Sinapsis de cinta de inmunoetiquetado y conteo en cócleas de jerbos jóvenes y ancianos

Resumen

Se presenta un protocolo para el procesamiento de cócleas de jerbos adultos jóvenes y ancianos mediante el inmunoetiquetado de las estructuras sinápticas aferentes y las células ciliadas, el apagado de la autofluorescencia en el tejido envejecido, la disección y estimación de la longitud de las cócleas y la cuantificación de las sinapsis en pilas de imágenes obtenidas con imágenes confocales.

Resumen

Se supone que la pérdida de sinapsis de cinta que conectan las células ciliadas internas y las fibras nerviosas auditivas aferentes es una de las causas de la pérdida auditiva relacionada con la edad. El método más común para detectar la pérdida de sinapsis de cinta es el inmunoetiquetado porque permite el muestreo cuantitativo de varias ubicaciones tonotópicas en una cóclea individual. Sin embargo, las estructuras de interés están enterradas profundamente dentro de la cóclea ósea. Los jerbos se utilizan como modelo animal para la pérdida de audición relacionada con la edad. Aquí, se describen los protocolos de rutina para la fijación, el inmunoetiquetado de montajes enteros cocleares de jerbos, las imágenes confocales y la cuantificación de los números y volúmenes de sinapsis de cinta. Además, se destacan los desafíos particulares asociados con la obtención de buen material de personas valiosas que envejecen.

Los jerbos son sacrificados y perfundidos cardiovascularmente, o sus bullas timpánicas se diseccionan cuidadosamente fuera del cráneo. Las cócleas se abren en el ápice y la base y se transfieren directamente al fijador. Independientemente del método inicial, las cócleas se fijan posteriormente y posteriormente se descalcifican. Luego, el tejido se etiqueta con anticuerpos primarios contra estructuras pre y postsinápticas y células ciliadas. A continuación, las cócleas se incuban con anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia que son específicos contra sus respectivos primarios. Las cócleas de los jerbos envejecidos se tratan con un silenciador de autofluorescencia para reducir la fluorescencia de fondo típicamente sustancial de los tejidos de los animales más viejos.

Finalmente, las cócleas se diseccionan en 6-11 segmentos. Toda la longitud coclear se reconstruye de tal manera que las ubicaciones cocleares específicas se pueden determinar de manera confiable entre individuos. Las pilas de imágenes confocales, adquiridas secuencialmente, ayudan a visualizar las células ciliadas y las sinapsis en las ubicaciones elegidas. Las pilas confocales se descontorbanican, y las sinapsis se cuentan manualmente utilizando ImageJ, o se lleva a cabo una cuantificación más extensa de las estructuras sinápticas con procedimientos de análisis de imágenes escritos a medida en Matlab.

Introducción

La pérdida de audición relacionada con la edad es una de las enfermedades más prevalentes del mundo que afecta a más de un tercio de la población mundial de 65 años o más¹. Las causas subyacentes aún están en debate y se están investigando activamente, pero pueden incluir la pérdida de las sinapsis especializadas que conectan las células ciliadas internas (IHC) con las fibras nerviosas auditivas aferentes². Estas sinapsis de cinta comprenden una estructura presináptica que tiene vesículas llenas del neurotransmisor glutamato atado a ella, así como receptores postsinápticos de ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiónico (AMPA) glutamato ^3,4,5. En el jerbo, ~ 20 fibras nerviosas auditivas aferentes entran en contacto con un IHC ^6,7,8. Las fibras en el IHC frente al modiolus se oponen a las cintas sinápticas grandes, mientras que las fibras que se conectan en el lado del pilar del IHC se enfrentan a pequeñas cintas sinápticas (es decir, en gatos⁹, jerbos⁷, conejillos de indias¹⁰ y ratones ^{3,11,12,13,14}). Además, en el jerbo, el tamaño de las cintas presinápticas y los parches de glutamato postsináptico se correlacionan positivamente ^7,14. Las fibras que se oponen a las cintas grandes en el lado modiolar de la IHC son de calibre pequeño y tienen bajas tasas espontáneas y umbrales altos¹⁵. Existe evidencia de que las fibras de baja tasa espontánea son más vulnerables a la exposición al ruido¹⁰ y a los fármacos ototóxicos¹⁶ que las fibras de bajo umbral altamente espontáneas, que se encuentran en el lado del pilar de los IHC¹⁵.

