סינפסות סרט אימונו-לבלים וספירתם בשבלול גרביל הצעיר והזקן

Summary

מוצג פרוטוקול לעיבוד שבלול גרביל צעיר ומזדקן על ידי סימון חיסוני של המבנים הסינפטיים ותאי השערה האפרנטיים, מרווה אוטופלואורסצנטיות ברקמה מזדקנת, ניתוח והערכת אורך השבלול, וכימות הסינפסות בערימות תמונה המתקבלות בהדמיה קונפוקלית.

Abstract

ההנחה היא שאובדן הסינפסות של הסרט המחברות בין תאי שערה פנימיים לסיבי עצב שמיעתיים עזים הוא אחד הגורמים לאובדן שמיעה הקשור לגיל. השיטה הנפוצה ביותר לזיהוי אובדן של סינפסות סרט היא סימון חיסוני מכיוון שהיא מאפשרת דגימה כמותית מכמה מקומות טונוטופיים בשבב בודד. עם זאת, המבנים המעניינים קבורים עמוק בתוך השבלול הגרמי. גרבילים משמשים כמודל לבעלי חיים לליקוי שמיעה הקשור לגיל. כאן מתוארים פרוטוקולים שגרתיים לקיבוע, אימונו-לבלים של שבלול גרביל, הדמיה קונפוקלית וכימות מספרים ונפחים של סינפסות של סרט. יתר על כן, האתגרים המסוימים הקשורים להשגת חומר טוב מאנשים מזדקנים בעלי ערך מודגשים.

גרבילים מורדמים מורדמים ומופרעים קרדיווסקולרית, או שהבולות הטימפניות שלהם מנותחות בקפידה מתוך הגולגולת. השבלול נפתחים בקצה ובבסיס ומועברים ישירות לקיבוע. ללא קשר לשיטה הראשונית, השבלולים הם postfixed ולאחר מכן decalcified. לאחר מכן, הרקמה מסומנת בנוגדנים ראשוניים נגד מבנים ותאי שיער טרום-סינפטיים ופוסט-סינפטיים. לאחר מכן, השבלולים מודגרים עם נוגדנים משניים המתויגים פלואורסצנטית שהם ספציפיים כנגד אלה העיקריים שלהם. השבלול של גרבילים מזדקנים מטופלים לאחר מכן באמצעות קוונצ'ר אוטופלואורסצנטי כדי להפחית את הפלואורסצנציה המשמעותית בדרך כלל ברקע של רקמות של בעלי חיים מבוגרים.

לבסוף, שבלול מנותחים לתוך 6-11 קטעים. כל אורך השבלול משוחזר כך שניתן לקבוע באופן מהימן מיקומים ספציפיים של שבלול בין פרטים. ערימות תמונות קונפוקליות, שנרכשו ברצף, מסייעות לדמיין תאי שיער וסינפסות במיקומים שנבחרו. ערימות הקונפוקלים מתפרקות, והסינפסות נספרות באופן ידני באמצעות ImageJ, או שכימות נרחב יותר של מבנים סינפטיים מתבצע עם הליכי ניתוח תמונה שנכתבו בהתאמה אישית ב- Matlab.

