Un modèle fiable de lambeau fascio-cutané porcin pour les études de bio-ingénierie des allogreffes composites vascularisées

Résumé

Le présent protocole décrit le modèle du lambeau fascio-cutané porcin et son utilisation potentielle dans la recherche sur les tissus composites vascularisés.

Résumé

Les allogreffes composites vascularisées (AVC) telles que la greffe de main, de visage ou de pénis représentent le traitement de pointe pour les défauts cutanés dévastateurs, échoués par les premières étapes de l’échelle de reconstruction. Malgré des résultats esthétiques et fonctionnels prometteurs, le principal facteur limitant reste la nécessité d’une immunosuppression à vie appliquée de manière drastique et ses risques médicaux bien connus, empêchant des indications plus larges. Par conséquent, il est essentiel de lever la barrière immunitaire dans le VCA pour faire pencher la balance éthique et améliorer la qualité de vie des patients en utilisant les techniques chirurgicales les plus avancées. La création de novo d’une greffe spécifique au patient est la percée à venir dans la transplantation reconstructive. En utilisant des techniques d’ingénierie tissulaire, les VCA peuvent être libérés des cellules du donneur et personnalisés pour le receveur par perfusion-décellularisation-recellularisation. Pour développer ces nouvelles technologies, un modèle VCA animal à grande échelle est nécessaire. Par conséquent, les lambeaux fascio-cutanés porcins, composés de peau, de graisse, de fascia et de vaisseaux, représentent un modèle idéal pour les études préliminaires en AVC. Néanmoins, la plupart des modèles VCA décrits dans la littérature incluent les muscles et les os. Ce travail rapporte une technique fiable et reproductible pour la récolte du lambeau saphène fascio-cutané chez le porc, un outil pratique pour divers domaines de recherche, en particulier l’ingénierie tissulaire composite vascularisée.

Introduction

Les allogreffes composites vascularisées (ACV) ont révolutionné le traitement des pertes de parties du corps difficiles à réparer, telles que les mains, le visage et le pénis ^1,2,3. Malheureusement, les premiers résultats à long terme⁴ ont montré que l’administration à vie d’agents immunosuppresseurs à forte dose peut entraîner de graves affections médicales collatérales, notamment le diabète, les infections, la néoplasie et le dysfonctionnement rénovasculaire⁵. Dernièrement, les équipes d’experts VCA ont dû gérer le risque de rejet chronique conduisant à la perte de greffon et effectuer les premiers cas de retransplantation^{faciale 6,7}. Différentes stratégies ont été décrites pour surmonter les limites de l’immunosuppression dans l’ACV. La première repose sur l’établissement d’une tolérance à long terme du greffon en induisant un état de chimérisme immunitaire mixte chez le receveur d’allogreffe ^8,9. La seconde consiste à créer de novo une greffe spécifique au patient via l’ingénierie tissulaire.

Récemment, la décellularisation par perfusion des tissus biologiques a généré des échafaudages de matrice extracellulaire native (ECM), permettant la préservation du réseau vasculaire et de l’architecture tissulaire d’organes entiers¹⁰. Par conséquent, la recellularisation de ces ECM avec des cellules spécifiques au receveur créerait un greffon personnalisé exempt de contraintes immunitaires. Dans la recherche sur la bio-ingénierie VCA, plusieurs équipes ont décellularisé et obtenu un tel ECM préservant l’ensemble de l’architecture^11,12,13. Cependant, le processus de recellularisation reste difficile et n’a pas été couronné de succès dans les grands modèles animaux^14,15. Le développement de ces technologies révolutionnaires crée un besoin de modèles de tissus composites de grands animaux fiables et reproductibles. Les modèles porcins représentent le choix le plus important dans le pipeline de développement de la bio-ingénierie, car la peau porcine présente les caractéristiques anatomiques et physiologiques les plus proches de la peau humaine¹⁶. L’utilisation de lambeaux fascio-cutanés (FCF) est idéale lors des premières étapes vers la création de greffes tissulaires composites vascularisées « sur mesure ». En effet, FCF est un modèle VCA élémentaire contenant de la peau, de la graisse, des fascias et des cellules endothéliales. Une description des lambeaux myocutanés^{porcins 17} et des lambeaux ostéomyocutanés¹⁸ se trouve dans la littérature. Néanmoins, on ne se concentre pas suffisamment sur les techniques de récolte des lambeaux fascio-cutanés.