La pérdida de sinapsis de cinta es el evento degenerativo más temprano en la pérdida auditiva relacionada con la edad neuronal coclear, mientras que la pérdida de células ganglionares espirales y sus fibras nerviosas auditivas aferentes se queda atrás^{de 17,18}. Los correlatos electrofisiológicos incluyen registros de respuestas auditivas del tronco encefálico¹⁷ y potenciales de acción compuesto⁸; sin embargo, estos no reflejan las sutilezas de la pérdida de sinapsis, ya que las fibras de baja tasa espontánea no contribuyen a estas medidas¹⁶. Las métricas electrofisiológicas más prometedoras son el índice neuronal derivado del potencial de masa¹⁹ y la respuesta de tiempo periestímulo²⁰. Sin embargo, estos solo son confiables si el animal no tiene otras patologías cocleares, más allá de la pérdida de fibras nerviosas auditivas, que afecten la actividad de las fibras nerviosas auditivas restantes⁸. Además, los umbrales evaluados conductualmente en el jerbo no se correlacionaron con los números de sinapsis²¹. Por lo tanto, la cuantificación confiable de las sinapsis de cinta sobrevivientes y, por lo tanto, el número de fibras nerviosas auditivas funcionales solo es posible mediante el examen directo del tejido coclear.

El jerbo mongol (Meriones unguiculatus) es un modelo animal adecuado para estudiar la pérdida auditiva relacionada con la edad. Tiene una vida útil corta, tiene audición de baja frecuencia similar a la humana, es fácil de mantener y muestra similitudes con patologías humanas relacionadas con la pérdida auditiva relacionada con la edad 2,22,23,24. Los jerbos se consideran envejecidos cuando alcanzan los 36 meses de edad, que está cerca del final de su vida útil promedio²². Es importante destacar que se ha demostrado una pérdida de sinapsis de cinta relacionada con la edad en jerbos criados y envejecidos en ambientes tranquilos ^8,21.

Aquí, se presenta un protocolo para inmunoetiquetar, diseccionar y analizar cócleas de jerbos de diferentes edades, desde adultos jóvenes hasta ancianos. Se utilizan anticuerpos dirigidos contra componentes del presinaptaso (CtBP2), parches de receptores de glutamato postsinápticos (GluA2) y IHC (myoVIIa). Se aplica un silenciador de autofluorescencia que reduce el fondo en las cócleas envejecidas y deja intacta la señal de fluorescencia. Además, se da una descripción de cómo diseccionar la cóclea para examinar tanto el epitelio sensorial como la estría vascular. La longitud coclear se mide para permitir la selección de distintas ubicaciones cocleares que corresponden a las mejores frecuencias específicas²⁵. La cuantificación de los números de sinapsis se lleva a cabo con el software gratuito ImageJ²⁶. La cuantificación adicional de los volúmenes y ubicaciones de sinapsis dentro del HC individual se realiza con un software personalizado escrito en Matlab. Este software no se pone a disposición del público, ya que los autores carecen de los recursos para proporcionar documentación y soporte profesional.

Protocolo

Todos los protocolos y procedimientos fueron aprobados por las autoridades competentes de Baja Sajonia, Alemania, con los números de permiso AZ 33.19-42502-04-15/1828 y 33.19-42502-04-15/1990. Este protocolo es para jerbos mongoles (M. unguiculatus) de ambos sexos. Adulto joven se refiere a la edad de 3-12 meses, mientras que los jerbos se consideran de 36 meses o más. Cuando no se indique lo contrario, los tampones y las soluciones se pueden preparar y almacenar en el refrigerador hasta por varios meses (4-8 ° C). Antes de usar, asegúrese de que los tampones y las soluciones no se hayan precipitado.

1. Fijación y recolección de órganos

NOTA: Si solo se necesitan las cócleas, se recomienda llevar a cabo el procedimiento algo más simple de fijación por inmersión. Sin embargo, si también se necesita un cerebro bien conservado, entonces la perfusión transcárdica es la única opción. El fijador en ambos casos es paraformaldehído al 4% (PFA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Esto debe ser recién hecho, pero se puede almacenar congelado hasta su uso. Use alícuotas de ~ 300 ml para una perfusión transcárdica o ~ 50-100 ml por cóclea para la fijación por inmersión.

PRECAUCIÓN: El PFA es una sustancia peligrosa; manejarlo de acuerdo con los procedimientos generales de seguridad del laboratorio.