Introduction

ליקוי שמיעה הקשור לגיל הוא אחת המחלות הנפוצות ביותר בעולם המשפיעה על יותר משליש מאוכלוסיית העולם בגילאי 65 ומעלה¹. הסיבות הבסיסיות עדיין נמצאות בוויכוח ונחקרות באופן פעיל, אך עשויות לכלול את אובדן הסינפסות המיוחדות המחברות תאי שערה פנימיים (IHCs) עם סיבי עצב שמיעתיים². סינפסות סרט אלה מורכבות ממבנה קדם-סינפטי שיש בו שלפוחיות מלאות במוליך העצבי גלוטמט הקשור אליו, כמו גם קולטני גלוטמט α-אמינו-3-הידרוקסי-5-מתיל-4-איזוקסזולפרופיונית (AMPA) קולטני גלוטמט ^3,4,5. בגרביל, כ-20 סיבי עצב שמיעתיים אפרנטיים יוצרים קשר עם IHC אחד ^6,7,8. הסיבים ב-IHC הפונים אל המודיולוס מנוגדים לסרטים סינפטיים גדולים, בעוד שהסיבים המתחברים בצד העמוד של ה-IHC מפנים סרטים סינפטיים קטנים (כלומר, בחתולים⁹, גרבילים⁷, שרקנים¹⁰ ועכברים ^{3,11,12,13,14}). יתר על כן, בגרביל, גודלם של הסרטים הקדם-סינפטיים וכתמי הגלוטמט הפוסט-סינפטיים מתואמים באופן חיובי ^7,14. סיבים המתנגדים לסרטים גדולים בצד המודילרי של ה-IHC הם קטנים בקליבר ובעלי קצבים ספונטניים נמוכים וסף גבוה¹⁵. ישנן עדויות לכך שסיבים בעלי קצב ספונטני נמוך פגיעים יותר לחשיפה לרעש¹⁰ ולתרופות אוטוטוקסיות¹⁶ מאשר לסיבים בעלי סף נמוך ספונטני גבוה, הממוקמים בצד העמוד של מעגלים משולבים¹⁵.

אובדן הסינפסות של הסרט הוא האירוע הניווני המוקדם ביותר בליקוי שמיעה הקשור לגיל העצבי של השבלול, בעוד שאובדן תאי הגנגליון הספירליים וסיבי עצב השמיעה שלהם מפגרים אחרי^17,18. קורלציות אלקטרופיזיולוגיות כוללות הקלטות של תגובות גזע המוח השמיעתי¹⁷ ופוטנציאלי פעולה מורכבים⁸; עם זאת, אלה אינם משקפים את הדקויות של אובדן סינפסה, שכן סיבי קצב ספונטני נמוך אינם תורמים לאמצעים אלה¹⁶. מדדים אלקטרופיזיולוגיים מבטיחים יותר הם האינדקס העצבי הנגזר מפוטנציאל המסה¹⁹ ותגובת הזמן של הפריסטימולוס²⁰. עם זאת, אלה אמינים רק אם לבעל החיים אין פתולוגיות שבלול אחרות, מעבר לאובדן סיבי עצב שמיעתיים, המשפיעות על פעילותם של סיבי העצב השמיעתיים הנותרים⁸. יתר על כן, ערכי סף שהוערכו התנהגותית בגרביל לא היו מתואמים עם מספרי סינפסה²¹. לכן, כימות אמין של סינפסות הסרט ששרדו, ולכן, מספר סיבי העצב השמיעתיים התפקודיים אפשרי רק על ידי בדיקה ישירה של רקמת השבלול.

הגרביל המונגולי (Meriones unguiculatus) הוא מודל חייתי מתאים לחקר ליקוי שמיעה הקשור לגיל. יש לו תוחלת חיים קצרה, יש לו שמיעה בתדירות נמוכה הדומה לבני אדם, הוא קל לתחזוקה, ומראה קווי דמיון לפתולוגיות אנושיות הקשורות לליקוי שמיעה הקשור לגיל 2,22,23,24. גרבילים נחשבים לגיל מבוגר כאשר הם מגיעים לגיל 36 חודשים, שהוא לקראת סוף אורך החיים הממוצע שלהם²². חשוב לציין, אובדן תלוי גיל של סינפסות סרט הודגם בגרבילים שגדלו והתיישנו בסביבות שקטות ^8,21.

