servir para superar isso e eliminar a variabilidade da frequência cardíaca entre os experimentos¹. Outra medida de desfecho, o metabolismo do miocárdio, pode ser avaliada medindo o teor de oxigênio e substrato metabólico no perfusato coronário e efluente e calculando a diferença entre eles⁷. A quantificação de lactato no efluente coronário pode auxiliar na caracterização de períodos de metabolismo anaeróbico como é visto com hipóxia, hipoperfusão, isquemia-reperfusão ou perturbações metabólicas⁷.

O trabalho original de Langendorff possibilitou o estudo do coração mamífero ex-vivo, usando gatos como tema principal⁵. A avaliação do coração de rato isolado ganhou popularidade em meados da década de 1900 com Howard Morgan, que detalhou o modelo de rato "coração de trabalho" em 1967⁵. O uso de camundongos começou há apenas 25 anos devido à complexidade técnica, fragilidade tecidual e tamanho relativamente pequeno do coração murino. Apesar dos desafios associados ao estudo dos camundongos, os custos mais baixos e a facilidade da manipulação genética aumentaram o apelo e a demanda de tais preparações ex-vivo murinas. Infelizmente, a aplicação da técnica tem sido limitada a animais adultos, com camundongos juvenis de 4 semanas de idade sendo os mais jovens utilizados para o estudo ex-vivo até recentemente ^8,9. Embora os camundongos juvenis sejam "relativamente imaturos" em comparação com os adultos, sua utilidade como sujeitos para estudos de biologia do desenvolvimento é limitada porque eles têm, em geral, desmamado de sua represa de nascimento e em breve começará a puberdade¹⁰. A adolescência ocorre muito além da transição pós-natal na utilização do substrato miocárdio de glicose e lactato para ácidos graxos¹¹. Assim, a maioria das informações sobre as mudanças metabólicas no coração neonatal tem historicamente resultado de trabalhos ex-vivos em espécies maiores, como coelhos e^{cobaias 11}.

De fato, existem abordagens alternativas para a preparação de Langendorff. Estes incluem experimentação in vitro, que carece de dados e contexto funcionais de órgãos inteiros, ou estudos in vivo. Isso pode ser tecnicamente desafiador e complicado confundindo variáveis como os efeitos cardiovasculares e respiratórios de um agente anestésico necessário, a influência da entrada neurohumoral, as consequências da temperatura do núcleo, o estado nutricional do animal e a disponibilidade de^{substratos 12,13}. Como a abordagem de Langendorff permite o estudo do coração isolado perfumado de forma ex-vivo de forma mais controlada na ausência de tais confundimentos, tem sido e continua a ser considerado uma poderosa ferramenta investigativa. Portanto, a técnica aqui apresentada dá aos pesquisadores uma abordagem experimental para o estudo ex-vivo do coração murino recém-nascido e limita o tempo para a reperfusão.

Investigar o coração durante períodos de desenvolvimento é uma consideração importante, dadas as amplas transições bioquímicas, fisiológicas e anatômicas que ocorrem durante o amadurecimento do miocárdio. Mudanças do metabolismo anaeróbico para a fosforilação oxidativa, alterações na utilização do substrato e progressão da proliferação celular para a hipertrofia são processos dinâmicos que ocorrem exclusivamente no coração imaturo^11,14. Outro aspecto crítico do coração em desenvolvimento é que os estressores encontrados durante os períodos necessários podem produzir respostas elevadas no coração recém-nascido e alterar a suscetibilidade futura a insultos na idade adulta¹⁵. Embora o trabalho anterior tenha utilizado ratos, cordeiros e coelhos recém-nascidos para estudar o coração neonatal perfusado de Langendorff, os avanços que permitem o uso de camundongos são necessários dada a importância desta espécie para a pesquisa de biologia do desenvolvimento¹⁶. Para atender a essa necessidade, o primeiro modelo de coração recém-nascido perfusado por Murine Langendorff usando animais de 10 dias de idade foi recentemente estabelecido⁶. Apresentado aqui é um método para permitir a canulação aórtica bem sucedida e estabelecer perfusão retrógrada do coração murino recém-nascido isolado. Essa abordagem pode ser utilizada para farmacologia, isquemia-reperfusão ou estudos de metabolismo com foco em toda a função do órgão ou pode ser adaptada para o isolamento de cardiomiócitos.

Protocolo

As aprovações do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro Médico da Universidade de Columbia foram obtidas para todos os métodos descritos. No estudo, foram utilizados 10 camundongos do pós-natal masculino do tipo selvagem 10 camundongos.

