血管化複合同種移植片バイオエンジニアリング研究のための信頼性の高いブタ筋膜皮膚フラップモデル

要約

本プロトコルは、ブタ筋膜皮膚皮弁モデルおよび血管新生複合組織研究におけるその潜在的な使用について説明しています。

要約

手、顔、陰茎移植などの血管化複合同種移植片(VCA)は、再建のはしごの最初のステップで失敗した壊滅的な皮膚の欠陥の最先端の治療法を表しています。有望な審美的および機能的転帰にもかかわらず、主な制限要因は、生涯にわたる免疫抑制とそのよく知られた医学的リスクの必要性であり、より広範な適応症を妨げています。したがって、VCAの免疫バリアを解除することは、倫理的尺度を傾け、最先端の外科的技術を使用して患者の生活の質を向上させるために不可欠です。患者特異的移植片の de novo の作成は、再建移植における今後のブレークスルーです。組織工学技術を使用して、VCAをドナー細胞から解放し、灌流-脱細胞化-再細胞化を通じてレシピエントに合わせてカスタマイズすることができます。これらの新技術を開発するためには、大規模な動物VCAモデルが必要です。したがって、皮膚、脂肪、筋膜、および血管で構成されるブタ筋膜皮膚フラップは、VCAでの予備研究の理想的なモデルを表しています。それにもかかわらず、文献に記載されているほとんどのVCAモデルには、筋肉と骨が含まれています。この研究は、豚の伏在筋膜皮膚皮弁採取のための信頼性が高く再現性のある技術であり、さまざまな研究分野、特に血管新生複合組織工学の実用的なツールであると報告しています。

概要

血管化複合同種移植片(VCA)は、手、顔、陰茎などの修復が困難な身体部分の損失の治療に革命をもたらしました^1,2,3。残念ながら、最初の長期アウトカム⁴は、高用量免疫抑制剤の生涯投与が、糖尿病、感染症、新生物、腎血管機能障害などの重篤な側副病状につながる可能性があることを示しています⁵。最近、専門家のVCAチームは、移植片の喪失につながる慢性的な拒絶反応のリスクを管理し、最初の顔の再移植症例を実行しなければなりませんでした^6,7。VCAにおける免疫抑制の限界を克服するために、さまざまな戦略が説明されています。第1は、同種移植レシピエントにおいて免疫混合キメラ状態を誘導することによって長期移植片耐性を確立することに依存する^8、9。2つ目は、組織工学による患者特異的移植片のde novo作成です。

最近、生物学的組織の灌流脱細胞化は、天然の細胞外マトリックス(ECM)足場を生成し、器官全体の血管網および組織構造の保存を可能にしている¹⁰。したがって、レシピエント特異的細胞によるこれらのECMの再細胞化は、免疫制約のないカスタマイズされた移植片を作成します。VCAバイオエンジニアリングの研究では、複数のチームが脱細胞化し、アーキテクチャ全体を保存するそのようなECMを取得しました^11、12、13。しかしながら、再細胞化プロセスは依然として困難であり、大型動物モデルでは成功していない^14、15。これらの画期的な技術を開発することで、信頼性が高く再現性のある大型動物複合組織モデルの必要性が生まれます。ブタの皮膚はヒトの皮膚に最も近い解剖学的および生理学的特徴を示すため、ブタモデルはバイオエンジニアリング発生パイプラインにおける最良の選択を表しています¹⁶。筋膜皮膚フラップ(FCF)の使用は、「調整された」血管新生複合組織移植片の作成に向けた最初のステップで理想的です。実際、FCFは、皮膚、脂肪、筋膜、および内皮細胞を含む基本的なVCAモデルです。ブタ筋皮膚フラップ¹⁷ および骨筋皮膚フラップ¹⁸ の説明は、文献に見出すことができる。それにもかかわらず、筋膜皮膚フラップ収穫技術への焦点が不足しています。

したがって、この研究は、研究者に豚伏在FCF調達技術の詳細な説明を提供し、多くの研究分野、特に血管新生複合組織工学で使用するためのフラップのすべての特性を示すことを目的としています。