1. Fijación por perfusión transcárdica
   1. Enjuague la configuración de perfusión hasta que el tubo esté libre de burbujas de aire. Llene el tubo de perfusión con PBS que contenga heparina (0,2 ml en 100 ml de PBS) para prevenir la coagulación de la sangre. Detenga el flujo una vez que el tubo esté lleno de PBS y la botella de almacenamiento de fluido se haya vaciado; vierta 200 ml de PFA descongelado en él.
      NOTA: La configuración ya está lista para el animal. El PBS restante en el tubo es suficiente para eliminar la sangre y será seguido automáticamente por el fijador una vez que se reanude el flujo.
   2. Asegúrese de que exista un sistema de recolección de residuos para la salida de PFA. Use una cánula fresca (19 G) y tenga a mano tijeras grandes, pinzas (con una punta aplanada), hemostáticos, bisturí o cánula afilada y una alfombra de goma con alfileres.
   3. Eutanasiar al jerbo con una sobredosis intraperitoneal de pentobarbital (160 mg/mL, 0,3 mL por animal, rango de peso corporal: 50-120 g). Vuelva a poner al animal en su jaula. Cuando el paro respiratorio se establece de tal manera que la respiración se vuelve irregular con intervalos de 30 s o más, coloque el jerbo sobre su espalda sobre la alfombra de goma y fije ambas patas delanteras y una pata trasera con alfileres (deje una pata trasera libre para moverse para un mejor juicio del éxito de la perfusión; ver nota después del paso 1.1.7).
   4. Para abrir la cavidad torácica, levante la piel por encima del esternón con fórceps y corte la piel aproximadamente 0,5 cm por debajo del esternón con tijeras hasta que el processus xiphoideus de color blanco sea visible. Sostenga el esternón en el processus xiphoideus con fórceps y corte a lo largo del diafragma para obtener una buena vista de la cavidad torácica. Cortar las costillas lateralmente por ambos lados hasta que haya un buen acceso al corazón. Asegúrese de que el ángulo de las tijeras sea paralelo y plano en relación con el cuerpo del jerbo para evitar daños en los órganos y, por lo tanto, asegurar un sistema circulatorio cerrado.
   5. Sujete un hemostático en el esternón, levante la caja torácica y coloque el hemostático sobre el hombro del jerbo sin apoyar el hemostático en ninguna parte del cuerpo para evitar bloquear el flujo sanguíneo.
   6. Abra el flujo de fluido ligeramente hasta que una gota de PBS fluya fuera de la cánula (19 G) aproximadamente cada 2 s. Sostenga el corazón con fórceps y gírelo un poco hacia la izquierda para que el ventrículo izquierdo se pueda ver claramente. Inserte la cánula en el ventrículo izquierdo en un ángulo que evite penetrar en el tabique. Sostenga la aguja en su lugar, ya sea con la mano o con otro hemostático.
      NOTA: Los ventrículos izquierdo y derecho se pueden diferenciar por sus diferentes tonos de color; el ventrículo izquierdo parece de color más claro que el resto del tejido cardíaco.
   7. Aumente lentamente la presión del flujo de líquido y abra la aurícula derecha, ya sea con tijeras finas, un bisturí u otra cánula. Abra aún más el flujo de fluido hasta que se observen aproximadamente 2-3 gotas / s en la cámara de goteo, o establezca un flujo de 4 ml / min para la bomba. Una vez que la fijación del corazón se establece, asegúrese de que la cánula de perfusión permanezca en su lugar sin ser retenida más.
      NOTA: Los signos de perfusión exitosa son contracciones musculares lentas, rigidez del cuello y las extremidades, pálido del hígado y pulmones rosados. El signo de perfusión fallida es el blanqueamiento de los pulmones, lo que indica que la circulación pulmonar se perfunde debido a la punción del tabique.
   8. En caso de perfusión fallida, intente mover la cánula más arriba, hacia la aorta, y sujete en su lugar con un hemostático.
   9. Decapitar al jerbo. Retire las ampollas y corte y rompa su hueso como se describe en el paso 1.2.2.
      NOTA: Si el tejido no está lo suficientemente fijo, el epitelio sensorial se desprenderá del órgano de Corti durante la disección.
   10. Si la perfusión no muestra signos de fijación dentro de los 5-10 minutos, abortarla e inmediatamente seguir el procedimiento a continuación para la fijación por inmersión. Para eso, trate la cóclea como en el paso 1.2.2 y coloque el tejido en aproximadamente 50-80 ml de PFA al 4% en recipientes de tapón de rosca durante 1-2 días en un agitador 2D a 8 ° C.
       NOTA: Dado que puede ser difícil calificar en última instancia la calidad de la fijación durante la perfusión, se recomienda posfijar rutinariamente las cócleas como se describe.
2. Fijación por inmersión tisular
   1. Eutanasiar a los jerbos con una sobredosis intraperitoneal de pentobarbital (160 mg/mL, 0,3 mL por animal, rango de peso corporal: 50-120 g). Cuando el jerbo haya dejado de respirar, decapita al animal.
   2. Retira las ampollas y corta y rompe su hueso con tijeras y fórceps, respectivamente, para llegar a las cócleas. Retire el maellus, el incus y los canales semicirculares. Haga pequeños agujeros en el ápice y en el giro basal rascando cuidadosamente el hueso coclear con fórceps. Transfiera inmediatamente las ampollas a un exceso de fijador en frío (al menos 50 ml) y fije el tejido en el frío (4-8 ° C) bajo agitación suave (agitador 2D [100 rpm]) durante 2 días.
      NOTA: Después de fijar el tejido, las cócleas pueden procesarse inmediatamente o almacenarse en PBS con azida de sodio al 0,05%. PRECAUCIÓN: La azida de sodio es tóxica. Tenga en cuenta que la duración del almacenamiento puede influir negativamente en la calidad de la tinción. Ensayos limitados han sugerido que la inmunotinción parecía más débil después de 2 años de almacenar el tejido en azida de sodio.