1. Preparação do aparelho Langendorff

1. Para minimizar a complexidade, use perfusato oxigenado não recirculante dentro do aparelho Langendorff (ver Tabela de Materiais) através de fluxo constante ou pressão constante.
   1. Use tampão Krebs-Henseleit (KHB), contendo 120 mmol/L de NaCl, 4,7 mmol/L de KCl, 1,2 mmol/L de MgSO₄, 1,2 mmol/L de KH₂PO₄, 1,25 mmol/L de CaCl₂, 25 mmol/L de NaHCO₃, e 11 mmol/L de glicose no pH 7.4 (ver Tabela de Materiais), equilibre-se com 95% de O₂ e 5% de CO₂ dentro do aparelho Langendorff e mantenha a 37 °C.
2. Para a abordagem de fluxo constante, mantenha uma taxa de fluxo contínua em ~2,5 mL∙^min-1.
   NOTA: Esta taxa de fluxo irá aproximar o fluxo coronário de ~75-80 mL/g∙min, dado que o peso médio de um coração de rato de 10 dias de idade (P10) é de ~30^{mgs 17,18}.

2. Fabricação de cânula aórtica

1. Fabricar a cânula aórtica do rato recém-nascido a partir de uma agulha de aço inoxidável de 26 G (ver Tabela de Materiais). Usando uma tesoura afiada, corte a ponta da agulha para cortar a ponta. Tome cuidado para não amassar ou restringir o diâmetro do lúmen agulha. Suavize a borda de corte e remova as brocas raspando suavemente a extremidade emarada no banco do laboratório usando um movimento de ida e volta.
   NOTA: As brocas microscópicas e as bordas afiadas devem ser removidas porque podem rasgar a aorta do rato recém-nascido e danificar a válvula aórtica. Alternativamente, use lixa de grão fino.
2. Conecte a cânula fabricada ao aparelho Langendorff e avalie o fluxo e a resistência. Meça as taxas de fluxo através da cânula coletando e medindo a quantidade de buffer durante um período de tempo conhecido. Certifique-se de que o fluxo real seja igual à taxa de fluxo definida de 2,5 mL ^min-1.
3. Quantifique o diferencial de pressão através da cânula com khb fluindo seguindo os passos abaixo.
   1. Meça a pressão no sistema com e sem a cânula fabricada anexada.
   2. Divida o diferencial de pressão através da cânula pela taxa de fluxo para obter resistência à cânula conforme a lei¹⁵ de Ohm.
   3. Certifique-se de que a resistência à cânula fabricada compreende ~16,0 ± 1,9 mmHg∙minmin∙^mL-1 da resistência total⁶. Resistência excessiva sugere um lúmen de cânula potencialmente comprometido.
      NOTA: Cálculo da amostra: P_{com cânula} - P _{sem cânula} = ΔP. Se P_com = 48 e P_sem = 8, então ΔP = 40. Em uma taxa de fluxo (Q) de 2,5 mL ^min-1 e ΔP de 40 resistência à cânula é igual a 16 mmHg∙min∙^mL-1 usando R = ΔP/Q = 40 / 2,5 = 16.
4. Remova a cânula de 26 G e conecte o tubo de alta pressão (ver Tabela de Materiais) ao local da cannula no aparelho Langendorff. Coloque a cânula aorítica na extremidade distal da tubulação. Desarme o tubo e a cânula com tampão oxigenado, garantindo que todas as bolhas sejam removidas.
   NOTA: O uso de tubos de alta pressão desta forma permite que a cânula seja estendida para uma posição mais remota. Isso é necessário para permitir a canulação aórtica com um microscópio dissecando adjacente à configuração (Figura 1).

