نموذج رفرف لفافة جلدية خزفية موثوقة لدراسات الهندسة الحيوية المركبة الوعائية

Summary

يصف هذا البروتوكول نموذج السديلة الجلدية اللفافة الخنازير واستخدامه المحتمل في أبحاث الأنسجة المركبة الوعائية.

Abstract

تمثل الألوغرافيات المركبة الوعائية (VCA) مثل زراعة اليد أو الوجه أو القضيب العلاج المتطور لعيوب الجلد المدمرة ، التي فشلت في الخطوات الأولى من السلم الترميمي. على الرغم من النتائج الجمالية والوظيفية الواعدة ، يبقى العامل المحدد الرئيسي هو الحاجة إلى تثبيط المناعة مدى الحياة ومخاطره الطبية المعروفة ، مما يمنع المؤشرات الأوسع. لذلك ، فإن رفع الحاجز المناعي في VCA أمر ضروري لترجيح كفة المقياس الأخلاقي وتحسين نوعية حياة المرضى باستخدام التقنيات الجراحية الأكثر تقدما. De novo إنشاء الكسب غير المشروع الخاص بالمريض هو الاختراق القادم في الزرع الترميمي. باستخدام تقنيات هندسة الأنسجة ، يمكن تحرير VCAs من الخلايا المانحة وتخصيصها للمتلقي من خلال التروية - إزالة الخلايا - إعادة الخلايا. لتطوير هذه التقنيات الجديدة ، من الضروري وجود نموذج VCA حيواني واسع النطاق. وبالتالي ، فإن اللوحات الجلدية اللفافة الخنازير ، التي تتكون من الجلد والدهون واللفافة والأوعية ، تمثل نموذجا مثاليا للدراسات الأولية في VCA. ومع ذلك ، فإن معظم نماذج VCA الموصوفة في الأدبيات تشمل العضلات والعظام. يشير هذا العمل إلى تقنية موثوقة وقابلة للتكرار لحصاد السديلة اللفافة الجلدية الصافنة في الخنازير ، وهي أداة عملية لمختلف مجالات البحث ، وخاصة هندسة الأنسجة المركبة الوعائية.

Introduction

أحدثت الألوغرافات المركبة الوعائية (VCA) ثورة في علاج خسائر أجزاء الجسم التي يصعب إصلاحها ، مثل اليدين والوجه والقضيب^1،2،3. لسوء الحظ ، أظهرت النتائج الأولى طويلة الأجل⁴ أن إعطاء جرعة عالية من العوامل المثبطة للمناعة لمدة طويلة يمكن أن يؤدي إلى حالات طبية جانبية شديدة ، بما في ذلك مرض السكري والالتهابات والأورام وخلل وظيفي الأوعية الدموية⁵. في الآونة الأخيرة ، كان على فرق VCA الخبيرة إدارة خطر الرفض المزمن الذي يؤدي إلى فقدان الكسب غير المشروع وإجراء أول حالات إعادة زرع الوجه ^6,7. تم وصف استراتيجيات مختلفة للتغلب على قيود كبت المناعة في VCA. الأول يعتمد على إنشاء تحمل الكسب غير المشروع على المدى الطويل من خلال تحفيز حالة الوهم المختلط المناعي في متلقي allograft ^8,9. والثاني ينطوي على إنشاء دي نوفو من الكسب غير المشروع الخاص بالمريض عن طريق هندسة الأنسجة.