2. Preparación de tejidos e inmunoetiquetado

1. Disolver el polvo de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en PBS para producir una solución de 0,5 M a pH 8. Para esto, coloque un vaso de precipitados en un agitador magnético, llénelo con aproximadamente la mitad de la cantidad total del PBS y agregue la cantidad adecuada de polvo de EDTA, lo que resulta en una suspensión ácida. Agregue cuidadosamente la solución concentrada de hidróxido de sodio (NaOH) mientras monitorea el pH con un medidor de pH. Llene con PBS hasta el volumen final deseado y filtre la solución para evitar la contaminación microbiana.
   NOTA: El polvo de EDTA solo se disolverá por completo una vez que la suspensión haya alcanzado un valor de pH neutro.
2. Para la descalcificación, transfiera las cócleas a 80 ml de 0,5 M de EDTA en PBS. Incubar el tejido en frío (4-8 °C) bajo agitación suave en el agitador 2D (100 rpm) durante 2 días.
   NOTA: Después de la etapa de descalcificación, el tejido se puede almacenar en PBS durante varios días hasta 3 semanas antes de continuar con los pasos de procesamiento restantes. Para los anticuerpos que marcan la estría vascular, es aconsejable cortar las cócleas por la mitad a lo largo del eje modiolar en este punto (es decir, antes de la inmunotinción) para garantizar el acceso uniforme de los anticuerpos a sus respectivos objetivos. Esto es dependiente de anticuerpos y no se aplica a los anticuerpos utilizados aquí para etiquetar estructuras sinápticas y IHC. Use un trozo de hoja de afeitar rompible y un soporte para cuchillas (como se describe en el paso 4.2) para el corte.
3. Realice los siguientes pasos (hasta el paso 3.2) en tubos de reacción de sellado seguro de 2 ml. Si la pieza de tejido es demasiado grande para caber dentro del tubo, recorte el exceso de tejido con tijeras. Para mejorar la penetración de los anticuerpos, primero permeabilice el tejido en 1 ml de tritón al 1% (Tritón X-100) en PBS en el agitador 2D (100 rpm) a temperatura ambiente durante 1 h. Lave el tejido 3x con 1 ml de tritón al 0,2% (Tritón X-100) en PBS en el agitador 2D (100 rpm) a temperatura ambiente durante 5 minutos cada uno.
4. Para bloquear antígenos inespecíficos, incubar las cócleas en 1 ml de solución bloqueadora (albúmina sérica bovina al 3% [BSA], tritón al 0,2%, en PBS) en el agitador 2D (100 rpm) a temperatura ambiente durante 1 h.
   NOTA: La solución de bloqueo se puede preparar con anticipación, pero no debe tener más de ~ 10 días.
5. Diluir los siguientes anticuerpos primarios recién en la misma alícuota de solución bloqueadora: anti-mioVIIa (miosina VIIa) para etiquetar los IHC (conejo policlonal IgG), diluido 1:400; anti-CtBP2 (proteína de unión C-terminal 2) para etiquetar cintas presinápticas (ratón monoclonal IgG1), diluido 1:400; y anti-GluA2 para etiquetar parches de receptores postsinápticos (ratón monoclonal IgG2a), diluido 1:200. Asegúrese de que las cócleas estén completamente cubiertas con la solución de anticuerpos (normalmente 0,4 ml) e incube a 37 °C durante 24 h.
6. A continuación, lave el tejido 5 veces con tritón al 0,2% en PBS en el agitador 2D (100 rpm) a temperatura ambiente durante 5 minutos cada uno. Elegir anticuerpos secundarios para que coincidan con las especies huésped de sus contrapartes primarias y nuevamente diluirlos recién diluidos en 3% BSA, 0.2% tritón, en PBS: cabra anti-ratón (IgG1)-Alexa fluoróforo (AF) 488, diluido 1: 1,000; cabra anti-ratón (IgG2a)-AF568, diluido 1:500; y burro anti-conejo-AF647 (IgG), diluido 1:1.000. Envuelva el tubo en papel de aluminio para evitar el blanqueamiento de la fluorescencia. Incubar las cócleas en 0,4 ml de solución de anticuerpos secundarios a 37 °C durante 24 h.
   NOTA: Ensayos limitados han indicado que la incubación de tejido coclear a 37 °C durante 24 h con anticuerpos primarios y secundarios dio lugar a una inmunotinción más brillante que seguir el procedimiento de incubación más común con temperaturas más bajas y duraciones más cortas.
7. Lave las cócleas 2x con 1 ml de tritón al 0,2% en PBS durante 5 min cada una y 3x con PBS durante 5 min cada una en el agitador 2D (100 rpm) a temperatura ambiente.
   NOTA: Después de estos pasos de lavado, las cócleas pueden permanecer en PBS en el refrigerador a ~ 4 ° C durante varios días.

