טכניקה שונה לשימוש בלבבות מורין יילודים בהכנת לנגנדורף

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר תותח אבי העורקים וזליפה מדרדרת של לב מורין ילודים לשעבר . אסטרטגיה של שני אנשים, באמצעות מיקרוסקופ ניתוח ומחט מד קטנה קהה, מאפשרת תותח אמין. כימות מתח התכווצות אורכי מושג באמצעות מתמר כוח המחובר לפסגת החדר השמאלי.

Abstract

השימוש ב-ex-vivo retrograde perfused heart הוא כבר מזמן אבן פינה בחקר איסכמיה-רפרפוזיה מאז פיתוחו על ידי אוסקר לנגנדורף לפני למעלה ממאה שנה. למרות שטכניקה זו יושמה על עכברים במהלך 25 השנים האחרונות, השימוש בה במין זה הוגבל לבעלי חיים בוגרים. פיתוח שיטה מוצלחת לשימור עקבי של אבי העורקים של מורין ילודים יאפשר מחקר שיטתי של הלב המבודד במשך תקופה קריטית של התפתחות לבבית הניתנת למהנדס גנטית ובעלות נמוכה. שינוי הכנת הלנגנדורף מאפשר תותח והקמת רפרפוזיה בלב המורין היילודי תוך מזעור הזמן האיסכמי. אופטימיזציה דורשת טכניקה של שני אנשים כדי לאפשר שימורים מוצלחים של אבי העורקים של העכבר שזה עתה נולד באמצעות מיקרוסקופ ניתוח ומחט זמינה מסחרית שונה. השימוש בגישה זו יקבע באופן אמין פרפוזיה מדרדרת תוך 3 דקות. מכיוון שהשבריריות של לב העכבר היילוד וגודל החלל בחדר מונעת מדידה ישירה של לחץ תוך חדרי שנוצר באמצעות בלון, יש צורך בשימוש במתמר כוח המחובר על ידי תפר לפסגת החדר השמאלי כדי לכמת את מתח התכווצות האורך. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לבסס בהצלחה הכנה ללב מורין של מורין שזה עתה נולד בזרימה קבועה מבודדת, ומאפשרת לחקור ביולוגיה התפתחותית של הלב באופן אקס-ויוו . חשוב לציין שמודל זה יהיה כלי רב עוצמה לחקור את התגובות הפיזיולוגיות והפרמקולוגיות לאיסכמיה-רפרפוזיה בלב היילודים.

Introduction

תכשירי לב Ex-vivo היו מרכיב עיקרי במחקרים פיזיולוגיים, פתופיזיולוגיים ופרמקולוגיים במשך למעלה ממאה שנה. בעקבות עבודתו של אליאס סיון בשנות ה-60 של המאה ה-19, אוסקר לנגנדורף התאים את מודל הצפרדע המבודדת לפרפוזיה מדרדרת, תוך הפעלת לחץ על שורש אבי העורקים כדי לספק זרימה כלילית עם פרפוזט^{מחומצן 1}. באמצעות ההסתגלות שלו, לנגנדורף הצליח להדגים מתאם בין מחזור כלילי לתפקוד מכני². הלב המנוקד ex-vivo retrograde, שלימים כונה טכניקת לנגנדורף, נותר אבן פינה בחקירה הפיזיולוגית, תוך מינוף פשטותו כדי לחקור בעוצמה את הלב המבודד בהיעדר קונפונדרים פוטנציאליים. הכנת לנגנדורף שונתה עוד יותר כדי לאפשר ללב לפלוט (מה שמכונה "הלב העובד") ולאפשר לפרפוסאט לחזור^{על עצמו 3}. עם זאת, נקודות הקצה הפיזיולוגיות העיקריות של העניין נותרו ללא שינוי. נקודות קצה כאלה כוללות מדדים של תפקוד התכווצות, הולכה חשמלית, חילוף חומרים לבבי ועמידות כלילית⁴.

