Un modelo confiable de colgajo fascio-cutáneo porcino para estudios de bioingeniería de aloinjertos compuestos vascularizados

Resumen

El presente protocolo describe el modelo de colgajo fascio-cutáneo porcino y su uso potencial en la investigación de tejidos compuestos vascularizados.

Resumen

Los aloinjertos compuestos vascularizados (VCA), como el trasplante de mano, cara o pene, representan el tratamiento de vanguardia para defectos cutáneos devastadores, fallidos por los primeros pasos de la escalera reconstructiva. A pesar de los prometedores resultados estéticos y funcionales, el principal factor limitante sigue siendo la necesidad de una inmunosupresión de por vida aplicada drásticamente y sus riesgos médicos bien conocidos, evitando indicaciones más amplias. Por lo tanto, levantar la barrera inmune en VCA es esencial para inclinar la balanza ética y mejorar la calidad de vida de los pacientes utilizando las técnicas quirúrgicas más avanzadas. La creación de novo de un injerto específico para el paciente es el próximo avance en el trasplante reconstructivo. Utilizando técnicas de ingeniería tisular, los VCA pueden liberarse de células donantes y personalizarse para el receptor a través de la perfusión-descelularización-recelularización. Para desarrollar estas nuevas tecnologías, es necesario un modelo de VCA animal a gran escala. Por lo tanto, los colgajos fascio-cutáneos porcinos, compuestos de piel, grasa, fascia y vasos, representan un modelo ideal para estudios preliminares en VCA. Sin embargo, la mayoría de los modelos VCA descritos en la literatura incluyen músculo y hueso. Este trabajo reporta una técnica confiable y reproducible para la cosecha de colgajo fascio-cutáneo safeno en cerdos, una herramienta práctica para diversos campos de investigación, especialmente la ingeniería de tejidos compuestos vascularizados.

Introducción

Los aloinjertos compuestos vascularizados (VCA) han revolucionado el tratamiento de las pérdidas de partes del cuerpo difíciles de reparar, como las manos, la cara y el pene ^1,2,3. Desafortunadamente, los primeros resultados a largo plazo⁴ han demostrado que la administración a lo largo de toda la vida de agentes inmunosupresores en dosis altas puede conducir a afecciones médicas colaterales graves, como diabetes, infecciones, neoplasia y disfunción renovascular⁵. Últimamente, los equipos expertos de VCA han tenido que gestionar el riesgo de rechazo crónico que conduce a la pérdida del injerto y realizar los primeros casos de retrasplante de cara ^6,7. Se han descrito diferentes estrategias para superar las limitaciones de la inmunosupresión en VCA. El primero se basa en establecer tolerancia al injerto a largo plazo mediante la inducción de un estado de quimerismo mixto inmune en el receptor del aloinjerto ^8,9. El segundo implica la creación de novo de un injerto específico para el paciente a través de la ingeniería de tejidos.

Recientemente, la descelularización por perfusión de tejidos biológicos ha generado andamios nativos de matriz extracelular (MEC), permitiendo la preservación de la red vascular y la arquitectura tisular de órganos enteros¹⁰. Por lo tanto, la recelularización de estas ECM con células específicas del receptor crearía un injerto personalizado libre de restricciones inmunes. En la investigación sobre bioingeniería VCA, múltiples equipos han descelularizado y obtenido dicha ECM preservando toda la arquitectura^11,12,13. Sin embargo, el proceso de recelularización sigue siendo desafiante y no ha tenido éxito en modelos animales grandes^14,15. El desarrollo de estas tecnologías innovadoras crea la necesidad de modelos de tejido compuesto de animales grandes fiables y reproducibles. Los modelos porcinos representan la mejor opción en la línea de desarrollo de la bioingeniería, ya que la piel porcina presenta las características anatómicas y fisiológicas más cercanas a la piel humana¹⁶. El uso de colgajos fasciocutáneos (FCF) es ideal durante los primeros pasos hacia la creación de injertos de tejido compuesto vascularizados "a medida". De hecho, FCF es un modelo elemental de VCA que contiene piel, grasa, fascia y células endoteliales. Una descripción de los colgajos miocutáneos porcinos¹⁷ y los colgajos osteomiocutáneos¹⁸ se puede encontrar en la literatura. Sin embargo, hay una falta de enfoque en las técnicas de recolección de colgajos fascio-cutáneos.

Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo proporcionar a los investigadores una descripción detallada de una técnica de obtención de FCF safena porcina y representar todas las características del colgajo para su uso en muchos campos de investigación, especialmente en ingeniería de tejidos compuestos vascularizados.

Protocolo

Todos los animales recibieron atención humana siguiendo la Guía del Instituto Nacional de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales aprobó el protocolo experimental (IACUC- protocolo #2020N000015). Se utilizaron siete cerdos hembras de Yorkshire (20-25 kg) para todos los experimentos.

1. Cuidados preoperatorios

1. Ayune al animal para obtener alimentos sólidos 12 h antes de la cirugía.
2. Sedar al animal con 4,4 mg/kg de telazol, 2,2 mg/kg de xilazina y 0,04 mg/kg (IM) de sulfato de atropina (ver Tabla de materiales).
3. Coloque un catéter intravenoso periférico de 18 G en una vena del oído.
4. Intubar a los cerdos con un tubo endotraqueal apropiado (se pueden usar 6-15 mm para cerdos de 10-200 kg) y conectar el tubo a un ventilador. Administrar analgesia preoperatoria con buprenorfina (0,05 mg/kg, IM) (ver Tabla de Materiales).

2. Monitorización intraoperatoria

1. Mantener la anestesia con una mezcla de inhalación de isoflurano al 1,5%-3% con flujo de oxígeno de 1,5 L/min.
2. Controle continuamente la frecuencia cardíaca, la oximetría de pulso y el_CO2 espiratorio final. Evalúe la presión arterial y la temperatura corporal cada 5 minutos.
   NOTA: El rango objetivo para la frecuencia cardíaca está entre 90-100 latidos / min, la saturación de oxígeno debe ser superior al 93% y el rango de_CO2 al final de la espiración está entre 5% -6% de CO₂.
3. Administrar 5-10 mL/kg por hora de solución salina al 0,9% durante todo el procedimiento para regular la presión arterial media entre 60 mmHg y 90 mmHg.

3. Contratación bilateral de FCF safena

1. Coloque al animal en posición supina. Afeite y frote tanto las ingles como las extremidades posteriores, incluya todas las extremidades posteriores en el sitio quirúrgico y cubra de manera estéril.
2. Palpar el pulso de la arteria safena ~ 3 dedos de ancho medial desde la rótula y etiquetarlo.
3. Identifica y dibuja los límites de la solapa.
   NOTA: El límite superior es un eje paralelo al pliegue inguinal 3 cm por debajo de él. El límite lateral es un eje desde la columna ilíaca superior anterior hasta la parte medial de la rótula.
4. Dibujar un colgajo ovalado de 10 cm de diámetro centrado en el pedículo safeno y contenido en los límites del colgajo descritos anteriormente (paso 3.3).
5. Haga una incisión cutánea de 1,5 cm con respecto a la porción distal del pedículo en el punto de referencia del colgajo.
6. Abrir la fascia y disección roma para exponer la arteria safena y sus dos venas comitantes. Realizar una ligadura doble y separar en un solo paquete.
7. Incise la piel restante del colgajo con una cuchilla.
8. Use cauterio para abrir el tejido subcutáneo y la fascia circundante. Realice una hemostasia completa con fórceps bipolares (consulte la Tabla de materiales).
9. Fije el componente de la piel del colgajo a la fascia subyacente con suturas 3-0 no absorbibles para evitar la tracción inadvertida y la interrupción de los vasos perforantes.
10. Libere el colgajo de la gracilis diseccionando la fascia lejos del músculo.
    NOTA: La parte distal del pedículo safeno corre en un plano entre el músculo gracilis y la fascia. La tensión adecuada y la hemostasia bipolar cautelosa de las ramas laterales son elementos cruciales para facilitar la disección pedicular.
11. Use un bisturí para hacer una incisión de 12 cm en el pliegue inguinal. Realizar una incisión perpendicular uniendo el pliegue inguinal a la parte proximal del colgajo. Levante la piel de conexión y abra la capa subcutánea con cauterio.
12. Continúe la disección pedicular siguiendo los vasos safenos hacia abajo hacia los vasos femorales.
    NOTA: La porción proximal del pedículo safeno puede correr a través del tabique intermuscular o sumergirse en el músculo gracilis.
13. Esqueletizar los vasos femorales y ligarlos distalmente a la rama safena en dos haces separados. Continuar la disección de los vasos femorales de distal a proximal hasta alcanzar el nivel del ligamento inguinal. Use fórceps bipolares para cauterizar o clips vasculares y lazos de seda 2-0 para ligar los vasos femorales profundos, luego corte.
    NOTA: Los clips vasculares también se pueden usar antes de cortar los vasos.
14. Repita los pasos 3.2-3.13 en la extremidad posterior contralateral para cosechar el segundo colgajo safeno.
15. Heparinizar al animal con una inyección intravenosa (IV) de heparina (100 UI/kg) 5 min antes del paso 3.16.
16. Ligate el pedículo femoral (arteria y vena) lo más proximal posible al ligamento inguinal y separa el colgajo del cerdo donante.
17. Dilatar los extremos del vaso femoral e insertar un angiocatéter de 20 G tanto en la arteria como en la vena. Use lazos de seda 3-0 para asegurar el catéter a los vasos.
18. Enjuague lentamente la arteria fascio-cutánea con 10 ml de solución salina de heparina (100 UI/ml) hasta que se observe una salida venosa clara (Figura 1).