3. Colheita de órgãos

1. Camundongos anticoagulados através de injeção intraperitoneal (IP) de heparina (10 kU/kg) (ver Tabela de Materiais) para evitar a formação de microtrombibi coronariano usando uma agulha de 26 G em seringa de 1 mL. Deixe vários minutos para que a heparina circule antes de prosseguir com a injeção de qualquer anestésico.
2. Anestesiar o animal com uma injeção ip usando uma agulha de 26 G em seringa de 1 mL.
   NOTA: É essencial monitorar cuidadosamente o animal após a injeção anestésico para evitar apneia e hipoxia subsequente. Pentobarbital (70 mg/kg) é uma escolha confiável de anestésico, pois permite o início rápido da sedação sem induzir apneia^19,20. Outros agentes anestésicos podem ser utilizados, desde que as doses utilizadas não causem apneia²¹. Os pesquisadores devem considerar os efeitos de sedativos-hipnóticos alternativos na função cardíaca^22,23. A luxação cervical como um modo primário de eutanásia pode prolongar a hipoxia pré-cannulação e isquemia.
3. Coloque o rato na posição supina e proteja os membros imediatamente após a perda de consciência. Use agulhas hipodérmicas de pequeno calibre para fixar cada membro. Comece a colher assim que o animal não responder ao dedo do dedo do dedo do pedaço; o animal deve respirar espontaneamente durante a dissecção inicial.
4. Faça uma incisão subxifóide transversal através da largura do animal para expor a cavidade abdominal usando tesouras dissecando reta (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: A técnica estéril não é necessária, uma vez que o procedimento representa cirurgia não-sutar.
   1. Identifique o diafragma superiormente e incise a parte anterior completamente. Corte a caixa torácica bilateralmente ao longo da linha do meio do axilar em uma direção cefálica. Peça a um assistente para agarrar o processo xifoide com fórceps e refletir o esterno e as costelas cranialmente para expor os órgãos torácicos.
5. Identifique a infra-diafragmática veia cava inferior (IVC) acima do fígado. Transecte o IVC com uma tesoura de íris curvada mantendo leve tensão anterior e cefálica no segmento proximal com fórceps de íris (ver Tabela de Materiais).
   1. Corte posteriormente ao longo da superfície anterior da coluna usando uma tesoura de íris curva enquanto puxa o IVC para cima e para fora da cavidade torácica. À medida que o coração é mobilizado, angule a tesoura anteriormente e corte os grandes vasos superiormente para remover completamente o coração e os pulmões.
      NOTA: Este método permite a rápida explantação do coração e dos pulmões em bloco.
6. Submerse imediatamente o espécime em KHB gelado ou soro fisiológico. O coração deve parar de bater em segundos.

4. Cannulação

1. Corte um pedaço de papel toalha e coloque-o no fundo de uma placa de Petri rasa para fornecer atrito para estabilizar o coração durante a cannulação. Umedeça com khb gelado para evitar que o coração aduste a ele.
   1. Coloque a placa de Petri preparada sob o microscópio de dissecação e ajuste o foco. Coloque a cânula aórtica presa à tubulação de extensão de alta pressão sob o microscópio de dissecação, juntamente com uma sutura de seda 5-0 vagamente amarrada ao redor de seu hub (ver Tabela de Materiais).
      NOTA: Deve-se tomar cuidado para limitar a quantidade de fluido na placa de Petri, pois os pulmões cheios de ar podem flutuar e fazer com que os órgãos excisados se movam.
2. Coloque os órgãos torácicos extirpados na placa de Petri. Sob o microscópio, identifique o timo pelo brilho branco e dois lóbulos e oriente o espécime de tal forma que o timo seja anterior e superior²⁴. Isso garantirá a orientação adequada do coração.
3. Usando fórceps, separe sem rodeios para expor os grandes vasos. Identifique a aorta localizando características distintas de ramificação do arco aórtico.
   NOTA: Uma tonalidade roxa escura frequentemente demarca o ventrículo direito e a artéria pulmonar. A aorta ascendente está localizada entre a artéria pulmonar principal e o átrio direito.
4. Transectar a aorta com uma tesoura fina afiada (ver Tabela de Materiais) apenas proximal à decolagem da artéria subclávia.
   NOTA: Se a aorta estiver transectada muito perto da válvula aórtica, não haverá tecido aórtico suficiente para permitir que a cânula seja presa. Alternativamente, se a aorta for transectada muito alta, o perfusato pode vazar de um ou mais ramos aórticos (como a artéria subclávia).
5. Segure suavemente a aorta transectada usando fórceps finos curvos no estilo joalheiro (ver Tabela de Materiais). Cannula cuidadosamente a aorta com uma agulha cega de 26 G, tomando cuidado para não danificar a válvula aórtica. Segure-se no lugar, agarrando a aorta com as fórceps curvas finas ao redor da cânula. Uma vez estabelecido o controle da aorta, inicie a perfusão retrógrada para limitar o tempo isquêmico.
   NOTA: O coração deve começar a bater e ficará pálido à medida que o sangue é drenado do miocárdio e o KHB perfusa as artérias coronárias. A não batida espontânea, a presença de engorgement ventricular ou a falta de mudança de cor do coração indica uma cânula mal posicionada.
6. Peça ao assistente para agarrar as extremidades da sutura frouxamente amarrada e prender cuidadosamente a aorta ao redor da cânula. Cintile a sutura acima ou abaixo das fórceps finos curvados (segurando a cânula no lugar), dependendo da quantidade de tecido aórtico e considerações anatômicas. Aperte a sutura e confirme a adequação do fluxo coronário.
7. Desconecte a tubulação de alta pressão do aparelho Langendorff. Segure o cubo da cânula e desconecte a agulha cega da tubulação de extensão de alta pressão. Conecte rapidamente o cubo da cânula ao aparelho.
   NOTA: Deve-se tomar cuidado para não desalojar o coração ou entrar ar na cânula.
8. Uma vez que o coração é pendurado no aparelho Langendorff na posição usual, e a perfusão adequada é confirmada, corte cuidadosamente o pulmão, timo e excesso de tecido. Incisar o átrio direito para permitir que o efluente do seio coronário escorra livremente.