כדי להעריך את תפקוד הלב בהכנת לב הצפרדע המקורית שלו, לנגנדורף מדד את המתח שנוצר על ידי התכווצות חדרית בציר האורך באמצעות תפר המחובר בין פסגת הלב לבין מתמר כוח. ⁵ התכווצות איזומטרית כומתה באופן זה עם מתח בסיסי המופעל על הלב בהיעדר מילוי חדרי. חידוד הגישה הוביל לבלונים מלאים בנוזלים שהוכנסו לחדר השמאלי דרך האטריום השמאלי כדי להעריך את ביצועי שריר הלב במהלך התכווצות איזובולומית⁶. כדי להעריך את קצב הלב ואת קצב הלב, ניתן להניח מוליכים על פני השטח על הקטבים של הלב כדי לאפשר לחוקרים להקליט את האלקטרוקרדיוגרמה. עם זאת, ניתן לצפות לברדיקרדיה יחסית, בהתחשב בניתוק העצבים המחייב. קצב חיצוני עשוי לשמש להתגברות על כך ולבטל את השתנות הדופק בין ניסויים¹. מדד תוצאה נוסף, חילוף החומרים של שריר הלב, ניתן להעריך על ידי מדידת תכולת החמצן והמצע המטבולי בפרפוזט ובשפכים הכליליים וחישוב ההפרש ביניהם⁷. כימות לקטט בשפכים הכליליים יכול לסייע באפיון תקופות של חילוף חומרים אנאירובי כפי שניתן לראות עם היפוקסיה, היפופרפוזיה, איסכמיה-רפרפוזיה או הפרעות מטבוליות⁷.

עבודתו המקורית של לנגנדורף אפשרה את חקר לב היונקים לשעבר, תוך שימוש בחתולים כנושא העיקרי⁵. הערכת לב החולדה המבודדת צברה פופולריות באמצע המאה ה-20 עם הווארד מורגן, שפירט את מודל החולדה "לב עובד" בשנת 1967⁵. השימוש בעכברים החל רק לפני 25 שנה בשל המורכבות הטכנית, שבריריות הרקמות וגודל הלב הקטן יחסית של מורין. למרות האתגרים הכרוכים בחקר עכברים, העלויות הנמוכות יותר והקלות של מניפולציה גנטית הגבירו את המשיכה והביקוש של תכשירי murine ex-vivo כאלה. למרבה הצער, היישום של הטכניקה הוגבל לבעלי חיים בוגרים, כאשר עכברים צעירים בני 4 שבועות הם הנבדקים הצעירים ביותר ששימשו למחקר ex-vivo עד לאחרונה ^8,9. בעוד שעכברים צעירים הם "לא בוגרים יחסית" בהשוואה למבוגרים, התועלת שלהם כנבדקים למחקרי ביולוגיה התפתחותית מוגבלת מכיוון שהם נגמלו, על פי רוב, מסכר הלידה שלהם ובקרוב יתחילו את^{גיל ההתבגרות 10}. גיל ההתבגרות מתרחש הרבה מעבר למעבר לאחר הלידה בניצול מצע שריר הלב מגלוקוז ולקטאט לחומצות שומן¹¹. לפיכך, רוב המידע על השינויים המטבוליים בלב היילודים נבע באופן היסטורי מעבודת ex-vivo במינים גדולים יותר כגון ארנבות וחזירי ים¹¹.

ואכן, קיימות גישות חלופיות להכנת לנגנדורף. אלה כוללים ניסויים במבחנה, אשר חסרים את כל הנתונים הפונקציונליים של האיבר ואת ההקשר, או מחקרי in vivo. זה יכול להיות מאתגר ומסובך מבחינה טכנית על ידי משתנים מבלבלים כגון ההשפעות הקרדיווסקולריות והנשימה של חומר הרדמה נדרש, ההשפעה של קלט נוירוהומורלי, ההשלכות של טמפרטורת הליבה, המצב התזונתי של החיה וזמינות המצע^12,13. מכיוון שגישת לנגנדורף מאפשרת לחקור את הלב המבודד-מחורר באופן אקס-ויוו באופן מבוקר יותר בהיעדר מבלבלים כאלה, היא הייתה וממשיכה להיחשב ככלי מחקרי רב עוצמה. לכן, הטכניקה המוצגת כאן מעניקה לחוקרים גישה ניסיונית למחקר ex-vivo של לב מורין שזה עתה נולד ומגבילה את הזמן לרפרפוזיה.

