Immunmarkierung und Zählbandsynapsen bei jungen Erwachsenen und älteren Rennmaus-Cochleae

Zusammenfassung

Es wird ein Protokoll zur Verarbeitung von Cochleae für junge Erwachsene und ältere Rennmäuse durch Immunmarkierung der afferenten synaptischen Strukturen und Haarzellen, Abschreckung der Autofluoreszenz in gealtertem Gewebe, Sezieren und Abschätzen der Länge der Cochleae und Quantifizierung der Synapsen in Bildstapeln vorgestellt, die mit konfokaler Bildgebung erhalten wurden.

Zusammenfassung

Es wird angenommen, dass der Verlust von Bandsynapsen, die innere Haarzellen und afferente Hörnervenfasern verbinden, eine Ursache für altersbedingten Hörverlust ist. Die gebräuchlichste Methode zum Nachweis des Verlustes von Bandsynapsen ist die Immunmarkierung, da sie eine quantitative Probenahme von mehreren tonotopischen Stellen in einer einzelnen Cochlea ermöglicht. Die interessierenden Strukturen sind jedoch tief im Inneren der knöchernen Cochlea vergraben. Rennmäuse werden als Tiermodell für altersbedingten Hörverlust verwendet. Hier werden Routineprotokolle für die Fixierung, die Immunmarkierung von Gerbil-Cochlea-Ganzkörpern, konfokale Bildgebung und die Quantifizierung von Bandsynapsenzahlen und -volumina beschrieben. Darüber hinaus werden die besonderen Herausforderungen hervorgehoben, die mit der Beschaffung von gutem Material von wertvollen alternden Menschen verbunden sind.

Rennmäuse werden eingeschläfert und entweder kardiovaskulär durchblutet, oder ihre Paukenfelle werden vorsichtig aus dem Schädel seziert. Die Cochleae werden an der Spitze und Basis geöffnet und direkt auf das Fixiermittel übertragen. Unabhängig von der Ausgangsmethode werden die Cochleae postfixiert und anschließend entkalkt. Das Gewebe wird dann mit primären Antikörpern gegen prä- und postsynaptische Strukturen und Haarzellen markiert. Als nächstes werden die Cochleae mit sekundären fluoreszenzmarkierten Antikörpern inkubiert, die spezifisch gegen ihre jeweiligen primären Antikörper sind. Die Cochleae gealterter Rennmäuse werden dann mit einem Autofluoreszenz-Quencher behandelt, um die typischerweise erhebliche Hintergrundfluoreszenz älterer Tiergewebe zu reduzieren.

Schließlich werden Cochleae in 6-11 Segmente zerlegt. Die gesamte Cochlea-Länge wird so rekonstruiert, dass bestimmte Cochlea-Stellen zuverlässig zwischen Individuen bestimmt werden können. Konfokale Bildstapel, die sequentiell aufgenommen werden, helfen, Haarzellen und Synapsen an den ausgewählten Stellen zu visualisieren. Die konfokalen Stapel werden dekonvolutiert, und die Synapsen werden entweder manuell mit ImageJ gezählt, oder eine umfangreichere Quantifizierung synaptischer Strukturen wird mit Bildanalyseverfahren durchgeführt, die speziell in Matlab geschrieben wurden.

Einleitung

Altersbedingter Hörverlust ist eine der weltweit am weitesten verbreiteten Krankheiten, von der mehr als ein Drittel der Weltbevölkerung im Alter von 65 Jahren und älter betroffen^{ist 1}. Die zugrunde liegenden Ursachen werden noch diskutiert und aktiv untersucht, können aber den Verlust der spezialisierten Synapsen umfassen, die innere Haarzellen (IHCs) mit afferenten Hörnervenfasern verbinden². Diese Bandsynapsen bestehen aus einer präsynaptischen Struktur, an die Vesikel mit dem daran gebundenen Neurotransmitter Glutamat gefüllt sind, sowie aus postsynaptischen α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionsäure (AMPA)-Glutamatrezeptoren ^3,4,5. In der Rennmaus berühren ~ 20 afferente Hörnervenfasern eine IHC ^6,7,8. Fasern auf dem IHC, die dem Modiolus zugewandt sind, stehen großen synaptischen Bändern gegenüber, während die Fasern, die sich auf der Säulenseite des IHC verbinden, kleinen synaptischen Bändern gegenüberstehen (dh bei Katzen⁹, Rennmäusen⁷, Meerschweinchen 10 und Mäusen 3,11,12,13,14). Darüber hinaus sind bei der Rennmaus die Größe der präsynaptischen Bänder und der postsynaptischen Glutamatflecken positiv korreliert ^7,14. Fasern, die großen Bändern auf der modiolären Seite des IHC entgegengesetzt sind, sind kleinkalibrig und haben niedrige spontane Raten und hohe Schwellen¹⁵. Es gibt Hinweise darauf, dass Fasern mit niedriger spontaner Rate^anfälliger für Lärmexposition 10 und ototoxische Medikamente 16 sind als hochspontane niedrigschwellige Fasern, die sich auf der Säulenseite von IHCs¹⁵ befinden.