في الآونة الأخيرة ، ولدت إزالة الخلايا من الأنسجة البيولوجية سقالات مصفوفة خارج الخلية (ECM) الأصلية ، مما يسمح بالحفاظ على شبكة الأوعية الدموية وبنية الأنسجة للأعضاء بأكملها¹⁰. وبالتالي ، فإن إعادة توطين هذه ECM مع خلايا خاصة بالمتلقي من شأنه أن يخلق ترقيعا مخصصا خاليا من القيود المناعية. في البحث حول الهندسة الحيوية VCA ، قامت فرق متعددة بإزالة الخلايا والحصول على مثل هذا ECM مع الحفاظ على الهندسة المعمارية بأكملها¹¹،^12،13. ومع ذلك ، لا تزال عملية إعادة التوطين صعبة ولم تكن ناجحة في النماذج الحيوانية الكبيرة^14,15. إن تطوير هذه التقنيات المتقدمة يخلق حاجة إلى نماذج أنسجة مركبة حيوانية كبيرة موثوقة وقابلة للتكرار. تمثل نماذج الخنازير الخيار الأقصى في خط أنابيب تطوير الهندسة الحيوية ، حيث يقدم جلد الخنزير أقرب الخصائص التشريحية والفسيولوجية إلى جلد الإنسان¹⁶. يعد استخدام اللوحات اللفافة الجلدية (FCF) مثاليا خلال الخطوات الأولى نحو إنشاء ترقيع الأنسجة المركبة الوعائية "المخصصة". في الواقع ، FCF هو نموذج VCA أولي يحتوي على الجلد والدهون واللفافة والخلايا البطانية. يمكن العثور على وصف للسفار الجلدية العضلية^{للخنازير 17} واللوحات العظمية الجلدية¹⁸ في الأدب. ومع ذلك ، هناك نقص في التركيز على تقنيات حصاد اللوحات اللفافة الجلدية.

وبالتالي ، تهدف هذه الدراسة إلى تزويد الباحثين بوصف مفصل لتقنية شراء FCF الصافن الخنازير وتصوير جميع خصائص الرفرف لاستخدامها في العديد من المجالات البحثية ، وخاصة في هندسة الأنسجة المركبة الوعائية.

Protocol

تلقت جميع الحيوانات الرعاية البشرية وفقا لدليل المعهد الوطني للصحة لرعاية واستخدام المختبر. وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها على البروتوكول التجريبي (بروتوكول IACUC - #2020N000015). تم استخدام سبع خنازير يوركشاير الإناث (20-25 كجم) لجميع التجارب.

1. الرعاية قبل الجراحة

1. صوم الحيوان للحصول على الطعام الصلب قبل 12 ساعة من الجراحة.
2. تخدير الحيوان مع 4.4 مغ/كغ من تيلازول، 2.2 مغ/كغ من زيلازين، و 0.04 مغ/كغ من كبريتات الأتروبين (انظر جدول المواد).
3. ضع قسطرة وريدية محيطية سعة 18 جم في وريد الأذن.
4. قم بتنبيب الخنازير بأنبوب مناسب للقصبة الهوائية (يمكن استخدام 6-15 مم للخنازير التي يتراوح وزنها بين 10 و 200 كجم) وقم بتوصيل الأنبوب بجهاز التنفس الصناعي. إدارة مسكن ما قبل الجراحة مع البوبرينورفين (0.05 مغ / كغم ، IM) (انظر جدول المواد).

2. المراقبة أثناء العملية الجراحية

1. الحفاظ على التخدير مع خليط استنشاق من 1.5٪ -3٪ أيسوفلوران مع تدفق الأكسجين 1.5 لتر / دقيقة.
2. راقب باستمرار معدل ضربات القلب وقياس التأكسج النبضي وثاني أكسيد الكربون₂ في نهاية المد والجزر. تقييم ضغط الدم ودرجة حرارة الجسم كل 5 دقائق.
   ملاحظة: يتراوح النطاق المستهدف لمعدل ضربات القلب بين 90-100 نبضة / دقيقة ، ويجب أن يكون تشبع الأكسجين أعلى من 93٪ ، ويتراوح نطاق ثاني أكسيد الكربون_في نهاية المد والجزر بين 5٪ -6٪ من ثاني أكسيد الكربون₂.
3. إدارة 5-10 مل / كغم في الساعة 0.9٪ المالحة طوال الإجراء لتنظيم متوسط الضغط الشرياني بين 60 مم زئبق و 90 مم زئبق.