חקר הלב בתקופות של התפתחות הוא שיקול חשוב בהתחשב במעברים הביוכימיים, הפיזיולוגיים והאנטומיים הנרחבים המתרחשים במהלך התבגרות שריר הלב. מעברים מחילוף חומרים אנאירובי לזרחון חמצוני, שינויים בניצול המצע והתקדמות מהתפשטות תאים להיפרטרופיה הם תהליכים דינמיים המתרחשים באופן ייחודי בלב הלא בוגר^11,14. היבט קריטי נוסף של הלב המתפתח הוא שגורמי לחץ שנתקלים בהם בתקופות הכרחיות עשויים לייצר תגובות מוגברות בלב התינוק ולשנות את הרגישות העתידית לעלבונות בבגרות¹⁵. אף על פי שעבודה קודמת השתמשה בחולדות, כבשים וארנבות שזה עתה נולדו כדי לחקור את לב היילודים הנוקשה בלנגנדורף, יש צורך בהתקדמות המתירה שימוש בעכברים בהתחשב בחשיבותו של מין זה למחקר הביולוגיה ההתפתחותית¹⁶. כדי לענות על הצורך הזה, מודל הלב הנולד הראשון של מורין לנגנדורף באמצעות בעלי חיים בני 10 ימים הוקם לאחרונה⁶. מוצגת כאן שיטה המאפשרת שימורים מוצלחים של אבי העורקים ומבססת זלוף מדרדר של לב המורין המבודד שזה עתה נולד. גישה זו עשויה לשמש לפרמקולוגיה, איסכמיה-רפרפוזיה או מחקרי חילוף חומרים המתמקדים בתפקוד איברים שלמים או שניתן להתאים אותה לבידוד של קרדיומיוציטים.

Protocol

האישורים של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המרכז הרפואי של אוניברסיטת קולומביה התקבלו עבור כל השיטות שתוארו. סוג פראי C57Bl/6 זכר לאחר הלידה 10 עכברים שימשו למחקר.

1. הכנת מנגנון לנגנדורף

1. כדי למזער את המורכבות, השתמש בפרפוסאט מחומצן שאינו משחזר בתוך מנגנון לנגנדורף (ראו טבלת חומרים) באמצעות זרימה קבועה או לחץ קבוע.
   1. השתמש במאגר Krebs-Henseleit (KHB), המכיל 120 mmol/L של NaCl, 4.7 mmol/L של KCl, 1.2 mmol/L של MgSO₄, 1.2 mmol/L של KH₂PO₄, 1.25 mmol/L של CaCl₂, 25 mmol/L של NaHCO₃, ו-11 mmol/L של גלוקוז ב-pH 7.4 (ראו טבלת חומרים), שיווי המשקל עם 95% מ-O₂ ו-5% מה-CO₂ במנגנון לנגנדורף ושמור על 37 מעלות צלזיוס.
2. עבור גישת הזרימה הקבועה, שמור על קצב זרימה רציף של ~2.5 מ"ל∙^min-1.
   הערה: קצב זרימה זה יעריך זרימה כלילית של ~75-80 מ"ל/גרם∙min, בהתחשב בכך שהמשקל הממוצע של לב עכבר בן 10 ימים (P10) הוא ~ 30 מ"ג^17,18.

2. ייצור צינורית אבי העורקים

1. צרו את צינורית אבי העורקים של העכבר שזה עתה נולד ממחט נירוסטה 26 גרם (ראו טבלת חומרים). באמצעות מספריים חדים, חתכו את קצה המחט כדי להקהות את הקצה. היזהרו שלא לכווץ או להגביל את קוטר לומן המחט. החליקו את קצה החתך והסירו את כל הבורות על ידי גירוד עדין של הקצה הקהה על ספסל המעבדה באמצעות תנועה הלוך ושוב.
   הערה: יש להסיר פיתולים מיקרוסקופיים וקצוות חדים מכיוון שהם עלולים לקרוע את אבי העורקים של העכבר שזה עתה נולד ולפגוע במסתם אבי העורקים. לחלופין, השתמשו בנייר זכוכית עם חצץ עדין.
2. חברו את הצינורית המפוברקת למנגנון לנגנדורף והעריכו את הזרימה וההתנגדות. מדידת קצבי הזרימה דרך הצינורית על ידי איסוף ומדידה של כמות המאגר לאורך פרק זמן ידוע. ודא שהזרימה בפועל שווה לקצב הזרימה הקבוע של 2.5 מ"ל ^min-1.
3. לכמת את הפרש הלחץ על פני הצינורית עם KHB זורם על ידי ביצוע השלבים הבאים.
   1. מדידת לחץ במערכת עם ובלי הצינורית המפוברקת המחוברת.
   2. מחלקים את הפרשי הלחץ על פני צינורית לפי קצב הזרימה כדי לקבל התנגדות צינורית לפי חוק אוהם¹⁵.
   3. ודא שהתנגודת המפוברקת בפני צינורית כוללת כ-16.0 ± 1.9 מ"מ כספית∙דקות∙^mL-1 מתוך ההתנגדות הכוללת⁶. התנגדות מוגזמת מרמזת על לומן צינורית שעלולה להיפגע.
      הערה: חישוב לדוגמה: P_{עם צינורית} - P _{ללא צינורית} = ΔP. אם P_עם = 48 ו- P_ללא = 8 אז ΔP = 40. בקצב זרימה (Q) של 2.5 מ"ל ^{min-1 ו-} ΔP של 40 התנגדות צינורית שווה 16 מ"מ כספית∙min∙min∙^mL-1 באמצעות R = ΔP/Q = 40 / 2.5 = 16.
4. הסר את צינורית 26 G והצמד את הצינורות בלחץ גבוה (ראה טבלת חומרים) לאתר התותח במנגנון לנגנדורף. חברו את צינורית אבי העורקים לקצה הדיסטלי של הצינורות. יש לשחרר את האוויר מהצינורות ואת הצינורית עם חיץ מחומצן, מה שמבטיח שכל הבועות יוסרו.
   הערה: השימוש בצינורות בלחץ גבוה באופן זה מאפשר להרחיב את הצינורית למצב מרוחק יותר. זה הכרחי כדי לאפשר תותח אבי העורקים עם מיקרוסקופ ניתוח הסמוך להגדרה (איור 1).