Der Verlust von Bandsynapsen ist das früheste degenerative Ereignis bei altersbedingtem Hörverlust im Cochlea-Neuralbereich, während der Verlust von Spiralganglionzellen und ihren afferenten Hörnervenfasern hinter^17,18 zurückbleibt. Elektrophysiologische Korrelate umfassen Aufzeichnungen von auditiven Hirnstammreaktionen¹⁷ und zusammengesetzten Aktionspotentialen⁸; Diese spiegeln jedoch nicht die Feinheiten des Synapsenverlustes wider, da Fasern mit niedriger spontaner Rate nicht zu diesen Maßnahmen beitragen¹⁶. Weitere vielversprechende elektrophysiologische Metriken sind der vom Massenpotential abgeleitete neuronale Index¹⁹ und die peristimulus time response²⁰. Diese sind jedoch nur dann zuverlässig, wenn das Tier keine anderen Cochlea-Pathologien hat, abgesehen vom Verlust der Hörnervenfasern, die die Aktivität der verbleibenden Hörnervenfasern beeinflussen⁸. Darüber hinaus wurden verhaltensbezogene Schwellenwerte in der Rennmaus nicht mit Synapsenzahlen²¹ korreliert. Eine zuverlässige Quantifizierung der überlebenden Bandsynapsen und damit der Anzahl der funktionellen Hörnervenfasern ist daher nur durch direkte Untersuchung des Cochlea-Gewebes möglich.

Die Mongolische Rennmaus (Meriones unguiculatus) ist ein geeignetes Tiermodell zur Untersuchung von altersbedingtem Hörverlust. Es hat eine kurze Lebensdauer, hat ein niederfrequentes Gehör ähnlich dem Menschen, ist leicht zu pflegen und zeigt Ähnlichkeiten mit menschlichen Pathologien im Zusammenhang mit altersbedingtem Hörverlust 2,22,23,24. Rennmäuse gelten als gealtert, wenn sie 36 Monate alt sind, was dem Ende ihrer durchschnittlichen Lebensdauer^{von 22} entspricht. Wichtig ist, dass ein altersbedingter Verlust von Bandsynapsen bei Rennmäusen nachgewiesen wurde, die in ruhigen Umgebungen aufgezogen und gealtert sind ^8,21.

Hier wird ein Protokoll zur Immunmarkierung, Sezierung und Analyse von Cochleae von Rennmäusen unterschiedlichen Alters, von jungen Erwachsenen bis zu älteren Menschen, vorgestellt. Antikörper, die gegen Komponenten der Präsynapse (CtBP2), postsynaptische Glutamatrezeptorpflaster (GluA2) und IHCs (myoVIIa) gerichtet sind, werden verwendet. Es wird ein Autofluoreszenz-Quencher angewendet, der den Hintergrund in gealterten Cochleae reduziert und das Fluoreszenzsignal intakt lässt. Weiterhin wird beschrieben, wie die Cochlea zu sezieren ist, um sowohl das sensorische Epithel als auch die Stria vascularis zu untersuchen. Die Cochlea-Länge wird gemessen, um die Auswahl verschiedener Cochlea-Positionen zu ermöglichen, die bestimmten besten Frequenzen^{entsprechen 25}. Die Quantifizierung von Synapsenzahlen erfolgt mit der frei verfügbaren Software ImageJ²⁶. Eine zusätzliche Quantifizierung von Synapsenvolumina und -positionen innerhalb des einzelnen HC erfolgt mit einer in Matlab benutzerdefinierten Software. Diese Software wird nicht öffentlich zugänglich gemacht, da den Autoren die Ressourcen fehlen, um professionelle Dokumentation und Unterstützung bereitzustellen.

Protokoll

Alle Protokolle und Verfahren wurden von den zuständigen Behörden Niedersachsens, Deutschland, mit den Genehmigungsnummern AZ 33.19-42502-04-15/1828 und 33.19-42502-04-15/1990 genehmigt. Dieses Protokoll gilt für mongolische Rennmäuse (M. unguiculatus) beiderlei Geschlechts. Junger Erwachsener bezieht sich auf das Alter von 3-12 Monaten, während Rennmäuse im Alter von 36 Monaten und älter gelten. Wenn nicht anders angegeben, können Puffer und Lösungen vorbereitet und bis zu mehreren Monaten (4-8 °C) im Kühlschrank gelagert werden. Stellen Sie vor dem Gebrauch sicher, dass die Puffer und Lösungen nicht ausgefällt wurden.

1. Fixierung und Orgelentnahme

HINWEIS: Wenn nur die Cochleae benötigt werden, wird empfohlen, das etwas einfachere Verfahren der Fixierung durch Eintauchen durchzuführen. Wenn jedoch auch ein gut erhaltenes Gehirn benötigt wird, ist die transkardiale Perfusion die einzige Option. Das Fixiermittel ist in beiden Fällen 4% Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Diese sollte frisch zubereitet werden, kann aber bis zur Verwendung gefroren gelagert werden. Verwenden Sie Aliquots von ~ 300 ml für eine transkardiale Perfusion oder ~ 50-100 ml pro Cochlea für die Fixierung durch Immersion.

ACHTUNG: PFA ist ein gefährlicher Stoff; Behandeln Sie es gemäß den allgemeinen Sicherheitsverfahren des Labors.