プロトコル

すべての動物は、実験動物の世話と使用のための国立衛生研究所のガイドに従って人間の世話を受けました。施設動物管理および使用委員会は、実験プロトコル(IACUC-プロトコル#2020N000015)を承認しました。7匹の雌ヨークシャーブタ(20〜25kg)を全ての実験に使用した。

1.術前ケア

1. 手術の12時間前に固形食のために動物を絶食させる。
2. 4.4 mg / kgのテラゾール、2.2 mg / kgのキシラジン、および0.04 mg / kg(IM)の硫酸アトロピンで動物を鎮静させます( 材料の表を参照)。.
3. 18Gの末梢静脈内カテーテルを耳静脈に配置します。
4. 適切な気管内チューブ(10〜200 kgの豚には6〜15 mmを使用できます)で豚を挿管し、チューブを人工呼吸器に接続します。ブプレノルフィン(0.05 mg / kg、IM)による術前鎮痛を投与します( 材料の表を参照)。.

2.術中モニタリング

1. 1.5 L / minの酸素流を含む1.5%〜3%イソフルランの吸入混合物で麻酔を維持します。.
2. 心拍数、パルスオキシメトリ、潮汐終末CO₂を継続的に監視します。5分ごとに血圧と体温を評価します。
   注意: 心拍数の目標範囲は90〜100ビート/分で、酸素飽和度は93%より高くなければならず、潮汐終末CO 2範囲はCO₂の5%〜6%です。
3. 手順全体を通して毎時5〜10 mL / kgの0.9%生理食塩水を投与して、平均動脈圧を60 mmHgから90 mmHgに調節します。.

3. 二国間FCF調達

1. 動物を仰臥位に置きます。鼠径部と後肢の両方を剃ってこすり洗いし、後肢全体を手術部位に含め、滅菌方法でドレープします。
2. 膝蓋骨の内側にある伏在動脈~3本の指幅の脈拍を触診し、タグを付けます。
3. フラップの限界を特定して描画します。
   注:上限は、その3cm下の鼠径部のしわに平行な軸です。外側の限界は、上腸骨前棘から膝蓋骨の内側部分までの軸です。
4. 伏在茎を中心とし、前述のフラップ制限に含まれる直径10cmの楕円形状のフラップを描きます(ステップ3.3)。
5. フラップランドマークの茎の遠位部分に関して1.5cmの皮膚切開を行います。
6. 筋膜を開き、鈍い解剖をして伏在動脈とその2つの大静脈を露出させます。二重合字を実行し、1つのバンドルに分けます。
7. フラップの残りの皮膚を刃で切開します。
8. 焼灼を使用して皮下組織と周囲の筋膜を開きます。双極鉗子を使用して徹底的な止血を行います( 材料の表を参照)。
9. フラップの皮膚成分を下にある筋膜に3-0の非吸収性縫合糸で取り付けて、不注意による牽引や穿孔血管の破壊を防ぎます。
10. 筋膜を筋肉から離して解剖することにより、フラシリスからフラップを解放します。
    注:伏在茎の遠位部分は、グラシリス筋と筋膜の間の平面を走っています。側枝の適切な緊張と慎重な双極性止血は、茎の解剖を容易にするための重要な要素です。
11. メスを使用して、鼠径部のしわを12cm切開します。鼠径部のしわをフラップの近位部に接合する垂直切開を行います。接続している皮膚を持ち上げ、焼灼を使用して皮下層を開きます。
12. 伏在血管を大腿骨血管に向かってたどって椎弓根解剖を続けます。
    注:伏在茎の近位部分は、筋肉間中隔を通過するか、グラシリス筋に飛び込むことができます。
13. 大腿骨血管を骨格化し、2つの別々の束で伏在枝に遠位に結紮します。鼠径靭帯のレベルに達するまで、大腿骨血管の遠位から近位まで解剖を続ける。双極鉗子を使用して血管クリップを焼灼するか、2-0シルクタイを使用して大腿骨深部血管を結紮してから切断します。
    注意: 血管を切断する前に血管クリップを使用することもできます。
14. 反対側の後肢で手順3.2〜3.13を繰り返して、2番目の伏在皮弁を収穫します。
15. ステップ3.16の5分前に静脈内(IV)ヘパリン注射(100IU / kg)で動物をヘパリン化します。.
16. 大腿骨茎(動脈と静脈)を鼠径靭帯のできるだけ近位に結睭を付け、フラップをドナーブタから分離します。
17. 大腿血管の端を拡張し、動脈と静脈の両方に20Gの血管カテーテルを挿入します。3-0シルクタイを使用してカテーテルを血管に固定します。
18. 明確な静脈流出が観察されるまで、筋膜皮膚皮弁動脈を10 mLのヘパリン生理食塩水(100 IU / mL)でゆっくりと洗い流します(図1)。