3. קצירת איברים

1. עכברים נוגדי חמצון באמצעות הזרקה תוך-צפקית (IP) של הפרין (10 kU/kg) (ראו טבלת חומרים) כדי למנוע היווצרות של מיקרותרומבי כלילי באמצעות מחט 26 G על מזרק 1 מ"ל. אפשר כמה דקות עבור הפרין להסתובב לפני שתמשיך עם הזרקה של כל הרדמה.
2. מרדימים את החיה בהזרקת IP באמצעות מחט 26 גרם על מזרק 1 מ"ל.
   הערה: חיוני לעקוב בקפידה אחר החיה לאחר הזרקת הרדמה כדי למנוע דום נשימה והיפוקסיה שלאחר מכן. פנטוברביטל (70 מ"ג/ק"ג) הוא בחירה אמינה של הרדמה, שכן הוא מאפשר התפרצות מהירה של הרגעה מבלי לגרום לדום נשימה^19,20. ניתן להשתמש בחומרי הרדמה אחרים, בתנאי שהמינונים המשמשים אינם גורמים לדום נשימה²¹. החוקרים צריכים לשקול את ההשפעות של תרופות הרגעה-היפנוזה חלופיות על תפקוד הלב^22,23. נקע צוואר הרחם כמצב עיקרי של המתת חסד עלול להאריך היפוקסיה טרום-קנולציה ואיסכמיה.
3. מניחים את העכבר במצב שכיבה ומאבטחים את הגפיים מיד עם אובדן ההכרה. השתמש במחטים היפודרמיות קטנות כדי לאבטח כל איבר. התחילו לקצור ברגע שהחיה לא מגיבה לצביטת הבוהן; החיה צריכה לנשום באופן ספונטני במהלך הנתיחה הראשונית.
4. בצעו חתך תת-אקסיפואידי רוחבי לרוחב החיה כדי לחשוף את חלל הבטן באמצעות מספריים חותכים ישרים (ראו טבלת חומרים).
   הערה: טכניקה סטרילית אינה הכרחית בהתחשב בכך שההליך מייצג ניתוח שאינו סחיר.
   1. זהה את הסרעפת בצורה מעולה והתעלה לחלוטין את החלק הקדמי. חותכים את הצלעות באופן דו-צדדי לאורך קו אמצע בית השחי בכיוון של צפאלאד. בקשו מעוזר לתפוס את התהליך ה-xiphoid עם מלקחיים ולשקף את עצם החזה והצלעות באופן קרניאלי כדי לחשוף את איברי בית החזה.
5. זהה את הווריד הנבוב התחתון התת-דיאפרמטי (IVC) מעל הכבד. בצעו את ה-IVC עם מספריים קשתית מעוגלים תוך שמירה על מתח קדמי וצפאלאד קל על המקטע הפרוקסימלי עם מלקחיים קשתיים (ראו טבלת חומרים).
   1. חותכים אחורית לאורך המשטח הקדמי של עמוד השדרה באמצעות מספריים קשתיים מעוקלים תוך משיכת ה-IVC למעלה והחוצה מחלל בית החזה. כאשר הלב מגויס, זווית את המספריים קדימה ולנתק את כלי הדם הגדולים בצורה מעולה כדי להסיר לחלוטין את הלב והריאות.
      הערה: שיטה זו מאפשרת התפשטות מהירה של הלב והריאות בגוש.
6. מיד להטביע את הדגימה ב- KHB קר כקרח או מלוחים. הלב צריך להפסיק לפעום תוך שניות.