Par conséquent, cette étude vise à fournir aux chercheurs une description détaillée d’une technique d’approvisionnement en FCF saphène porcin et à décrire toutes les caractéristiques du lambeau pour son utilisation dans de nombreux domaines de recherche, en particulier en génie tissulaire composite vascularisé.

Protocole

Tous les animaux ont reçu des soins humains conformément au Guide de l’Institut national de la santé pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux a approuvé le protocole expérimental (protocole IACUC- #2020N000015). Sept porcs femelles du Yorkshire (20-25 kg) ont été utilisés pour toutes les expériences.

1. Soins préopératoires

1. Jeûnez l’animal pour la nourriture solide 12 h avant la chirurgie.
2. Sédatif l’animal avec 4,4 mg/kg de télazol, 2,2 mg/kg de xylazine et 0,04 mg/kg (IM) de sulfate d’atropine (voir le tableau des matières).
3. Placez un cathéter intraveineux périphérique de 18 G dans une veine auriculaire.
4. Intuber le porc avec un tube endotrachéal approprié (6-15 mm peut être utilisé pour les porcs de 10-200 kg) et connecter le tube à un ventilateur. Administrer une analgésie préopératoire avec de la buprénorphine (0,05 mg/kg, IM) (voir le tableau des matières).

2. Surveillance peropératoire

1. Maintenir l’anesthésie avec un mélange d’isoflurane par inhalation de 1,5 % à 3 % avec un débit d’oxygène de 1,5 L/min.
2. Surveillez en permanence la fréquence cardiaque, l’oxymétrie de pouls et le CO₂ en fin de marée. Évaluez la pression artérielle et la température corporelle toutes les 5 minutes.
   REMARQUE: La plage cible pour la fréquence cardiaque est comprise entre 90 et 100 battements / min, la saturation en oxygène doit être supérieure à 93% et la plage de CO 2 en fin de marée se situe entre 5% et 6% de CO₂.
3. Administrer une solution saline à 0,9 % de 5 à 10 mL/kg par heure tout au long de la procédure pour réguler la pression artérielle moyenne entre 60 mmHg et 90 mmHg.

3. Passation de marchés bilatéraux de FCF saphène

1. Placez l’animal en décubitus dorsal. Rasez et frottez les aines et les membres postérieurs, incluez les membres postérieurs entiers dans le site chirurgical et drapez de manière stérile.
2. Palper le pouls de l’artère saphène ~3 largeurs de doigts médiales de la rotule et marquer-la.
3. Identifiez et tracez les limites du rabat.
   NOTE: La limite supérieure est un axe parallèle au pli inguinal 3 cm en dessous. La limite latérale est un axe allant de l’épine iliaque antérieure supérieure à la partie médiale de la rotule.
4. Dessiner un volet ovale de 10 cm de diamètre centré sur le pédicule saphène et contenu dans les limites du lambeau décrites précédemment (étape 3.3).
5. Faites une incision cutanée de 1,5 cm concernant la partie distale du pédicule sur le repère du lambeau.
6. Ouvrez le fascia et disséquez émoussé pour exposer l’artère saphène et ses deux veines comitantes. Effectuez une double ligature et séparez-la en un seul paquet.
7. Inciser la peau restante du lambeau avec une lame.
8. Utilisez la cautérisation pour ouvrir le tissu sous-cutané et le fascia environnant. Effectuer une hémostase complète à l’aide d’une pince bipolaire (voir le tableau des matériaux).
9. Fixez le composant cutané du volet au fascia sous-jacent avec des sutures non résorbables 3-0 pour éviter la traction accidentelle et la perturbation des vaisseaux perforants.
10. Libérez le lambeau du gracilis en disséquant le fascia loin du muscle.
    NOTE: La partie distale du pédicule saphène court dans un plan entre le muscle gracilis et le fascia. Une tension appropriée et une hémostase bipolaire prudente des branches latérales sont des éléments cruciaux pour faciliter la dissection du pédicule.
11. Utilisez un scalpel pour faire une incision de 12 cm dans le pli inguinal. Effectuer une incision perpendiculaire reliant le pli inguinal à la partie proximale du lambeau. Soulevez la peau de connexion et ouvrez la couche sous-cutanée à l’aide de la cautérisation.
12. Continuez la dissection pédiculaire en suivant les vaisseaux saphènes vers les vaisseaux fémoraux.
    REMARQUE: La partie proximale du pédicule saphène peut traverser le septum intermusculaire ou plonger dans le muscle gracilis.
13. Squelettiser les vaisseaux fémoraux et les ligaturer distalement à la branche saphène en deux faisceaux distincts. Poursuivre la dissection des vaisseaux fémoraux de distal à proximal jusqu’à atteindre le niveau du ligament inguinal. Utilisez des pinces bipolaires pour cautériser ou des clips vasculaires et des attaches de soie 2-0 pour ligaturer les vaisseaux fémoraux profonds, puis coupez.
    REMARQUE: Les clips vasculaires peuvent également être utilisés avant de couper les vaisseaux.
14. Répétez les étapes 3.2-3.13 sur le membre postérieur controlatéral pour récolter le deuxième lambeau saphène.
15. Hépariniser l’animal par injection intraveineuse (IV) d’héparine (100 UI/kg) 5 min avant l’étape 3.16.
16. Liférer le pédicule fémoral (artère et veine) aussi proximal que possible au ligament inguinal et séparer le lambeau du porc donneur.
17. Dilater les extrémités du vaisseau fémoral et insérer un angiocathéter de 20 G dans l’artère et la veine. Utilisez des attaches en soie 3-0 pour fixer le cathéter aux vaisseaux.
18. Rincer lentement l’artère du lambeau fascio-cutané avec 10 mL de solution saline d’héparine (100 UI/mL) jusqu’à ce qu’un écoulement veineux clair soit observé (Figure 1).