図1:ネイティブおよび脱細胞化された伏在筋膜皮膚フラップ 。 (A)大腿動脈に挿入された20G血管カテーテルを備えた孤立した皮膚フラップにより、血液からフラップを洗い流し、さまざまな実験(血管造影、灌流脱細胞化)を進めることができます。(B)脱細胞化皮膚フラップ。灌流脱細胞化により、10日間の界面活性剤灌流後に白色の無細胞足場が得られます。H&E染色された(C)天然皮膚皮弁および(D)脱細胞化皮膚皮弁の全層断面。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

19. フェノバルビタールナトリウム(100 mg / kg)のIV注射で動物を安楽死させます。.心拍や呼吸運動がないことで死亡を確認します。

結果

生きている動物に関するこの研究は、3つの死体標本上の伏在性穿孔を決定することによって先行されました(図2)。着色された充填溶液を伏在動脈に注入して、動脈から来る特定の血管網を不透明にしました。この溶液は、10 mLの青色グリセリン剤と10 mLの希釈剤を混合して構成されています( 材料の表を参照)。これにより、伏在動脈によって血管新生された...

ディスカッション

この記事では、豚の後肢で収穫された信頼性が高く再現可能な筋膜皮膚皮弁について説明します。この段階的な手術プロトコルに従うことで、2時間以内に1匹の動物に2つのフラップを調達することができます。手術の最も重要なステップは、グラシリス筋線維内の血管茎の骨格化であり、熟練した外科医による徹底的な解剖が必要です。皮膚縫合糸を使用して皮膚を筋膜に固定することは、?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G angiocatheter	BD Insyte Autoguard	381409
20 G angiocatheter	BD Insyte Autoguard	381411
Adson Tissue Forceps, 11 cm, 1 x 2 Teeth with Tying Platform	ASSI	ASSI.ATK26426
Atropine Sulfate	AdvaCare	212-868
Bipolar cords	ASSI	228000C
Buprenorphine HCl	Pharmaceutical, Inc	42023-179-01
Dilating Forceps	Fine science tools (FST)	18131-12
Endotrachel tube	Jorgensen Labs	JO615X	size from 6 to 15mm depending on the pig weight
Ethilon 3-0 16 mm 3/8	Ethicon	MPVCP683H
Euthasol	Virbac AH	200-071
Heparin Lock Flush Solution, USP, 100 units/mL	BD PosiFlush	306424
Isoflurane	Patterson Veterinary	14043-704-06
Jewelers Bipolar Forceps Non Stick 11 cm, straight pointed tip, 0.25 mm tip diameter	ASSI	ASSI.BPNS11223
Metzenbaum scissors 180 mm	B Braun	BC606R
Microfil blue	Flow tech	LMV-120
Microfil dilution	Flow tech	LMV-112	colored filing solution
Monopolar knife	ASSI	221230C
N°15 scalpel blade	Swann Morton	NS11
Omnipaque	General Electric	4080358	contrast product
Perma-Hand Silk 3-0	Ethicon	A184H
Small Ligaclip	Ethicon	MCM20
Stevens scissors 115 mm	B Braun	BC008R
Telazol	Zoetis	106-111
Xylamed (xylazine)	Bimeda	200-529