4. תותח

1. חותכים פיסת מגבת נייר ומניחים אותה בתחתית צלחת פטרי רדודה כדי לספק חיכוך לייצוב הלב במהלך התותח. לחים עם KHB קר כקרח כדי למנוע מהלב לדבוק בו.
   1. הניחו את צלחת הפטרי המוכנה מתחת למיקרוסקופ הניתוח והתאימו את המיקוד. מניחים את צינורית אבי העורקים המחוברת לצינורות ההרחבה בלחץ גבוה מתחת למיקרוסקופ הניתוח יחד עם תפר משי 5-0 שנקשר באופן רופף סביב רכזתו (ראו טבלת חומרים).
      הערה: יש לנקוט בזהירות כדי להגביל את כמות הנוזלים בצלחת פטרי מכיוון שהריאות מלאות האוויר יכולות לצוף ולגרום לאיברים שנכרתו לזוז.
2. מניחים את איברי החזה הנכורים בצלחת הפטרי. תחת המיקרוסקופ, זהה את התימוס על ידי הברק הלבן שלו ושתי אונות וכיוון את הדגימה כך שהתימוס יהיה קדמי ועליון²⁴. זה יבטיח אוריינטציה נכונה של הלב.
3. באמצעות מלקחיים, מפרידים באופן בוטה את האונות של התימוס כדי לחשוף את הכלים הגדולים. זהה את אבי העורקים על ידי איתור תכונות הסתעפות מבדילות של קשת אבי העורקים.
   הערה: גוון סגול כהה תוחם לעתים קרובות את החדר הימני ואת עורק הריאה. אבי העורקים העולה ממוקם בין עורק הריאה הראשי לאטריום הימני.
4. טרנסקט את אבי העורקים עם מספריים חדים עדינים (ראו טבלת חומרים) רק קרובים להמראה של העורק התת-קלבי.
   הערה: אם אבי העורקים מועבר קרוב מדי למסתם אבי העורקים, לא תהיה מספיק רקמת אבי העורקים כדי לאפשר את אבטחת הצינורית. לחלופין, אם אבי העורקים עובר טרנסקטציה גבוהה מדי, פרפוסאט יכול לדלוף מתוך ענף אבי העורקים אחד או יותר (כגון העורק התת-קלבי).
5. יש לאחוז בעדינות באבי העורקים המחולק באמצעות מלקחיים מעוקלים עדינים בסגנון צורף (ראו טבלת חומרים). בזהירות cannulate אבי העורקים עם מחט קהה 26 G, תוך הקפדה לא לפגוע בשסתום אבי העורקים. החזק במקומו על ידי אחיזת אבי העורקים עם המלקחיים המעוקלים העדינים סביב הצינורית. לאחר קביעת השליטה באבי העורקים, יש ליזום פרפוזיה מדרדרת כדי להגביל את הזמן האיסכמי.
   הערה: הלב צריך להתחיל לפעום ויהיה חיוור כאשר הדם מתרוקן מבשר הלב ו- KHB מנקב את העורקים הכליליים. כישלון לפעום באופן ספונטני, נוכחות של גודש חדרי, או חוסר שינוי צבע של הלב מצביעים על צינורית מפולפלת.
6. בקשו מהעוזר לתפוס את קצות התפר הקשור באופן רופף ולעטוף בזהירות את אבי העורקים סביב הצינורית. יש לדחוס את התפר מעל או מתחת למלקחיים העדינים המעוקלים (המחזיקים את הצינורית במקומה), בהתאם לכמות רקמת אבי העורקים והשיקולים האנטומיים. להדק את התפר ולאשר את הלימות הזרימה הכלילית.
7. נתקו את הצינורות בלחץ גבוה ממנגנון לנגנדורף. תפסו את רכזת הצינורית ונתקו את המחט הבוטה מצינורות ההרחבה בלחץ גבוה. חבר במהירות את רכזת הצינורית למנגנון.
   הערה: יש להקפיד שלא לנתק את הלב או להכניס אוויר לתוך הצינורית.
8. ברגע שהלב נתלה על מנגנון לנגנדורף בתנוחה הרגילה, ומאושרת זלוף הולם, לקצץ בזהירות את הריאות, התימוס והרקמות העודפות. תנסה את האטריום הנכון כדי לאפשר לשפכי סינוסים כליליים לטפטף בחופשיות.