Figure 1 : lambeau saphène fascio-cutané natif et décellularisé. (A) lambeau cutané isolé avec un angiocathéter de 20 G inséré dans l’artère fémorale, permettant de laver le lambeau du sang et de procéder à différentes expériences (angiographie, décellularisation par perfusion). (B) lambeau cutané décellularisé. Décellularisation de perfusion produisant des échafaudages blancs et acellulaires après 10 jours de perfusion de détergent. Coupes transversales de pleine épaisseur colorées H & E de (C) lambeau cutané natif et (D) lambeau cutané décellularisé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

19. Euthanasier l’animal avec une injection IV de phénobarbital de sodium (100 mg/kg). Confirmer la mort par l’absence de battements cardiaques et de mouvements respiratoires.

Résultats

Ce travail sur des animaux vivants a été précédé par la détermination du perforasome saphène sur trois spécimens cadavériques (Figure 2). Une solution de remplissage colorée a été injectée dans l’artère saphène pour opacifier le réseau vasculaire spécifique provenant de l’artère. La solution est composée de 10 mL d’agent glycérine de couleur bleue mélangé à 10 mL d’agent diluant (voir le tableau des matières). Cela a généré une carte color?...

Discussion

Cet article décrit un lambeau fasciocutané fiable et reproductible récolté sur les membres postérieurs du porc. Suivre ce protocole chirurgical étape par étape permettra l’obtention de deux lambeaux sur un seul animal en moins de 2 h. L’étape la plus critique de la chirurgie est le squelettisation du pédicule vasculaire dans les fibres musculaires gracilis, ce qui nécessite une dissection approfondie par un chirurgien qualifié. La fixation de la peau au fascia à l’aide de sutures cutanées est une astuc...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G angiocatheter	BD Insyte Autoguard	381409
20 G angiocatheter	BD Insyte Autoguard	381411
Adson Tissue Forceps, 11 cm, 1 x 2 Teeth with Tying Platform	ASSI	ASSI.ATK26426
Atropine Sulfate	AdvaCare	212-868
Bipolar cords	ASSI	228000C
Buprenorphine HCl	Pharmaceutical, Inc	42023-179-01
Dilating Forceps	Fine science tools (FST)	18131-12
Endotrachel tube	Jorgensen Labs	JO615X	size from 6 to 15mm depending on the pig weight
Ethilon 3-0 16 mm 3/8	Ethicon	MPVCP683H
Euthasol	Virbac AH	200-071
Heparin Lock Flush Solution, USP, 100 units/mL	BD PosiFlush	306424
Isoflurane	Patterson Veterinary	14043-704-06
Jewelers Bipolar Forceps Non Stick 11 cm, straight pointed tip, 0.25 mm tip diameter	ASSI	ASSI.BPNS11223
Metzenbaum scissors 180 mm	B Braun	BC606R
Microfil blue	Flow tech	LMV-120
Microfil dilution	Flow tech	LMV-112	colored filing solution
Monopolar knife	ASSI	221230C
N°15 scalpel blade	Swann Morton	NS11
Omnipaque	General Electric	4080358	contrast product
Perma-Hand Silk 3-0	Ethicon	A184H
Small Ligaclip	Ethicon	MCM20
Stevens scissors 115 mm	B Braun	BC008R
Telazol	Zoetis	106-111
Xylamed (xylazine)	Bimeda	200-529