3. مشتريات FCF الصافن الثنائية

1. ضع الحيوان في وضع ضعيف. حلق وفرك كل من الفخذين والأطراف الخلفية ، وتشمل الأطراف الخلفية بأكملها في الموقع الجراحي ، وستائر بطريقة معقمة.
2. جس نبض الشريان الصافن ~ 3 عرض الإصبع الإنسي من الرضفة ووضع علامة عليه.
3. تحديد ورسم حدود رفرف.
   ملاحظة: الحد الأعلى هو محور مواز للتجعد الإربي على بعد 3 سم تحته. الحد الجانبي هو محور من العمود الفقري الحرقفي العلوي الأمامي إلى الجزء الإنسي من الرضفة.
4. ارسم رفرف بيضاوي الشكل قطره 10 سم يتمحور حول عنيق الصافن وموجود في حدود الرفرف الموصوفة سابقا (الخطوة 3.3).
5. قم بعمل شق جلدي بطول 1.5 سم فيما يتعلق بالجزء البعيد من عنيق على معلم الرفرف.
6. افتح اللفافة وتشريح حاد لفضح الشريان الصافن واثنين من الكوميتانتات الوريدية. أداء الرباط المزدوج وفصل في حزمة واحدة.
7. شق الجلد المتبقي من رفرف مع شفرة.
8. استخدم الكي لفتح الأنسجة تحت الجلد واللفافة المحيطة. قم بإجراء الإرقاء الشامل باستخدام ملقط ثنائي القطب (انظر جدول المواد).
9. قم بتوصيل مكون الجلد من السديلة باللفافة الأساسية باستخدام 3-0 خيوط غير قابلة للامتصاص لتجنب الجر غير المقصود وتعطيل الأوعية المثقوبة.
10. حرر الرفرف من الجراسيليس عن طريق تشريح اللفافة بعيدا عن العضلات.
    ملاحظة: يمتد الجزء البعيد من عنيق الصافن في مستوى بين عضلة جراسيليس واللفافة. التوتر المناسب والارقاء ثنائي القطب الحذر للفروع الجانبية هي عناصر حاسمة لتخفيف تشريح عنيق.
11. استخدم مشرطا لعمل شق 12 سم في التجعد الأربي. قم بإجراء شق عمودي يربط التجعد الإربي بالجزء القريب من الرفرف. ارفع الجلد المتصل بعيدا وافتح الطبقة تحت الجلد باستخدام الكي.
12. استمر في تشريح عنيق عن طريق اتباع الأوعية الصافنة نحو الأوعية الفخذية.
    ملاحظة: يمكن للجزء القريب من عنيق الصافن إما أن يمر عبر الحاجز العضلي أو يغوص في عضلة جراسيليس.
13. قم بتخطيط أوعية الفخذ وربطها بشكل بعيد بالفرع الصافن في حزمتين منفصلتين. استمر في تشريح الأوعية الفخذية من البعيدة إلى القريبة حتى تصل إلى مستوى الرباط الأربي. استخدم ملقط ثنائي القطب للكي أو مقاطع الأوعية الدموية و 2-0 روابط حريرية لربط الأوعية الفخذية العميقة ، ثم قطعها.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام مشابك الأوعية الدموية قبل قطع الأوعية.
14. كرر الخطوات 3.2-3.13 على الطرف الخلفي المقابل لحصاد الرفرف الصافن الثاني.
15. قم بتثبيط الحيوان عن طريق حقن الهيبارين في الوريد (IV) (100 وحدة دولية / كجم) قبل 5 دقائق من الخطوة 3.16.
16. قم بربط عنيق الفخذ (الشريان والوريد) بالقرب من الرباط الإربي قدر الإمكان وافصل السديلة عن الخنزير المانح.
17. قم بتوسيع أطراف الأوعية الفخذية وأدخل قسطرة وعائية 20 جم في كل من الشريان والوريد. استخدم 3-0 روابط حريرية لتثبيت القسطرة على الأوعية.
18. اغسل ببطء الشريان الرفرف اللفائفي الجلدي ب 10 مل من محلول الهيبارين الملحي (100 وحدة دولية / مل) حتى يتم ملاحظة تدفق وريدي واضح (الشكل 1).