כאן מוצג פרוטוקול לתבל, לנתח ולנתח שבלול מהגרבילים בגילאים שונים, ממבוגרים צעירים ועד זקנים. נוגדנים המכוונים נגד רכיבים של presynapse (CtBP2), מדבקות קולטן גלוטמט פוסט-סינפטי (GluA2) ו- IHCs (myoVIIa) משמשים. מופעל קוונצ'ר אוטופלואורסצנטי המפחית את הרקע בשבבייה מזדקנת ומשאיר את האות הפלואורסצנטי ללא פגע. יתר על כן, ניתן תיאור של כיצד לנתח את השבלול כדי לבחון הן את האפיתל החושי והן את stria vascularis. אורך השבלול נמדד כדי לאפשר בחירה של מיקומי שבלול מובחנים המתאימים לתדרים הטובים ביותר הספציפיים²⁵. כימות של מספרי סינפסה מתבצע עם התוכנה הזמינה באופן חופשי ImageJ²⁶. כימות נוסף של נפחי סינפסה ומיקומים בתוך HC הבודד מבוצע עם תוכנה מותאמת אישית שנכתבה ב- Matlab. תוכנה זו אינה זמינה לציבור, מכיוון שלמחברים חסרים המשאבים לספק תיעוד ותמיכה מקצועיים.

Protocol

כל הפרוטוקולים והנהלים אושרו על ידי הרשויות הרלוונטיות של סקסוניה התחתונה, גרמניה, עם מספרי היתר AZ 33.19-42502-04-15/1828 ו- 33.19-42502-04-15/1990. פרוטוקול זה הוא עבור גרבילים מונגולים (M. unguiculatus) משני המינים. מבוגר צעיר מתייחס לגיל של 3-12 חודשים, בעוד גרבילים נחשבים בגיל 36 חודשים ומעלה. כאשר לא צוין אחרת, ניתן להכין מאגרים ופתרונות ולאחסן במקרר עד מספר חודשים (4-8 מעלות צלזיוס). לפני השימוש, ודא שהמאגרים והפתרונות לא זירזו.

1. קיבוע ואיסוף איברים

הערה: אם יש צורך רק בשבב, מומלץ לבצע את ההליך הפשוט יותר של קיבוע על ידי טבילה. עם זאת, אם יש צורך גם במוח שהשתמר היטב, אז זלוף טרנסקרדיאלי הוא האפשרות היחידה. המקבע בשני המקרים הוא 4% פרפורמלדהיד (PFA) במי מלח עם מאגר פוספט (PBS). זה צריך להיות טרי, אבל ניתן לאחסן קפוא עד השימוש. השתמש באליקוטים של ~ 300 מ"ל עבור פרפוזיה טרנסקרדיאלית או ~ 50-100 מ"ל לכל שבלול לקיבוע על ידי טבילה.

אזהרה: PFA הוא חומר מסוכן; לטפל בו על פי נהלי בטיחות המעבדה הכלליים.