5. מדידה פונקציונלית

1. צור קשר קטן בקצה תפר משי 5-0 (מחובר למחט מעוקלת). חודרים חתיכה קטנה של סרט פרפין (2-3 מ"מ x 2-3 מ"מ) עם המחט ומחליקים את הפרפין לקצה הקשר. מעבירים בזהירות את המחט דרך פסגת החדר ומושכים את התפר דרך הלב עד שסרט הפרפין נצמד אל הקיר הצדדי של החדר.
   הערה: סרט הפרפין עוזר למנוע מהקשר לקרוע את הלב ולמשוך דרך החדר.
2. מעבירים את המחט דרך פתח מעיל החימום מלא המים של מנגנון לנגנדורף. כעת ניתן לעטוף את הלב ולחמם אותו.
3. חברו את המחט למתמר הכוח (ראו טבלת חומרים) באופן שימנע את טפטוף הסינוסים הכליליים. התאם את התפר כדי להחיל 1-2 גרם של מתח בסיסי, כפי שמעיד המתח הדיאסטולי או השפל במעקב אחר מתח.
   הערה: הימנעו ממשיכת הלב מהצינורית או מפיתול אבי העורקים, ובכך התפשרו על זלוף כלילית.
4. הניחו אלקטרודות פני שטח על הקטבים העליונים והנחותים של הלב כדי לתעד את האלקטרוקרדיוגרמה.
   הערה: השתמש בחוט קצב אפיקרדיאלי זמני לילדים עם הסרת המחט עבור אלקטרודת פני שטח גמישה המחוברת ל- Bio Amp (ראה טבלת חומרים).
5. דגימת שפכים של סינוסים כליליים לניתוח באמצעות קטטר 24 G IV (ראו טבלת חומרים).
6. הפחת את עמידות הצינורית מההתנגדות הכוללת של המערכת כדי לקבל עמידות כלילית לפי חוק קירכהוף²⁵.

תוצאות

עכברי P10 שימשו כדי לדגום נקודת זמן בינקות אנושית ^26,27. 15 לבבות עכברים מבודדים מדגם C57Bl/6 נקטפו ונלקחו בהצלחה. לבבות היו חדורים עם זרימה רציפה של 2.5 מ"ל ^min-1 של KHB מחומצן מחומם. נמדדו פרמטרים מטבוליים, כולל מיצוי גלוקוז, צריכת חמצן, ייצור לקטט ופרמטרים פיזיולו?...

Discussion

העבודה הנוכחית מתארת תותח אבי העורקים מוצלח וזלוף מדרדר בלב העכבר המבודד. חשוב מכך, הוא מאפשר לחוקרים להתגבר על המחסומים שגיל מורין הצעיר וגודל הלב הקטן הציגו בעבר⁸. הגישה אמנם אינה מורכבת בעיצובה, אך דורשת מידה משמעותית של מיומנות טכנית. צעדים מרכזיים שבהכרח יאתגרו אפילו את ה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rodent Langendorff Apparatus	Radnoti	130102EZ
24 G catheter	BD	381511
26 G needle on 1 mL syringe combo	BD	309597
26 G steel needle	BD	305111
5-0 Silk Suture	Ethicon	S1173
Bio Amp	ADInstruments	FE135
Bio Cable	ADInstruments	MLA1515
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901-100G
Circulating heating water Bath	Haake	DC10
curved iris scissor	Medline	MDS10033Z
dissecting microscope	Nikon	SMZ-2B
find spring scissors	Kent	INS600127
Force Transducer	ADInstruments	MLT1030/D
glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G
Heparin	Sagent	400-01
High pressure tubing	Edwards Lifesciences	50P184
iris dressing forceps	Kent	INS650915-4
Jeweler-style curved fine forceps	Miltex	17-307-MLTX
KCl	Sigma-Aldrich	P3911-25G
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662-25G
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506-500G
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888-25G
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014-25G
Roller Pump	Gilson	Minipuls 3
straight dissecting scissors	Kent	INS600393-G
Temporary cardiac pacing wire	Ethicon	TPW30
Wide Range Force Transducer	ADInstruments	MLT1030/A