3. Tratamiento con quencher de autofluorescencia (opcional)

NOTA: Las cócleas de jerbos de mediana edad y envejecidos muestran una amplia autofluorescencia de fondo. En el tejido de adultos jóvenes, no es necesario el tratamiento con un bloqueador de autofluorescencia. En principio, es posible aplicar el atenuador de autofluorescencia antes del procedimiento de inmunotinción, lo que evita cualquier reducción inadvertida de la fluorescencia de anticuerpos deseada. Sin embargo, según la hoja de datos del fabricante, el uso de detergentes (como Triton X-100 en el protocolo actual) ya no es posible, ya que eliminan el quencher del tejido.

1. Cortar las cócleas por la mitad bajo un estereomicroscopio, como se describe en el paso 4.2.
2. Mezcle el quencher de autofluorescencia con etanol al 70% para obtener una solución al 5% e incube las cócleas en esta solución en el agitador 2D a temperatura ambiente durante 1 min. Lave las cócleas 3x con 1 ml de PBS en el agitador 2D a temperatura ambiente durante 5 minutos cada una.
   PRECAUCIÓN: El bloqueador de autofluorescencia es peligroso y dañino. Use guantes cuando manipule esta sustancia.

4. Disección fina final

1. Diseccionar la cóclea bajo un estereomicroscopio. Llene una placa de Petri de poliestirole y su tapa con PBS y tenga a mano dos pinzas finas, tijeras de resorte Vannas, un soporte para cuchillas y una cuchilla de afeitar rompible. Rompa las piezas de la hoja de afeitar para obtener una superficie de corte de ~ 2-4 mm dependiendo del paso de disección. Prepare un portaobjetos de microscopio colocando tres gotas de medio de montaje seguidas.
   NOTA: La superficie de corte de la cuchilla de afeitar desaparece rápidamente. La cuchilla debe intercambiarse después de diseccionar y montar aproximadamente cada segundo trozo de la cóclea.
2. Si aún no se ha hecho en el paso 3.1, primero corte la cóclea por la mitad a lo largo del modiolus debajo de un estereomicroscopio. Para esto, coloque un trozo de una hoja de afeitar más larga que la longitud enrollada de la cóclea en un soporte de cuchilla. Coloque la cóclea en la placa de Petri y corte el exceso de tejido con el trozo de cuchilla de afeitar. Sostenga la cóclea en su lugar con fórceps finos y córtela por la mitad a lo largo del modiolus.
3. Comience con una mitad, pero deje la otra mitad en la placa de Petri también. Fije cuidadosamente la mitad coclear con fórceps de tal manera que el filo de corte esté orientado hacia arriba. Use tijeras finas de resorte para cortar el hueso de la cóclea por encima del helicotrema, cubriendo el ápice.
4. Para comenzar la separación de las piezas cocleares, aísle el giro medio cortando con tijeras a través del modiolus y el nervio auditivo, por encima (scala vestibuli) y por debajo (scala tympani).
5. Corte a través del hueso coclear que cubre la estría vascular dentro del conducto coclear. Haga dos cortes a ambos lados del hueso coclear por encima del órgano de Corti y a lo largo de la estría vascular y use la hoja de afeitar para eventualmente separar las piezas cocleares.
   NOTA: La estría vascular es fácilmente visible como una franja oscura. El corte a lo largo de la estría vascular deja intacto el órgano de Corti.
6. Opcional: Para recoger la estría vascular, corte cuidadosamente entre el órgano de Corti y la estría vascular para separar los dos. Deje la estría vascular conectada al ligamento espiral (unido al hueso que cubre la superficie externa de la cóclea) y retire el hueso descalcificado con fórceps. Coloque la pieza con el lado de estría hacia arriba en el portaobjetos del microscopio en una gota de medio de montaje.
   NOTA: Si la pieza recogida está curvada con demasiada fuerza, puede ser necesario dividirla en piezas más pequeñas para que sea lo suficientemente plana como para montarla en la corredera.
7. Transfiera las piezas cocleares a la tapa llena de PBS de la placa de Petri poliestirólica, asegurándose de que los soportes enteros cocleares queden lo más planos posible en la corredera. Elimine el exceso de tejido, como partes del ligamento espiral en el lado abneural y partes del limbo espiral en el lado neural. Retire con cuidado la membrana tectorial con pinzas súper finas.
8. Coloque las piezas cocleares en la corredera en una gota de medio de montaje. Coloque los soportes enteros cocleares con el órgano de Corti hacia arriba en la diapositiva para evitar oscurecer los IHC en la trayectoria óptica para la obtención de imágenes. Busque la invaginación del limbo espiral muy cerca de los IHC, que es visible al desplazar la pieza coclear hacia el plano sagital para identificar el lado a mirar hacia arriba.
   NOTA: Para reconstruir digitalmente la cóclea completa a partir de sus piezas individuales durante el procesamiento posterior, se recomienda encarecidamente documentar los bocetos de las piezas y anotar los puntos de referencia. Además, lo ideal es que las piezas estén dispuestas en el orden correcto en la diapositiva.
9. Repita los pasos 4.3 a 4.8 hasta que toda la cóclea se transfiera al portaobjetos del microscopio. Si es necesario, agregue más medio de montaje, cubra la diapositiva y selle la cubierta en su lugar con esmalte de uñas negro pintado alrededor de los bordes. Deje que se seque en la oscuridad a temperatura ambiente y luego guarde el portaobjetos en la oscuridad a 4 ° C.
   NOTA: Incluso si partes del epitelio sensorial en sí se pierden accidentalmente, es importante montar lo que queda de la pieza coclear para una estimación correcta de la longitud.