1. קיבוע על ידי פרפוזיה טרנסקרדיאלית
   1. יש לשטוף את מערך הזלוף עד שהצינורות נקיים מבועות אוויר. מלאו את צינורות הזלוף ב-PBS המכילים הפרין (0.2 מ"ל ב-100 מ"ל של PBS) כדי למנוע קרישת דם. עצרו את הזרימה ברגע שהצינורות מתמלאים ב-PBS ובקבוק אחסון הנוזלים התרוקן זה עתה; לשפוך 200 מ"ל של PFA מופשר לתוכו.
      הערה: ההתקנה מוכנה כעת עבור החיה. ה- PBS הנותר בצינורות מספיק כדי לשטוף את הדם, ובאופן אוטומטי ילווה בקיבוע ברגע שהזרימה תחודש.
   2. ודא שמערכת איסוף פסולת קיימת ליציאה של PFA. השתמשו בצינורית טרייה (19 גרם) והכילו מספריים גדולים, מלקחיים (עם קצה שטוח), המוסטאטים, אזמל או צינורית חדה, ומשטח גומי עם סיכות בהישג יד.
   3. המתת חסד את הגרביל עם מנת יתר תוך-צפקית של פנטוברביטל (160 מ"ג/מ"ל, 0.3 מ"ל לכל חיה, טווח משקל גוף: 50-120 גרם). החזירו את החיה לכלוב שלה. כאשר עצירה נשימתית מתרחשת כך שהנשימה הופכת ללא סדירה עם מרווחים של 30 שניות או יותר, מניחים את הגרביל על גבו על גבו על משטח הגומי ומקבעים את שתי כפות הרגליים הקדמיות ואת כף אחורית אחת עם סיכות (השאירו כף אחורית אחת פנויה לתנועה לשיפוט טוב יותר של הצלחת הזלוף; ראו הערה אחרי שלב 1.1.7).
   4. כדי לפתוח את חלל בית החזה, הרימו את העור מעל עצם החזה עם מלקחיים וחתכו את העור כ-0.5 ס"מ מתחת לעצם החזה עם מספריים עד שהתהליכה בצבע לבן xiphoideus נראית לעין. החזיקו את עצם החזה ב-processus xiphoideus עם מלקחיים וחתכו לאורך הסרעפת כדי לקבל מבט טוב לתוך חלל בית החזה. חותכים את הצלעות לרוחב משני הצדדים עד שיש גישה טובה ללב. ודא כי זווית המספריים היא מקבילה ושטוחה ביחס לגוף הגרביל כדי למנוע נזק לאיברים, ובכך להבטיח מערכת דם סגורה.
   5. מהדקים המוסטאט על עצם החזה, מרימים את הצלעות ומניחים את ההמוטט מעל כתף הגרביל מבלי להניח את ההמוטט על חלקי גוף כלשהם כדי למנוע חסימת זרימת הדם.
   6. פתח מעט את זרימת הנוזל עד שטיפה אחת של PBS זורמת מתוך הצינורית (19 G) בערך כל 2 שניות. להחזיק את הלב עם מלקחיים ולסובב אותו קצת שמאלה כך החדר השמאלי ניתן לראות בבירור. הכנס את הצינורית לחדר השמאלי בזווית שנמנעת מחדירה למחיצה. החזיקו את המחט במקומה ביד או עם המוסטאט אחר.
      הערה: ניתן להבדיל בין החדרים השמאליים והימניים על ידי גווני הצבעים השונים שלהם; החדר השמאלי נראה בהיר יותר בצבעו משאר רקמת הלב.
   7. לאט לאט להגביר את הלחץ של זרימת הנוזל ולפתוח את האטריום הימני או עם מספריים עדינים, אזמל, או צינורית אחרת. פתחו את זרימת הנוזלים עוד יותר עד שנצפו כ-2-3 טיפות/שנייה בתא הטפטוף, או קבעו זרימה של 4 מ"ל/דקה עבור המשאבה. ברגע שהקיבעון של הלב נכנס פנימה, ודא כי צינורית הזלוף נשארת במקומה מבלי להיות מוחזקת עוד.
      הערה: סימנים של זלוף מוצלח הם התכווצויות שרירים איטיות, התקשות של הצוואר והגפיים, הכבד הולך חיוור, וריאות ורודות. הסימן של זלוף לא מוצלח הוא הלבנה של הריאות, אשר מציין כי זרימת הדם הריאתית הוא perfused עקב ניקוב של המחיצה.
   8. במקרה של זלוף לא מוצלח, נסו להזיז את הצינורית למעלה למעלה, לתוך אבי העורקים, ומהדקים אותה במקומה עם המוסטאט.
   9. עריפת הגרביל. מוציאים את הבולה וחותכים ומפרקים את העצם כפי שמתואר בשלב 1.2.2.
      הערה: אם הרקמה אינה קבועה מספיק, האפיתל החושי יתנתק מהאיבר של קורטי במהלך הנתיחה.
   10. אם הזלוף לא מראה סימנים של קיבוע תוך 5-10 דקות, בטל אותו ומיד בצע את ההליך שלהלן לקיבוע על ידי טבילה. לשם כך, התייחסו לשבבייה כמו בשלב 1.2.2 והניחו את הרקמה בכ-50-80 מ"ל של 4% PFA במיכלי מכסה בורג למשך 1-2 ימים על שייקר דו-ממדי ב-8 מעלות צלזיוס.
       הערה: מכיוון שזה יכול להיות קשה בסופו של דבר לדרג את איכות הקיבוע במהלך זלוף, מומלץ לפרסם באופן שגרתי את השבלול כמתואר.
2. קיבוע על ידי טבילת רקמות
   1. המתת חסד את הגרבילים עם מנת יתר תוך-צפקית של פנטוברביטל (160 מ"ג/מ"ל, 0.3 מ"ל לכל חיה, טווח משקל גוף: 50-120 גרם). כאשר הגרביל הפסיק לנשום, ערפו את החיה.
   2. מוציאים את הבולה וחותכים ומפרקים את עצם העצם שלה עם מספריים ומלקחיים, בהתאמה, כדי להגיע לשבבלול. הסר את התעלות המלוס, האינקוס והחצי-עגולות. צור חורים קטנים בנקודת השיא ובפנייה הבסיסית על ידי גירוד זהיר מעל עצם השבלול עם מלקחיים. מעבירים מיד את הבולה לעודף של קיבוע קר (לפחות 50 מ"ל) ומקבעים את הרקמה בקור (4-8 מעלות צלזיוס) תחת תסיסה עדינה (2D-shaker [100 סל"ד]) למשך יומיים.
      הערה: לאחר תיקון הרקמה, השבלול יכול להיות מעובד באופן מיידי או מאוחסן ב- PBS עם 0.05% נתרן אזיד. אזהרה: נתרן אזיד הוא רעיל. שימו לב שאורך האחסון עלול להשפיע לרעה על איכות הכתם. ניסויים מוגבלים הצביעו על כך שהחיסון נראה חלש יותר לאחר שנתיים של אחסון הרקמה בנתרן אזיד.