1. Fixierung durch transkardiale Perfusion
   1. Spülen Sie das Perfusionssetup, bis der Schlauch frei von Luftblasen ist. Füllen Sie den Perfusionsschlauch mit PBS, das Heparin enthält (0,2 ml in 100 ml PBS), um eine Blutgerinnung zu verhindern. Stoppen Sie den Fluss, sobald der Schlauch mit PBS gefüllt ist und sich die Flüssigkeitsvorratsflasche gerade geleert hat. Gießen Sie 200 ml aufgetautes PFA hinein.
      HINWEIS: Das Setup ist jetzt bereit für das Tier. Das verbleibende PBS im Schlauch reicht aus, um das Blut auszuspülen, und wird automatisch von dem Fixiermittel gefolgt, sobald der Fluss wieder aufgenommen wird.
   2. Stellen Sie sicher, dass ein Abfallsammelsystem für den Abfluss von PFA vorhanden ist. Verwenden Sie eine frische Kanüle (19 G) und haben Sie eine große Schere, eine Pinzette (mit abgeflachter Spitze), Hämostaten, Skalpell oder scharfe Kanüle und eine Gummimatte mit Stiften zur Hand.
   3. Euthanasie die Rennmaus mit einer intraperitonealen Überdosierung von Pentobarbital (160 mg / ml, 0,3 ml pro Tier, Körpergewichtsbereich: 50-120 g). Setzen Sie das Tier wieder in seinen Käfig. Wenn der Atemstillstand so einsetzt, dass die Atmung in Abständen von 30 s oder länger unregelmäßig wird, legen Sie die Rennmaus auf den Rücken auf die Gummimatte und fixieren Sie beide Vorderpfoten und eine Hinterpfote mit Stiften (lassen Sie eine Hinterpfote frei, um sich zu bewegen, um den Durchblutungserfolg besser beurteilen zu können; siehe Hinweis nach Schritt 1.1.7).
   4. Um die Brusthöhle zu öffnen, heben Sie die Haut über dem Brustbein mit einer Pinzette an und schneiden Sie die Haut etwa 0,5 cm unterhalb des Brustbeins mit einer Schere, bis der weiß gefärbte Processus xiphoideus sichtbar ist. Halten Sie das Brustbein am Processus xiphoideus mit einer Pinzette fest und schneiden Sie es entlang des Zwerchfells, um einen guten Blick in die Brusthöhle zu erhalten. Schneiden Sie die Rippen seitlich auf beiden Seiten ab, bis ein guter Zugang zum Herzen besteht. Stellen Sie sicher, dass der Winkel der Schere parallel und flach in Bezug auf den Körper der Rennmaus ist, um Schäden an Organen zu vermeiden und somit ein geschlossenes Kreislaufsystem zu gewährleisten.
   5. Klemmen Sie einen Hämostat auf das Brustbein, heben Sie den Brustkorb an und legen Sie den Hämostat über die Schulter der Rennmaus, ohne den Hämostat auf Körperteilen abzulegen, um zu vermeiden, dass der Blutfluss blockiert wird.
   6. Öffnen Sie den Flüssigkeitsstrom leicht, bis etwa alle 2 s ein Tropfen PBS aus der Kanüle (19 G) fließt. Halten Sie das Herz mit einer Pinzette fest und drehen Sie es ein wenig nach links, so dass der linke Ventrikel deutlich zu sehen ist. Führen Sie die Kanüle in einem Winkel in den linken Ventrikel ein, der ein Eindringen in das Septum vermeidet. Halten Sie die Nadel entweder von Hand oder mit einem anderen Hämostat an Ort und Stelle.
      HINWEIS: Der linke und rechte Ventrikel können durch ihre unterschiedlichen Farbtöne unterschieden werden; Der linke Ventrikel erscheint heller in der Farbe als der Rest des Herzgewebes.
   7. Erhöhen Sie langsam den Druck des Flüssigkeitsstroms und öffnen Sie den rechten Vorhof entweder mit einer feinen Schere, einem Skalpell oder einer anderen Kanüle. Öffnen Sie den Flüssigkeitsstrom weiter, bis etwa 2-3 Tropfen / s an der Tropfkammer beobachtet werden, oder stellen Sie einen Durchfluss von 4 ml / min für die Pumpe ein. Sobald die Fixierung des Herzens einsetzt, stellen Sie sicher, dass die Perfusionskanüle an Ort und Stelle bleibt, ohne weiter gehalten zu werden.
      HINWEIS: Anzeichen einer erfolgreichen Perfusion sind langsame Muskelkontraktionen, Versteifung des Halses und der Extremitäten, blasse Leber und rosige Lungen. Das Zeichen einer erfolglosen Perfusion ist die Aufhellung der Lunge, was darauf hindeutet, dass der Lungenkreislauf aufgrund einer Punktion des Septums durchblutet ist.
   8. Bei erfolgloser Durchblutung versuchen Sie, die Kanüle weiter nach oben in die Aorta zu bewegen und mit einem Hämostat festzuklemmen.
   9. Enthaupte die Rennmaus. Entfernen Sie die Bullen und schneiden und brechen Sie ihren Knochen ab, wie in Schritt 1.2.2 beschrieben.
      HINWEIS: Wenn das Gewebe nicht ausreichend fixiert ist, löst sich das sensorische Epithel während der Dissektion aus dem Corti-Organ.
   10. Wenn die Perfusion innerhalb von 5-10 Minuten keine Anzeichen einer Fixierung zeigt, brechen Sie sie ab und befolgen Sie sofort das folgende Verfahren zur Fixierung durch Eintauchen. Behandeln Sie dazu die Cochlea wie in Schritt 1.2.2 und postfixieren Sie das Gewebe in ca. 50-80 ml 4% PFA in Schraubverschlussbehältern für 1-2 Tage auf einem 2D-Shaker bei 8 °C.
       HINWEIS: Da es schwierig sein kann, die Qualität der Fixierung während der Perfusion letztendlich zu bewerten, wird empfohlen, die Cochleae routinemäßig wie beschrieben zu postfixieren.
2. Fixierung durch Eintauchen in das Gewebe
   1. Euthanasie die Rennmäuse mit einer intraperitonealen Überdosierung von Pentobarbital (160 mg / ml, 0,3 ml pro Tier, Körpergewichtsbereich: 50-120 g). Wenn die Rennmaus aufgehört hat zu atmen, enthaupten Sie das Tier.
   2. Entfernen Sie die Bullen und schneiden und brechen Sie ihren Knochen mit einer Schere bzw. einer Pinzette ab, um die Cochleae zu erreichen. Entfernen Sie die Kanäle Maellus, Incus und Halbkreis. Machen Sie kleine Löcher an der Spitze und in der basalen Drehung, indem Sie vorsichtig mit der Pinzette über das Cochlea-Knochen kratzen. Übertragen Sie die Bullen sofort in einen Überschuss an kaltem Fixiermittel (mindestens 50 ml) und fixieren Sie das Gewebe in der Kälte (4-8 ° C) unter sanfter Bewegung (2D-Shaker [100 U / min]) für 2 Tage.
      HINWEIS: Nach dem Fixieren des Gewebes können die Cochleae entweder sofort verarbeitet oder in PBS mit 0,05% Natriumazid gelagert werden. ACHTUNG: Natriumazid ist giftig. Beachten Sie, dass die Lagerdauer die Qualität der Färbung negativ beeinflussen kann. Begrenzte Studien haben gezeigt, dass die Immunfärbung nach 2 Jahren der Lagerung des Gewebes in Natriumazid schwächer erschien.