5. Medición de la longitud coclear

1. Mida la longitud de la cóclea a partir de imágenes de campo brillante de sus piezas utilizando un sistema de microscopio de epifluorescencia y el software asociado. Guarde imágenes de bajo aumento (lente 4x) de cada pieza coclear y utilice la herramienta de medición de lazo del software del microscopio para dibujar una línea a lo largo de la fila de IHC en cada una de las imágenes. Calcula la longitud total sumando las longitudes de todas las piezas.
   NOTA: Cuando falten partes del epitelio sensorial dentro de una pieza coclear, interpole la línea.
2. Para definir las ubicaciones cocleares que deben analizarse en una cóclea individual, calcule sus distancias correspondientes desde el ápice utilizando la ecuación dada por Müller²⁵. Marque estas ubicaciones, por ejemplo, en una impresión de las piezas cocleares.

6. Adquisición de imágenes con un microscopio confocal

1. Utilice un microscopio confocal con un objetivo de inmersión en aceite 40x (apertura numérica 1.3) y el aceite apropiado para imágenes de alta resolución.
   NOTA: Si el microscopio confocal tiene una trayectoria de luz invertida, la diapositiva debe colocarse boca abajo. En este caso, dé a la muestra aproximadamente 30 minutos para que se hunda y descanse de manera estable en la cubierta antes de comenzar el escaneo final. Alternativamente, use un medio de montaje que sea fluido durante toda la duración de la disección, pero que se solidifique más tarde y conserve simultáneamente la fluorescencia.
2. Activar los láseres apropiados: en este protocolo se utilizan dos láseres semiconductores bombeados ópticamente con longitudes de onda de λ = 488 nm y λ = 522 nm, y un láser de diodo con una longitud de onda de λ = 638 nm. Elija el rango de emisión de las etiquetas de fluorescencia (AF488: 499-542 nm, AF568: 582-621 nm, AF647: 666-776 nm). A medida que un detector híbrido cuenta los fotones liberados, coloque la línea láser al menos a 10 nm de distancia de la curva de emisión.
   NOTA: Es importante realizar comprobaciones preliminares con tejido de una sola etiqueta para garantizar que los anchos de banda del detector elegidos separen limpiamente los canales de color (es decir, no conduzcan a la diafonía del canal). Las ondas de radio interfieren con el detector híbrido, lo que resulta en un recuento máximo de fotones y, por lo tanto, causan rayas artefactuales en la pila. Por lo tanto, evite usar un teléfono móvil cerca del microscopio.
3. Amplíe el tejido hasta que la imagen abarque 10 IHC. Elija la resolución de la imagen de acuerdo con el muestreo de Nyquist, que generalmente es de ~ 40-60 nm / píxel. Establezca el tamaño del paso en la dirección z en 0,3 μm y la velocidad de imagen en 400-700 Hz.
   NOTA: Ambas configuraciones (tamaño de paso y velocidad de imagen) son compromisos entre el uso de parámetros de imagen óptimos y el ahorro de tiempo de escaneo.
4. Realice muestreo bidireccional para acortar el tiempo de obtención de imágenes. Acumule la trama para el canal 3x de 488 nm y 638 nm y para el canal 6x de 522 nm; además, promedie las líneas 3x para cada canal. Elija el principio y el final de la pila en la dimensión z.
5. Establezca la ganancia en 100 cuando use el detector híbrido (modo de conteo) para evitar una disminución de la relación señal-ruido. Ajuste la potencia del láser para que ningún píxel esté saturado en la región de interés, pero las estructuras cubren principalmente el rango completo de 8 bits. Comience con una potencia láser baja del 0,5% y aumente hasta que las estructuras sean visibles.
   NOTA: Una buena tinción generalmente necesita una potencia láser entre 0.1% y 5%.
6. Utilice un software de deconvolución para el procesamiento post hoc de las pilas de imágenes para eliminar el halo borroso alrededor de pequeñas estructuras fluorescentes utilizando una función teórica de dispersión de puntos. Utilice la misma configuración para cada pila dentro de un experimento. Guarde las imágenes descontorneadas como .tif o .ics.
   NOTA: La etiqueta myoVIIa (IHC) no se beneficia de la deconvolución y puede omitirse para ahorrar tiempo. El software utiliza metadatos de los archivos de imagen; sin embargo, es necesario especificar varios parámetros, como la trayectoria de la luz, el medio de incrustación o el medio de inmersión.