Figura 1: Colgajo fasciocutáneo safeno nativo y descelularizado. (A) Colgajo cutáneo aislado con un angiocatéter de 20 G insertado en la arteria femoral, que permite lavar el colgajo de la sangre y proceder a diferentes experimentos (angiografía, descelularización por perfusión). (B) Colgajo de piel descelularizado. Descelularización de perfusión que produce andamios blancos acelulares después de 10 días de perfusión detergente. Secciones transversales de espesor total teñidas con H&E de (C) colgajo de piel nativa y (D) colgajo de piel descelularizado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

19. Eutanasia al animal con una inyección intravenosa de fenobarbital sódico (100 mg/kg). Confirmar la muerte por la ausencia de latidos cardíacos y movimientos respiratorios.

Resultados

Este trabajo en animales vivos fue precedido por la determinación del perforasoma safeno en tres especímenes cadavéricos (Figura 2). Se inyectó una solución de relleno coloreada en la arteria safena para opacificar la red vascular específica proveniente de la arteria. La solución está compuesta de 10 ml de agente de glicerina de color azul mezclado con 10 ml del agente diluyente (ver Tabla de materiales). Esto generó un mapa coloreado de la piel vascularizada por la...

Discusión

Este artículo describe un colgajo fasciocutáneo confiable y reproducible cosechado en extremidades posteriores porcinas. Seguir este protocolo quirúrgico paso a paso permitirá la obtención de dos colgajos en un solo animal en menos de 2 h. El paso más crítico de la cirugía es la esqueletización del pedículo vascular dentro de las fibras musculares de gracilis, que requiere una disección completa por parte de un cirujano experto. Asegurar la piel a la fascia con suturas cutáneas es un consejo crucial para evit...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G angiocatheter	BD Insyte Autoguard	381409
20 G angiocatheter	BD Insyte Autoguard	381411
Adson Tissue Forceps, 11 cm, 1 x 2 Teeth with Tying Platform	ASSI	ASSI.ATK26426
Atropine Sulfate	AdvaCare	212-868
Bipolar cords	ASSI	228000C
Buprenorphine HCl	Pharmaceutical, Inc	42023-179-01
Dilating Forceps	Fine science tools (FST)	18131-12
Endotrachel tube	Jorgensen Labs	JO615X	size from 6 to 15mm depending on the pig weight
Ethilon 3-0 16 mm 3/8	Ethicon	MPVCP683H
Euthasol	Virbac AH	200-071
Heparin Lock Flush Solution, USP, 100 units/mL	BD PosiFlush	306424
Isoflurane	Patterson Veterinary	14043-704-06
Jewelers Bipolar Forceps Non Stick 11 cm, straight pointed tip, 0.25 mm tip diameter	ASSI	ASSI.BPNS11223
Metzenbaum scissors 180 mm	B Braun	BC606R
Microfil blue	Flow tech	LMV-120
Microfil dilution	Flow tech	LMV-112	colored filing solution
Monopolar knife	ASSI	221230C
N°15 scalpel blade	Swann Morton	NS11
Omnipaque	General Electric	4080358	contrast product
Perma-Hand Silk 3-0	Ethicon	A184H
Small Ligaclip	Ethicon	MCM20
Stevens scissors 115 mm	B Braun	BC008R
Telazol	Zoetis	106-111
Xylamed (xylazine)	Bimeda	200-529