2. Gewebeaufbereitung und Immunmarkierung

1. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Pulver in PBS lösen, um eine 0,5 M Lösung bei pH 8 zu erzeugen. Legen Sie dazu ein Becherglas auf einen Magnetrührer, füllen Sie es mit etwa der Hälfte der Gesamtmenge des PBS und fügen Sie die entsprechende Menge EDTA-Pulver hinzu, was zu einer sauren Suspension führt. Fügen Sie vorsichtig konzentrierte Natriumhydroxidlösung (NaOH) hinzu, während Sie den pH-Wert mit einem pH-Messgerät überwachen. Füllen Sie PBS bis zum gewünschten Endvolumen auf und filtern Sie die Lösung, um eine mikrobielle Kontamination zu vermeiden.
   HINWEIS: Das EDTA-Pulver löst sich erst dann vollständig auf, wenn die Suspension einen neutralen pH-Wert erreicht hat.
2. Zur Entkalkung die Cochleae auf 80 ml 0,5 M EDTA in PBS übertragen. Inkubieren Sie das Gewebe in der Kälte (4-8 °C) unter sanfter Bewegung auf dem 2D-Shaker (100 U / min) für 2 Tage.
   HINWEIS: Nach dem Entkalkungsschritt kann das Gewebe mehrere Tage bis zu 3 Wochen in PBS gelagert werden, bevor mit den verbleibenden Verarbeitungsschritten fortgefahren wird. Für Antikörper, die die Stria vascularis markieren, ist es ratsam, die Cochleae an dieser Stelle (d.h. vor der Immunfärbung) entlang der Modiolarachse in zwei Hälften zu schneiden, um einen einheitlichen Zugang der Antikörper zu ihren jeweiligen Zielen zu gewährleisten. Dies ist antikörperabhängig und gilt nicht für die Antikörper, die hier zur Markierung synaptischer Strukturen und IHCs verwendet werden. Verwenden Sie für das Schneiden ein Stück zerbrechliche Rasierklinge und einen Klingenhalter (wie in Schritt 4.2 beschrieben).
3. Führen Sie die folgenden Schritte (bis Schritt 3.2) in 2-ml-Reaktionsröhrchen mit sicherer Abdichtung durch. Wenn das Gewebestück zu groß ist, um in den Schlauch zu passen, schneiden Sie das überschüssige Gewebe mit einer Schere ab. Um die Penetration der Antikörper zu verbessern, permeabilisieren Sie zunächst das Gewebe in 1 ml von 1% Triton (Triton X-100) in PBS auf dem 2D-Shaker (100 U / min) bei Raumtemperatur für 1 h. Waschen Sie das Gewebe 3x mit 1 ml 0,2% Triton (Triton X-100) in PBS auf dem 2D-Shaker (100 U / min) bei Raumtemperatur für jeweils 5 Minuten.
4. Um unspezifische Antigene zu blockieren, inkubieren Sie die Cochleae in 1 ml blockierender Lösung (3% Rinderserumalbumin [BSA], 0,2% Triton, in PBS) auf dem 2D-Shaker (100 U / min) bei Raumtemperatur für 1 h.
   HINWEIS: Die Blockierungslösung kann im Voraus vorbereitet werden, sollte aber nicht älter als ~ 10 Tage sein.
5. Verdünnen Sie die folgenden primären Antikörper frisch im selben Aliquot der blockierenden Lösung: Anti-MyoVIIa (Myosin VIIa) zur Kennzeichnung von IHCs (IgG polyklonales Kaninchen), verdünnt 1:400; Anti-CtBP2 (C-terminales bindendes Protein 2) zur Markierung präsynaptischer Bänder (monoklonale IgG1-Maus), verdünnt 1:400; und Anti-GluA2 zur Kennzeichnung postsynaptischer Rezeptorpflaster (monoklonale IgG2a-Maus), verdünnt 1:200. Stellen Sie sicher, dass die Cochleae vollständig mit der Antikörperlösung (typischerweise 0,4 ml) bedeckt sind, und inkubieren Sie sie bei 37 °C für 24 h.
6. Als nächstes waschen Sie das Gewebe 5x mit 0,2% Triton in PBS auf dem 2D-Shaker (100 U / min) bei Raumtemperatur für jeweils 5 Minuten. Wählen Sie sekundäre Antikörper, die zu den Wirtsspezies ihrer primären Gegenstücke passen, und verdünnen Sie sie erneut frisch in 3% BSA, 0,2% Triton, in PBS: Ziegen-Anti-Maus (IgG1)-Alexa-Fluorophor (AF) 488, verdünnt 1:1.000; Ziegen-Anti-Maus (IgG2a)-AF568, verdünnt 1:500; und Esel-Anti-Kaninchen-AF647 (IgG), verdünnt 1:1.000. Wickeln Sie die Tube in Aluminiumfolie, um ein Ausbleichen der Fluoreszenz zu verhindern. Inkubieren Sie die Cochleae in 0,4 ml sekundärer Antikörperlösung bei 37 °C für 24 h.
   HINWEIS: Begrenzte Studien haben gezeigt, dass die Inkubation von Cochlea-Gewebe bei 37 °C für 24 h mit primären und sekundären Antikörpern zu einer helleren Immunfärbung führte als nach dem häufigeren Inkubationsverfahren mit niedrigeren Temperaturen und kürzerer Dauer.
7. Waschen Sie die Cochleae 2x mit 1 ml 0,2% Triton in PBS für jeweils 5 min und 3x mit PBS für jeweils 5 min auf dem 2D-Shaker (100 U / min) bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Nach diesen Waschschritten können die Cochleae mehrere Tage in PBS im Kühlschrank bei ~4 °C verbleiben.

