Надежная модель фасцио-кожного лоскута свиней для биоинженерных исследований васкуляризированных композитных аллотрансплантатов

Резюме

Настоящий протокол описывает модель фасцио-кожного лоскута свиней и ее потенциальное использование в исследованиях васкуляризированных композитных тканей.

Аннотация

Васкуляризованные композитные аллотрансплантаты (VCA), такие как трансплантация рук, лица или полового члена, представляют собой передовое лечение разрушительных дефектов кожи, которое потерпело неудачу на первых ступенях реконструктивной лестницы. Несмотря на многообещающие эстетические и функциональные результаты, основным ограничивающим фактором остается необходимость резко применяемой пожизненной иммуносупрессии и ее хорошо известные медицинские риски, препятствующие более широким показаниям. Поэтому снятие иммунного барьера при VCA имеет важное значение для того, чтобы склонить этическую шкалу и улучшить качество жизни пациентов с использованием самых передовых хирургических методов. De novo создание специфического для пациента трансплантата является предстоящим прорывом в реконструктивной трансплантации. Используя методы тканевой инженерии, VCA могут быть освобождены от донорских клеток и настроены для реципиента посредством перфузии-децеллюляризации-рецеллюляризации. Для разработки этих новых технологий необходима крупномасштабная модель VCA животных. Следовательно, фасцио-кожные лоскуты свиней, состоящие из кожи, жира, фасций и сосудов, представляют собой идеальную модель для предварительных исследований в VCA. Тем не менее, большинство моделей VCA, описанных в литературе, включают мышцы и кости. В этой работе сообщается о надежной и воспроизводимой технике сбора подкожно-кожного лоскута у свиней, практическом инструменте для различных областей исследований, особенно васкуляризированной композитной тканевой инженерии.

Введение

Васкуляризованные композитные аллотрансплантаты (VCA) произвели революцию в лечении трудновосстанавливаемых потерь частей тела, таких как руки, лицо и пенис ^1,2,3. К сожалению, первые долгосрочные исходы⁴ показали, что пожизненное введение высоких доз иммуносупрессантов может привести к тяжелым сопутствующим заболеваниям, включая диабет, инфекции, неоплазию и рено-сосудистую дисфункцию⁵. В последнее время экспертным командам VCA пришлось управлять риском хронического отторжения, приводящего к потере трансплантата, и выполнять первые случаи ретрансплантации лица ^6,7. Были описаны различные стратегии для преодоления ограничений иммуносупрессии при VCA. Первый основан на установлении долгосрочной толерантности к трансплантату путем индуцирования состояния иммунного смешанного химеризма у реципиента аллотрансплантата ^8,9. Второй включает в себя de novo создание специфического для пациента трансплантата с помощью тканевой инженерии.

В последнее время перфузионная децеллюляризация биологических тканей породила нативные каркасы внеклеточного матрикса (ECM), позволяющие сохранить сосудистую сеть и тканевую архитектуру целых органов¹⁰. Следовательно, рецеллюляризация этих ECM с реципиент-специфическими клетками создаст индивидуальный трансплантат, свободный от иммунных ограничений. В исследованиях по биоинженерии VCA несколько команд децеллюляризировали и получили такой ECM, сохранив всю архитектуру 11,12,13. Тем не менее, процесс рецеллюляризации остается сложным и не был успешным в моделях крупных животных^14,15. Развитие этих прорывных технологий создает потребность в надежных и воспроизводимых моделях крупных композитных тканей животных. Модели свиней представляют собой наилучший выбор в биоинженерном процессе развития, поскольку свиная кожа представляет собой наиболее близкие анатомические и физиологические характеристики к коже человека¹⁶. Использование фасцио-кожных лоскутов (FCF) идеально подходит на первых шагах к созданию «индивидуальных» васкуляризированных композитных тканевых трансплантатов. Действительно, FCF является элементарной моделью VCA, содержащей кожу, жир, фасции и эндотелиальные клетки. Описание свиных миокожных лоскутов¹⁷ и остеомокожных лоскутов¹⁸ можно найти в литературе. Тем не менее, не уделяется внимания методам сбора фасцио-кожных клапанов.