7. Cuantificación de sinapsis

1. Abra una copia de las pilas descontorneadas en el software de libre acceso ImageJ con el complemento biovoxxel adicional, que también está disponible en su sitio web.
2. Ajuste los colores de los canales individuales dividiendo los canales (Imagen | | de color Dividir canales) y fusionar (Imagen | | de color Merge Channels) ellos de nuevo, asignando diferentes colores. Convertir la imagen en una pila RGB (Imagen | | de color Apilar a RGB) y ajustar el brillo y el contraste (Imagen | Ajustar | | brillo/contraste ya sea Automático o deslizador con respecto al Máximo), si es necesario, de modo que las estructuras pre y postsinápticas y la etiqueta IHC sean agradablemente distintas del fondo.
3. Elija cinco IHC y etiquételos con la herramienta de texto (IHC1-IHC5) haciendo clic en la ubicación deseada dentro de la pila. Abra el gestor de ROI (Analizar | Herramientas | Gerente de ROI); active la casilla Etiquetas para etiquetar los puntos con un número. Haga zoom en el IHC de interés.
4. Utilice la herramienta punto/multipunto en modo multipunto (haga clic con el botón derecho en la herramienta para elegir entre el modo de punto o multipunto). Haga clic en una sinapsis de cinta funcional (es decir, una cinta presináptica en yuxtaposición cercana a un parche de glutamato postsináptico) mientras se desplaza por la dimensión z.
   NOTA: Dependiendo de su cantidad de superposición y del color elegido para cada canal, los píxeles compartidos aparecen en color mixto. Por lo general, la distinción entre las sinapsis funcionales individuales es simple porque están lo suficientemente distantes entre sí.
5. Cuando todas las estructuras de interés estén marcadas, haga clic en Agregar en la interfaz gráfica de usuario del administrador de ROI. Haga clic en el nombre arbitrario y elija Cambiar nombre.
   NOTA: Las etiquetas de puntos aún permanecen en todos los planos de la pila cuando se selecciona la casilla mostrar todo en el menú de opciones de la herramienta de puntos (haga doble clic en el icono de la herramienta de puntos ), lo que ayuda a evitar contar la misma sinapsis de cinta varias veces.
6. Al elegir el siguiente IHC para contar, evite agregar recuentos inadvertidamente ajustando la imagen para mostrar completamente el próximo IHC con la herramienta manual. Cambie de herramienta multipunto a herramienta punto para evitar agregar más puntos a los datos almacenados anteriormente. Haga clic en una estructura de interés dentro de la siguiente IHC y vuelva a cambiar a la herramienta multipunto. Repita los pasos 7.4 a 7.5 hasta que se evalúen todos los IHC de interés.
7. Para guardar datos, haga clic en un conjunto de datos en el administrador de ROI y luego en medir. Espere a que aparezca una nueva ventana, enumerando los puntos de datos medidos. Guarde esta lista como un archivo de hoja de cálculo (archivo | Guardar como). Guarde la imagen activando Mostrar todo en el administrador de ROI. Haga clic en Aplanar para agregar permanentemente las etiquetas de punto a la pila. Al cerrar la pila de imágenes , acepte guardar los cambios.