3. Behandlung mit Autofluoreszenzabfrage (optional)

HINWEIS: Cochleae von Rennmäusen mittleren Alters und im Alter zeigen eine umfangreiche Hintergrundautofluoreszenz. Im Gewebe junger Erwachsener ist eine Behandlung mit einem Autofluoreszenz-Quencher nicht notwendig. Grundsätzlich ist es möglich, den Autofluoreszenz-Quencher vor dem Immunfärbungsverfahren anzuwenden, wodurch dann eine unbeabsichtigte Reduktion der gewünschten Antikörperfluoreszenz vermieden wird. Laut dem Datenblatt des Herstellers ist die Verwendung von Reinigungsmitteln (wie Triton X-100 im aktuellen Protokoll) jedoch nicht mehr möglich, da sie den Querncher aus dem Gewebe entfernen.

1. Die Cochleae werden unter einem Stereomikroskop halbiert, wie in Schritt 4.2 beschrieben.
2. Mischen Sie den Autofluoreszenzabscheider mit 70% Ethanol, um eine 5% ige Lösung zu erhalten, und inkubieren Sie die Cochleae in dieser Lösung auf dem 2D-Shaker bei Raumtemperatur für 1 min. Waschen Sie die Cochleae 3x mit 1 ml PBS auf dem 2D-Shaker bei Raumtemperatur für jeweils 5 min.
   ACHTUNG: Der Autofluoreszenz-Quencher ist gefährlich und schädlich. Tragen Sie Handschuhe, wenn Sie mit dieser Substanz umgehen.

4. Endgültige Feindissektion

1. Sezieren Sie die Cochlea unter einem Stereomikroskop. Füllen Sie eine Polystyrol-Petrischale und ihren Deckel mit PBS und halten Sie zwei feine Pinzetten, eine Vannas-Federschere, einen Klingenhalter und eine zerbrechliche Rasierklinge bereit. Brechen Sie Stücke von der Rasierklinge, um je nach Sezierschritt eine Schnittfläche von ~2-4 mm zu erhalten. Bereiten Sie einen Objektträger vor, indem Sie drei Tropfen Montagemedium hintereinander legen.
   HINWEIS: Die Schnittfläche der Rasierklinge nutzt sich schnell ab. Die Klinge muss nach dem Sezieren und Montieren von etwa jedem zweiten Stück der Cochlea ausgetauscht werden.
2. Wenn dies nicht bereits in Schritt 3.1 geschehen ist, schneiden Sie zuerst die Cochlea entlang des Modiolus unter einem Stereomikroskop in zwei Hälften. Positionieren Sie dazu ein Stück einer Rasierklinge, das länger als die gewickelte Länge der Cochlea ist, in einen Klingenhalter. Legen Sie die Cochlea in die Petrischale und schneiden Sie überschüssiges Gewebe mit dem Stück Rasierklinge weg. Halten Sie die Cochlea mit einer feinen Pinzette an Ort und Stelle und schneiden Sie sie entlang des Modiolus in zwei Hälften.
3. Beginnen Sie mit einer Hälfte, lassen Sie aber auch die andere Hälfte in der Petrischale. Fixieren Sie die Cochlea-Hälfte vorsichtig mit einer Pinzette, so dass die Schneide nach oben zeigt. Verwenden Sie eine feine Federschere, um den Knochen der Cochlea oberhalb des Helicozements abzuschneiden und die Spitze zu bedecken.
4. Um die Trennung der Cochlea-Stücke zu beginnen, isolieren Sie die mittlere Drehung, indem Sie mit einer Schere durch den Modiolus und den Hörnerv schneiden, oben (scala vestibuli) und unten (scala tympani).
5. Schneiden Sie durch den Cochlea-Knochen, der die Stria vascularis im Cochlea-Gang bedeckt. Machen Sie zwei Schnitte auf beiden Seiten des Cochlea-Knochens über dem Corti-Organ und entlang der Stria vascularis und verwenden Sie die Rasierklinge, um schließlich die Cochlea-Stücke zu trennen.
   HINWEIS: Die Stria vascularis ist als dunkler Streifen gut sichtbar. Das Schneiden entlang der Stria vascularis lässt das Corti-Organ intakt.
6. Optional: Um die Stria vascularis zu sammeln, schneiden Sie vorsichtig zwischen das Organ von Corti und die Stria vascularis, um die beiden zu trennen. Lassen Sie die Stria vascularis mit dem Spiralband verbunden (das an dem Knochen befestigt ist, der die äußere Oberfläche der Cochlea bedeckt) und entfernen Sie den entkalkten Knochen mit einer Pinzette. Legen Sie das Stück mit der Stria-Seite nach oben auf den Objektträger in einem Tropfen Montagemedium.
   HINWEIS: Wenn das gesammelte Stück zu stark gekrümmt ist, kann es notwendig sein, es in kleinere Stücke zu teilen, damit es flach genug für die Montage auf dem Schlitten ist.
7. Die Cochlea-Stücke auf den PBS-gefüllten Deckel der Polystyrol-Petrischale geben, um sicherzustellen, dass die Cochlea-Ganzkörperhalterungen so flach wie möglich auf dem Schlitten liegen. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe, wie Teile des Spiralbandes auf der abneuralen Seite und Teile des spiralförmigen Limbus auf der neuronalen Seite. Entfernen Sie die tektoriale Membran vorsichtig mit einer superfeinen Pinzette.
8. Legen Sie die Cochlea-Stücke auf den Schlitten in einen Tropfen Montagemedium. Platzieren Sie die Cochlea-Ganzkörperhalterungen mit dem Corti-Organ nach oben auf dem Objektträger, um zu vermeiden, dass die IHCs im optischen Pfad für die Bildgebung verdeckt werden. Suchen Sie nach einer Invagination des spiralförmigen Limbus in unmittelbarer Nähe der IHCs, die sichtbar ist, indem Sie das Cochlea-Stück in die Sagittalebene verschieben, um die nach oben gerichtete Seite zu identifizieren.
   HINWEIS: Um die komplette Cochlea aus ihren Einzelstücken während der Weiterverarbeitung digital zu rekonstruieren, empfiehlt es sich dringend, Skizzen der Stücke zu dokumentieren und Landmarken zu notieren. Des Weiteren sollten die Stücke idealerweise in der richtigen Reihenfolge auf dem Dia angeordnet werden.
9. Wiederholen Sie die Schritte 4.3 bis 4.8, bis die gesamte Cochlea auf den Objektträger übertragen wurde. Fügen Sie bei Bedarf mehr Montagemedium hinzu, bedecken Sie den Schlitten und versiegeln Sie den Decklack mit schwarzem Nagellack, der an den Rändern lackiert ist. Lassen Sie es im Dunkeln bei Raumtemperatur trocknen und lagern Sie das Dia dann im Dunkeln bei 4 °C.
   HINWEIS: Selbst wenn Teile des sensorischen Epithels selbst versehentlich verloren gehen, ist es wichtig, dennoch das zu montieren, was vom Cochlea-Stück übrig ist, um eine korrekte Längenschätzung zu erhalten.