Следовательно, это исследование направлено на то, чтобы предоставить исследователям подробное описание техники закупок FCF подкожной свиньи и изобразить все характеристики лоскута для его использования во многих областях исследований, особенно в васкуляризованной композитной тканевой инженерии.

протокол

Все животные получали человеческую помощь в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Институциональный комитет по уходу за животными и их использованию одобрил экспериментальный протокол (протокол IACUC #2020N000015). Для всех экспериментов использовались семь самок йоркширских свиней (20-25 кг).

1. Предоперационный уход

1. Постигайте животное за твердую пищу за 12 ч до операции.
2. Успокаивайте животное 4,4 мг/кг телазола, 2,2 мг/кг ксилазина и 0,04 мг/кг (в/м) атропина сульфата (см. Таблицу материалов).
3. Поместите 18 г периферического внутривенного катетера в ушную вену.
4. Интубировать свиней соответствующей эндотрахеальной трубкой (можно использовать 6-15 мм для свиней весом 10-200 кг) и подключить трубку к вентилятору. Вводят предоперационную анальгезию бупренорфином (0,05 мг/кг, в/м) (см. Таблицу материалов).

2. Интраоперационный мониторинг

1. Поддерживайте анестезию ингаляционной смесью 1,5%-3% изофлурана с расходом кислорода 1,5 л/мин.
2. Непрерывный мониторинг частоты сердечных сокращений, пульсоксиметрии и конечного прилива CO₂. Оценивайте артериальное давление и температуру тела каждые 5 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Целевой диапазон частоты сердечных сокращений составляет от 90 до 100 ударов в минуту, насыщение кислородом должно быть выше 93%, а конечный приливный диапазон CO₂ составляет от 5% до 6% CO₂.
3. Вводите 5-10 мл / кг в час 0,9% физиологического раствора на протяжении всей процедуры для регулирования среднего артериального давления между 60 мм рт.ст. и 90 мм рт.ст.

3. Двусторонние подкожные закупки FCF

1. Поместите животное в лежачее положение. Брейте и скрабируйте как пах, так и задние конечности, включите все задние конечности в месте операции и задрапируйте стерильным способом.
2. Пальпируйте пульс подкожной артерии ~3 пальца шириной медиаль от надколенника и пометьте его.
3. Определите и нарисуйте пределы закрылка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Верхний предел представляет собой ось, параллельную паховой складке на 3 см ниже нее. Латеральный предел представляет собой ось от переднего верхнего подвздошного отдела позвоночника до медиальной части надколенника.
4. Нарисуйте овальную заслонку диаметром 10 см, центрированную на подкожной ножке и содержащуюся в ранее описанных пределах закрылков (этап 3.3).
5. Сделайте разрез кожи размером 1,5 см относительно дистальной части ножки на лоскуте.
6. Откройте фасцию и тупое рассечение, чтобы обнажить подкожную артерию и две ее вены комитанты. Выполняют двойную лигатуру и разделяют в один пучок.
7. Разрезайте оставшуюся кожу лоскута лезвием.
8. Используйте прижигание, чтобы открыть подкожную клетчатку и окружающие фасции. Выполняют тщательный гемостаз с помощью биполярных щипцов (см. Таблицу материалов).
9. Прикрепите кожный компонент лоскута к подлежащей фасции с помощью 3-0 нерассасывающихся швов, чтобы избежать непреднамеренного вытяжения и нарушения перфорации сосудов.
10. Освободите лоскут от грацилиса, рассекая фасцию от мышцы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дистальная часть подкожной ножки проходит в плоскости между мышцей грацилиса и фасцией. Соответствующее напряжение и осторожный биполярный гемостаз боковых ветвей являются важнейшими элементами для облегчения рассечения ножки.
11. Используйте скальпель, чтобы сделать 12-сантиметровый разрез в паховой складке. Выполните перпендикулярный разрез, соединив паховую складку с проксимальной частью лоскута. Поднимите соединительную кожу и вскройте подкожный слой с помощью прижигания.
12. Продолжайте рассечение ножки, следуя за подкожными сосудами вниз к бедренным сосудам.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проксимальная часть подкожной ножки может либо проходить через межмышечную перегородку, либо погружаться в мышцу грацилиса.
13. Скелетонизируют бедренные сосуды и связывают их дистально к подкожной ветви двумя отдельными пучками. Продолжают рассечение бедренных сосудов от дистального до проксимального до достижения уровня паховой связки. Используйте биполярные щипцы для прижигания сосудистых зажимов и 2-0 шелковых завязок, чтобы перевязать глубокие бедренные сосуды, а затем разрезать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сосудистые клипсы также могут быть использованы перед разрезанием сосудов.
14. Повторите шаги 3.2-3.13 на контралатеральной задней конечности, чтобы собрать второй подкожный лоскут.
15. Гепаринизировать животное внутривенной (IV) инъекцией гепарина (100 МЕ/кг) за 5 мин до шага 3.16.
16. Разложить бедренную ножку (артерию и вену) как можно ближе к паховой связке и отделить лоскут от донорской свиньи.
17. Расширьте концы бедренного сосуда и вставьте ангиокатетер 20 Г как в артерию, так и в вену. Используйте 3-0 шелковых завязок, чтобы закрепить катетер на сосудах.
18. Медленно промывать фасцио-кожную лоскутную артерию 10 мл гепаринового физиологического раствора (100 МЕ/мл) до тех пор, пока не будет наблюдаться явный венозный отток (рисунок 1).