8. Análisis del volumen y la posición de la sinapsis en la célula ciliada

NOTA: Los autores utilizaron un procedimiento programado a medida basado en Matlab. Dado que no está disponible públicamente, se describe aquí solo en términos generales (véase también⁷). Por favor, póngase en contacto con el autor correspondiente si está interesado en utilizarlo. El procedimiento espera una pila de imágenes de triple etiqueta (IHC, pre y postsináptica) en formato TIFF como entrada, guía al usuario a través de los diversos pasos del análisis a través de una interfaz gráfica y proporciona una amplia salida de los resultados en formato de hoja de cálculo.

1. Normalizar la posición de las estructuras sinápticas a un sistema de coordenadas 3D definido por la extensión individual de la IHC en el eje pilar-modiolar y el eje coclear apical-basal y el eje superior (placa cuticular) a la parte inferior (polo sináptico) de la IHC.
   NOTA: Los volúmenes de los elementos sinápticos (tanto pre como postsinápticos, y el volumen combinado de sinapsis funcionales) se proporcionan en μm³ y se normalizan al valor medio respectivo³.

Resultados

Las cócleas se cosecharon después de la perfusión cardiovascular con fijador de todo el animal o se diseccionaron rápidamente después de la eutanasia del animal y se fijaron por inmersión. Con este último método, los IHC permanecieron en su lugar durante la disección, mientras que, en casos de perfusión fallida y, por lo tanto, de tejido insuficientemente fijo, el epitelio sensorial a menudo se destruyó. Tenga en cuenta que los autores encontraron casos en los que la fijación de las cócleas después de la pe...

Discusión

Con el método descrito en este protocolo, es posible inmunoetiquetar IHC y estructuras sinápticas en cócleas de jerbos adultos jóvenes y envejecidos, identificar presuntas sinapsis funcionales mediante la colocalización de elementos pre y postsinápticos, asignarlos a IHC individuales y cuantificar su número, volumen y ubicación. Los anticuerpos utilizados en este enfoque también etiquetaron las células ciliadas externas (OHC; myoVIIa) y sus cintas presinápticas. Además, una alternativa viable para el inmunoe...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin Fraction V biotin-free	Carl Roth	0163.2
anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse)	BD Biosciences, Eysins	612044
anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse)	Millipore	MAB39
anti-mouse (IgG1)-AF 488	Molecular Probes Inc.	A21121
anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit)	Proteus Biosciences	25e6790
Blade Holder & Breaker - Flat Jaws	Fine Science Tools	10052-11
Bonn Artery Scissors - Ball Tip	Fine Science Tools	14086-09
Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm	Carl Roth	LH26.1
Disposable Surgical Blade	Henry Schein	0473
donkey anti-rabbit (IgG)-AF647	Life Technologies-Molecular Probes	A-31573
Dumont #5 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Ethanol, absolute 99.8%	Fisher Scientific	12468750
Ethylenediaminetetraacetic acid	Carl Roth	8040.2
Excel	Microsoft Corporation
Feather Double Edge Blade	PLANO	112-9
G19 Cannula	Henry Schein	9003633
goat anti-mouse (IgG2a)-AF568	Invitrogen	A-21134
Heparin	Ratiopharm	N68542.04
Huygens Essentials	Scientific Volume Imaging
ImageJ	Fiji
Immersol, Immersion oil 518F	Carl Zeiss	10539438
Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung)	Braun	4062957E
ISM596D	Ismatec		peristaltic pump
KL 1600 LED	Schott	150.600	light source for stereomicroscope
Leica Application suite X	Leica Microsystem CMS GmbH
Leica TCS SP8 system	Leica Microsystem CMS GmbH
Matlab	The Mathworks Inc.
Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut	Fine Science Tools	14512-17
Mini-100 Orbital-Genie	Scientific Industries	SI-M100	for use in cold environment
Narcoren (pentobarbital)	Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Nikon Eclipse Ni-Ei	Nikon
NIS Elements	Nikon Europe B.V.
Paraformaldehyde	Carl Roth	0335.3
Petri dish without vents	Avantor VWR	390-1375
Phosphate-buffered saline:
Disodium phosphate	AppliChem	A1046
Monopotassium phosphate	Carl Roth	3904.1
Potassium chloride	Carl Roth	6781.1
Sodium chloride	Sigma Aldrich	31434-M
Screw Cap Containers	Sarstedt	75.562.300
Sodium azide	Carl Roth	K305.1
Student Adson Forceps	Fine Science Tools	91106-12
Student Halsted-Mosquito Hemostat	Fine Science Tools	91308-12
Superfrost Adhesion Microscope Slides	Epredia	J1800AMNZ
Triton  X	Carl Roth	3051.2
TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher	Biotium	23007
Vannas Spring Scissors, 3mm	Fine Science Tools	15000-00
Vectashield Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
Vibrax VXR basic	IKA	0002819000
VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic	IKA	953300
Wild TYP 355110 (Stereomicroscope)	Wild Heerbrugg		not available anymore