5. Cochlea-Längenmessung

1. Messen Sie die Länge der Cochlea anhand von Hellfeldbildern ihrer Stücke mit einem Epifluoreszenzmikroskopsystem und der zugehörigen Software. Speichern Sie Bilder mit geringer Vergrößerung (4-faches Objektiv) von jedem Cochlea-Stück und verwenden Sie das Lasso-Messwerkzeug der Mikroskopsoftware, um in jedem der Bilder eine Linie entlang der Reihe von IHCs zu zeichnen. Berechnen Sie die Gesamtlänge, indem Sie die Längen aller Teile addieren.
   HINWEIS: Wenn Teile des sensorischen Epithels in einem Cochlea-Stück fehlen, interpolieren Sie die Linie.
2. Um die Cochlea-Positionen zu definieren, die in einer einzelnen Cochlea analysiert werden sollen, berechnen Sie ihre entsprechenden Abstände vom Scheitelpunkt mit der Gleichung von Müller²⁵. Markieren Sie diese Stellen zum Beispiel auf einem Ausdruck der Cochlea-Stücke.

6. Bildaufnahme mit einem konfokalen Mikroskop

1. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop mit einem 40-fachen Öl-Immersionsobjektiv (numerische Apertur 1,3) und dem entsprechenden Öl für hochauflösende Bildgebung.
   HINWEIS: Wenn das konfokale Mikroskop einen invertierten Lichtweg hat, muss der Objektträger verkehrt herum positioniert werden. Geben Sie der Probe in diesem Fall etwa 30 Minuten Zeit, um zu sinken und stabil auf dem Deckglas zu ruhen, bevor Sie mit dem endgültigen Scan beginnen. Alternativ können Sie ein Montagemedium verwenden, das während der gesamten Dauer der Dissektion flüssig ist, aber später erstarrt und gleichzeitig die Fluoreszenz konserviert.
2. Aktivieren Sie die entsprechenden Laser: In diesem Protokoll werden zwei optisch gepumpte Halbleiterlaser mit Wellenlängen von λ = 488 nm und λ = 522 nm sowie ein Diodenlaser mit einer Wellenlänge von λ = 638 nm verwendet. Wählen Sie den Emissionsbereich der Fluoreszenz-Tags (AF488: 499-542 nm, AF568: 582-621 nm, AF647: 666-776 nm). Wenn ein Hybriddetektor die freigesetzten Photonen zählt, platzieren Sie die Laserlinie mindestens 10 nm von der Emissionskurve entfernt.
   HINWEIS: Es ist wichtig, Vorabprüfungen mit einfach markiertem Gewebe durchzuführen, um sicherzustellen, dass die gewählten Detektorbandbreiten die Farbkanäle sauber trennen (d.h. nicht zu Kanalübersprechen führen). Radiowellen stören den Hybriddetektor, was zu einer maximalen Photonenzahl führt und somit artefaktische Streifen im Stapel verursacht. Vermeiden Sie daher die Verwendung eines Mobiltelefons in der Nähe des Mikroskops.
3. Zoomen Sie auf das Gewebe, bis das Bild 10 IHCs umfasst. Wählen Sie die Auflösung des Bildes nach Nyquist-Probe, die typischerweise ~ 40-60 nm / Pixel beträgt. Stellen Sie die Schrittweite in Z-Richtung auf 0,3 μm und die Abbildungsgeschwindigkeit auf 400-700 Hz ein.
   HINWEIS: Beide Einstellungen (Schrittweite und Bildgebungsgeschwindigkeit) stellen Kompromisse zwischen der Verwendung optimaler Bildgebungsparameter und der Einsparung von Scanzeit dar.
4. Führen Sie bidirektionale Probenahmen durch, um die Bildgebungszeit zu verkürzen. Kumulieren Sie den Rahmen für den 488-nm- und 638-nm-Kanal 3x und für den 522-nm-Kanal 6x; Zusätzlich können Sie die Linien für jeden Kanal 3x mitteln. Wählen Sie den Anfang und das Ende des Stapels in der z-Dimension.
5. Stellen Sie die Verstärkung auf 100 ein, wenn Sie den Hybriddetektor (Zählmodus) verwenden, um ein verringertes Signal-Rausch-Verhältnis zu vermeiden. Stellen Sie die Laserleistung so ein, dass kein Pixel im interessierenden Bereich gesättigt ist, aber die Strukturen decken meist den gesamten 8-Bit-Bereich ab. Beginnen Sie mit einer geringen Laserleistung von 0,5% und erhöhen Sie sie, bis Strukturen sichtbar sind.
   HINWEIS: Eine gute Färbung benötigt in der Regel eine Laserleistung zwischen 0,1% und 5%.
6. Verwenden Sie Dekonvolutionssoftware für die Post-hoc-Verarbeitung der Bildstapel, um den unscharfen Halo um kleine fluoreszierende Strukturen mit einer theoretischen Punktspreizungsfunktion zu entfernen. Verwenden Sie für jeden Stack innerhalb eines Experiments dieselben Einstellungen. Speichern Sie die entflechteten Bilder als .tif oder .ics.
   HINWEIS: Das myoVIIa-Label (IHCs) profitiert nicht von der Dekonvolution und kann weggelassen werden, um Zeit zu sparen. Die Software verwendet Metadaten der Bilddateien; Es müssen jedoch mehrere Parameter wie der Lichtweg, das Einbettungsmedium oder das Tauchmedium angegeben werden.