5. Medição funcional

1. Faça um pequeno nó no final de uma sutura de seda 5-0 (presa a uma agulha curva). Fure um pequeno pedaço de filme de parafina (2-3 mm x 2-3 mm) com a agulha e deslize a parafina até a extremidade atada. Passe cuidadosamente a agulha através do ápice do ventrículo e puxe a sutura através do coração até que o filme de parafina esteja confortável contra a parede lateral do ventrículo.
   NOTA: O filme de parafina ajuda a evitar que o nó rasgue o coração e puxe o ventrículo.
2. Passe a agulha através da abertura da jaqueta de aquecimento cheia de água do aparelho Langendorff. O coração agora pode ser envolto e aquecido.
3. Conecte a agulha ao transdutor de força (ver Tabela de Materiais) de tal forma que evite o gotejamento do seio coronário. Ajuste a sutura para aplicar 1-2 g de tensão basal, conforme indicado pela tensão diastólica ou nadir no rastreamento de tensão.
   NOTA: Evite tirar o coração da cânula ou torcer a aorta, comprometendo assim a perfusão coronária.
4. Coloque eletrodos de superfície nos polos superiores e inferiores do coração para registrar o eletrocardiograma.
   NOTA: Use fio de ritmo epicárdica temporário pediátrico com a agulha removida para eletrodo de superfície flexível conectado ao Bio Amp (ver Tabela de Materiais).
5. Prove o efluente do seio coronário para análise utilizando um cateter iv de 24 G (ver Tabela de Materiais).
6. Subtraia a resistência à cânula da resistência total do sistema para obter resistência coronária pela lei²⁵ de Kirchhoff.

Resultados

Os ratos P10 foram usados para modelar um ponto de tempo na infância humana^26,27. Quinze corações isolados de camundongos C57Bl/6 foram colhidos e culados com sucesso. Corações foram perfundidos com um fluxo contínuo de 2,5 mL ^min-1 de KHB oxigenado aquecido. Foram medidos parâmetros metabólicos, incluindo extração de glicose, consumo de oxigênio, produção de lactato e parâmetros fisiológicos, como frequência cardíaca, pressão de perf...

Discussão

O presente trabalho descreve a canonização aórtica bem sucedida e a perfusão retrógrada no coração isolado do camundongo recém-nascido. É importante ressaltar que permite aos pesquisadores superar as barreiras que a idade de murina jovem e o pequeno tamanho do coração apresentaram anteriormente⁸. Embora não seja complexa no design, a abordagem requer um grau significativo de habilidade técnica. Os principais passos que inevitavelmente desafiarão até mesmo os investigadores mais tecn...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rodent Langendorff Apparatus	Radnoti	130102EZ
24 G catheter	BD	381511
26 G needle on 1 mL syringe combo	BD	309597
26 G steel needle	BD	305111
5-0 Silk Suture	Ethicon	S1173
Bio Amp	ADInstruments	FE135
Bio Cable	ADInstruments	MLA1515
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901-100G
Circulating heating water Bath	Haake	DC10
curved iris scissor	Medline	MDS10033Z
dissecting microscope	Nikon	SMZ-2B
find spring scissors	Kent	INS600127
Force Transducer	ADInstruments	MLT1030/D
glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G
Heparin	Sagent	400-01
High pressure tubing	Edwards Lifesciences	50P184
iris dressing forceps	Kent	INS650915-4
Jeweler-style curved fine forceps	Miltex	17-307-MLTX
KCl	Sigma-Aldrich	P3911-25G
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662-25G
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506-500G
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888-25G
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014-25G
Roller Pump	Gilson	Minipuls 3
straight dissecting scissors	Kent	INS600393-G
Temporary cardiac pacing wire	Ethicon	TPW30
Wide Range Force Transducer	ADInstruments	MLT1030/A