Рисунок 1: Нативный и децеллюляризованный подкожный фасцио-кожный лоскут. (А) Изолированный кожный лоскут с ангиокатетером 20 Г, вставленным в бедренную артерию, позволяющим промыть лоскут из крови и приступить к различным экспериментам (ангиография, перфузионная децеллюляризация). (B) Децеллюляризованный кожный лоскут. Перфузионная децеллюляризация, дающая белые, бесклеточные каркасы после 10 дней перфузии моющего средства. H&E-окрашенные полностью толщиной поперечные сечения (C) нативного кожного лоскута и (D) децеллюляризированного кожного лоскута. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

19. Усыпить животное с помощью внутривенной инъекции фенобарбитала натрия (100 мг/кг). Подтверждают смерть отсутствием сердцебиения и дыхательных движений.

Результаты

Этой работе на живых животных предшествовало определение подкожной перфорасомы на трех трупных экземплярах (рисунок 2). Цветной пломбировочный раствор вводили в подкожную артерию для помутнения специфической сосудистой сети, исходящей из артерии. Раствор состоит из 10 ...

Обсуждение

В данной статье описывается надежный и воспроизводимый фасциокожный лоскут, заготовленный на задних конечностях свиней. Следование этому пошаговому хирургическому протоколу позволит приобрести два лоскута только на одном животном менее чем за 2 часа. Наиболее важным этапом операции ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G angiocatheter	BD Insyte Autoguard	381409
20 G angiocatheter	BD Insyte Autoguard	381411
Adson Tissue Forceps, 11 cm, 1 x 2 Teeth with Tying Platform	ASSI	ASSI.ATK26426
Atropine Sulfate	AdvaCare	212-868
Bipolar cords	ASSI	228000C
Buprenorphine HCl	Pharmaceutical, Inc	42023-179-01
Dilating Forceps	Fine science tools (FST)	18131-12
Endotrachel tube	Jorgensen Labs	JO615X	size from 6 to 15mm depending on the pig weight
Ethilon 3-0 16 mm 3/8	Ethicon	MPVCP683H
Euthasol	Virbac AH	200-071
Heparin Lock Flush Solution, USP, 100 units/mL	BD PosiFlush	306424
Isoflurane	Patterson Veterinary	14043-704-06
Jewelers Bipolar Forceps Non Stick 11 cm, straight pointed tip, 0.25 mm tip diameter	ASSI	ASSI.BPNS11223
Metzenbaum scissors 180 mm	B Braun	BC606R
Microfil blue	Flow tech	LMV-120
Microfil dilution	Flow tech	LMV-112	colored filing solution
Monopolar knife	ASSI	221230C
N°15 scalpel blade	Swann Morton	NS11
Omnipaque	General Electric	4080358	contrast product
Perma-Hand Silk 3-0	Ethicon	A184H
Small Ligaclip	Ethicon	MCM20
Stevens scissors 115 mm	B Braun	BC008R
Telazol	Zoetis	106-111
Xylamed (xylazine)	Bimeda	200-529