الشكل 1: رفرف اللفافة الجلدية الصافنة الأصلية والخلوية. (أ) رفرف جلدي معزول مع قسطرة وعائية 20 غرام يتم إدخالها في الشريان الفخذي ، مما يسمح بغسل السديلة من الدم والمضي قدما في تجارب مختلفة (تصوير الأوعية ، إزالة الخلايا من التروية). (ب) رفرف الجلد المنزوع الخلايا. إزالة الخلايا من التروية التي تنتج سقالات بيضاء غير خلوية بعد 10 أيام من تروية المنظفات. H & E - مقاطع عرضية كاملة السماكة ملطخة من (C) رفرف الجلد الأصلي و (D) رفرف الجلد غير الخلوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

19. القتل الرحيم للحيوان عن طريق الحقن الوريدي من فينوباربيتال الصوديوم (100 ملغم / كغ). تأكد من الوفاة بسبب عدم وجود نبضات القلب وحركات الجهاز التنفسي.

النتائج

وقد سبق هذا العمل على الحيوانات الحية تحديد الثقب الصافن على ثلاث عينات من الجثث (الشكل 2). تم حقن محلول حشو ملون في الشريان الصافن لتعتيم شبكة الأوعية الدموية المحددة القادمة من الشريان. يتكون المحلول من عامل جلسرين أزرق اللون 10 مل ممزوج ب 10 مل من العامل المخفف (انظر جدو...

Discussion

تصف هذه المقالة رفرف لفافة جلدية موثوق به وقابل للتكرار يتم حصاده على الأطراف الخلفية للخنازير. بعد هذا البروتوكول الجراحي خطوة بخطوة سيسمح بشراء اثنين من اللوحات على واحد فقط في أقل من 2 ساعة. الخطوة الأكثر أهمية في الجراحة هي الهيكل العظمي للعنيق الوعائي داخل ألياف العضلات gracilis ، والتي ت...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G angiocatheter	BD Insyte Autoguard	381409
20 G angiocatheter	BD Insyte Autoguard	381411
Adson Tissue Forceps, 11 cm, 1 x 2 Teeth with Tying Platform	ASSI	ASSI.ATK26426
Atropine Sulfate	AdvaCare	212-868
Bipolar cords	ASSI	228000C
Buprenorphine HCl	Pharmaceutical, Inc	42023-179-01
Dilating Forceps	Fine science tools (FST)	18131-12
Endotrachel tube	Jorgensen Labs	JO615X	size from 6 to 15mm depending on the pig weight
Ethilon 3-0 16 mm 3/8	Ethicon	MPVCP683H
Euthasol	Virbac AH	200-071
Heparin Lock Flush Solution, USP, 100 units/mL	BD PosiFlush	306424
Isoflurane	Patterson Veterinary	14043-704-06
Jewelers Bipolar Forceps Non Stick 11 cm, straight pointed tip, 0.25 mm tip diameter	ASSI	ASSI.BPNS11223
Metzenbaum scissors 180 mm	B Braun	BC606R
Microfil blue	Flow tech	LMV-120
Microfil dilution	Flow tech	LMV-112	colored filing solution
Monopolar knife	ASSI	221230C
N°15 scalpel blade	Swann Morton	NS11
Omnipaque	General Electric	4080358	contrast product
Perma-Hand Silk 3-0	Ethicon	A184H
Small Ligaclip	Ethicon	MCM20
Stevens scissors 115 mm	B Braun	BC008R
Telazol	Zoetis	106-111
Xylamed (xylazine)	Bimeda	200-529