7. Synapsenquantifizierung

1. Öffnen Sie eine Kopie der dekonvolutierten Stacks in der frei zugänglichen Software ImageJ mit dem zusätzlichen Biovoxxel-Plugin, das auch auf ihrer Website verfügbar ist.
2. Passen Sie die Farben einzelner Kanäle an, indem Sie die Kanäle aufteilen (Bild | Farbe | Geteilte Kanäle) und Zusammenführen (Image | Farbe | Merge Channels) sie erneut und weisen verschiedene Farben zu. Konvertieren Sie das Bild in einen RGB-Stack (Bild | Farbe | Auf RGB stapeln) und Helligkeit und Kontrast anpassen (Bild | | anpassen Helligkeit/Kontrast | B. Auto oder Slider bezüglich des Maximums), falls erforderlich, so dass sich die prä- und postsynaptischen Strukturen und das IHC-Label angenehm vom Hintergrund unterscheiden.
3. Wählen Sie fünf IHCs aus und beschriften Sie diese mit dem Textwerkzeug (IHC1-IHC5), indem Sie auf die gewünschte Stelle innerhalb des Stapels klicken. Öffnen Sie den ROI-Manager (| analysieren Tools | ROI-Manager); Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Labels , um die Punkte mit einer Nummer zu kennzeichnen. Zoomen Sie auf die IHC von Interesse.
4. Verwenden Sie das Punkt-/Mehrpunktwerkzeug im Mehrpunktmodus (klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Werkzeug, um zwischen Punkt- oder Mehrpunktmodus zu wählen). Klicken Sie auf eine funktionelle Ribbon-Synapse (d. h. ein präsynaptisches Ribbon in enger Gegenüberstellung zu einem postsynaptischen Glutamat-Patch), während Sie durch die Z-Dimension scrollen.
   HINWEIS: Abhängig von ihrer Überlappung und der für jeden Kanal gewählten Farbe werden die gemeinsam genutzten Pixel in gemischten Farben angezeigt. Normalerweise ist die Unterscheidung zwischen einzelnen funktionellen Synapsen einfach, weil sie ausreichend voneinander entfernt sind.
5. Wenn alle interessanten Strukturen angekreuzt sind, klicken Sie auf der grafischen Benutzeroberfläche des ROI-Managers auf Hinzufügen . Klicken Sie auf den beliebigen Namen und wählen Sie Umbenennen.
   HINWEIS: Die Punktbeschriftungen bleiben weiterhin in allen Ebenen des Stapels erhalten, wenn das Kontrollkästchen Alle anzeigen im Optionsmenü des Punktwerkzeugs aktiviert ist (doppelklicken Sie auf das Symbol des Punktwerkzeugs), wodurch vermieden wird, dass dieselbe Multifunktionsleisten-Synapse mehrmals gezählt wird.
6. Wenn Sie den nächsten IHC für die Zählung auswählen, vermeiden Sie versehentliches Hinzufügen von Zählungen, indem Sie das Bild so anpassen, dass der nächste IHC mit dem Handwerkzeug vollständig angezeigt wird. Wechseln Sie von Multipoint-Tool zu Punkt-Tool , um zu vermeiden, dass den zuvor gespeicherten Daten mehr Puncta hinzugefügt wird. Klicken Sie im nächsten IHC auf eine interessante Struktur und wechseln Sie zurück zum Multipoint-Tool. Wiederholen Sie die Schritte 7.4 bis 7.5, bis alle IHCs von Interesse bewertet sind.
7. Um Daten zu speichern, klicken Sie im ROI-Manager auf ein Dataset und dann auf Measure. Warten Sie, bis ein neues Fenster mit den gemessenen Datenpunkten angezeigt wird. Speichern Sie diese Liste als Tabellenkalkulationsdatei (Datei | Speichern unter). Speichern Sie das Bild, indem Sie im ROI-Manager die Option Alle anzeigen aktivieren. Klicken Sie auf Flatten , um die Punktbeschriftungen dauerhaft zum Stapel hinzuzufügen. Stimmen Sie beim Schließen des Image-Stacks zu, die Änderungen zu speichern.

8. Analyse des Synapsenvolumens und der Position auf der Haarzelle

HINWEIS: Die Autoren verwendeten ein benutzerdefiniertes Programm, das auf Matlab basiert. Da es nicht öffentlich zugänglich ist, wird es hier nur in groben Zügen dargestellt (siehe auch⁷). Bitte wenden Sie sich an den entsprechenden Autor, wenn Sie daran interessiert sind, es zu verwenden. Das Verfahren erwartet einen dreifach beschrifteten (IHCs, prä- und postsynaptischen) Bildstapel im TIFF-Format als Eingabe, führt den Anwender über eine grafische Oberfläche durch die verschiedenen Analyseschritte und liefert eine umfangreiche Ausgabe der Ergebnisse im Tabellenkalkulationsformat.

1. Normalisieren Sie die Position der synaptischen Strukturen auf ein 3D-Koordinatensystem, das durch die Ausdehnung des einzelnen IHC auf der Säulen-Modiolar-Achse und der Cochlea-apikal-basalen Achse und der IHC-Achse von oben (kutikuläre Platte) nach unten (synaptischer Pol) definiert wird.
   HINWEIS: Die Volumina der synaptischen Elemente (sowohl prä- als auch postsynaptisch und das kombinierte Volumen der funktionellen Synapsen) werden in μm 3 angegeben und auf den jeweiligen Medianwert³ normiert.

Ergebnisse

Cochleae wurden entweder nach kardiovaskulärer Durchblutung mit Fixierung des gesamten Tieres geerntet oder nach dem Einschläfern des Tieres schnell seziert und in die Immersion fixiert. Bei der letzteren Methode blieben die IHCs während der Dissektion an Ort und Stelle, während bei erfolgloser Perfusion und damit unzureichend fixiertem Gewebe das sensorische Epithel häufig zerstört wurde. Beachten Sie, dass die Autoren auf Fälle stießen, in denen die Fixierung der Cochleae nach transkardialer Perfusion unzureich...

Diskussion

Mit der in diesem Protokoll beschriebenen Methode ist es möglich, IHCs und synaptische Strukturen in Cochleae von jungen erwachsenen und gealterten Rennmäusen zu immunisieren, vermutete funktionelle Synapsen durch Kolokalisierung prä- und postsynaptischer Elemente zu identifizieren, sie einzelnen IHCs zuzuordnen und ihre Anzahl, ihr Volumen und ihre Position zu quantifizieren. Die bei diesem Ansatz verwendeten Antikörper markierten auch äußere Haarzellen (OHCs; myoVIIa) und ihre präsynaptischen Bänder. Darüber ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin Fraction V biotin-free	Carl Roth	0163.2
anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse)	BD Biosciences, Eysins	612044
anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse)	Millipore	MAB39
anti-mouse (IgG1)-AF 488	Molecular Probes Inc.	A21121
anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit)	Proteus Biosciences	25e6790
Blade Holder & Breaker - Flat Jaws	Fine Science Tools	10052-11
Bonn Artery Scissors - Ball Tip	Fine Science Tools	14086-09
Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm	Carl Roth	LH26.1
Disposable Surgical Blade	Henry Schein	0473
donkey anti-rabbit (IgG)-AF647	Life Technologies-Molecular Probes	A-31573
Dumont #5 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Ethanol, absolute 99.8%	Fisher Scientific	12468750
Ethylenediaminetetraacetic acid	Carl Roth	8040.2
Excel	Microsoft Corporation
Feather Double Edge Blade	PLANO	112-9
G19 Cannula	Henry Schein	9003633
goat anti-mouse (IgG2a)-AF568	Invitrogen	A-21134
Heparin	Ratiopharm	N68542.04
Huygens Essentials	Scientific Volume Imaging
ImageJ	Fiji
Immersol, Immersion oil 518F	Carl Zeiss	10539438
Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung)	Braun	4062957E
ISM596D	Ismatec		peristaltic pump
KL 1600 LED	Schott	150.600	light source for stereomicroscope
Leica Application suite X	Leica Microsystem CMS GmbH
Leica TCS SP8 system	Leica Microsystem CMS GmbH
Matlab	The Mathworks Inc.
Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut	Fine Science Tools	14512-17
Mini-100 Orbital-Genie	Scientific Industries	SI-M100	for use in cold environment
Narcoren (pentobarbital)	Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Nikon Eclipse Ni-Ei	Nikon
NIS Elements	Nikon Europe B.V.
Paraformaldehyde	Carl Roth	0335.3
Petri dish without vents	Avantor VWR	390-1375
Phosphate-buffered saline:
Disodium phosphate	AppliChem	A1046
Monopotassium phosphate	Carl Roth	3904.1
Potassium chloride	Carl Roth	6781.1
Sodium chloride	Sigma Aldrich	31434-M
Screw Cap Containers	Sarstedt	75.562.300
Sodium azide	Carl Roth	K305.1
Student Adson Forceps	Fine Science Tools	91106-12
Student Halsted-Mosquito Hemostat	Fine Science Tools	91308-12
Superfrost Adhesion Microscope Slides	Epredia	J1800AMNZ
Triton  X	Carl Roth	3051.2
TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher	Biotium	23007
Vannas Spring Scissors, 3mm	Fine Science Tools	15000-00
Vectashield Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
Vibrax VXR basic	IKA	0002819000
VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic	IKA	953300
Wild TYP 355110 (Stereomicroscope)	Wild Heerbrugg		not available anymore