2. הכנת רקמות ותיוג חיסוני

1. ממיסים אבקת חומצה אתילנדיאמינט-אצטית (EDTA) ב-PBS כדי לייצר תמיסה של 0.5 M ב-pH 8. לשם כך, מניחים על מערבל מגנטי, ממלאים אותה בכמחצית מהכמות הכוללת של ה-PBS, ומוסיפים את הכמות המתאימה של אבקת EDTA, וכתוצאה מכך תרחיף חומצי. יש להוסיף בזהירות תמיסת נתרן הידרוקסיד מרוכזת (NaOH) תוך ניטור ה-pH באמצעות מד pH. מלאו ב-PBS לנפח הסופי הרצוי וסננו את התמיסה כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי.
   הערה: אבקת ה-EDTA תתמוסס לחלוטין רק לאחר שהמתלים יגיעו לערך pH נייטרלי.
2. עבור decalcification, להעביר את השבלול ל 80 מ"ל של 0.5 M EDTA ב PBS. הדגירה של הרקמה בקור (4-8 מעלות צלזיוס) תחת תסיסה עדינה על ה-2D-shaker (100 סל"ד) למשך יומיים.
   הערה: לאחר שלב ההפחתה, ניתן לאחסן את הרקמה ב- PBS למשך מספר ימים עד 3 שבועות לפני שתמשיך עם שלבי העיבוד הנותרים. עבור נוגדנים המסמנים את ה-stria vascularis, מומלץ לחתוך את השבלול לשניים לאורך ציר ה-modiolar בנקודה זו (כלומר, לפני החיסון) כדי להבטיח גישה אחידה של נוגדנים למטרותיהם בהתאמה. זה תלוי בנוגדנים ואינו חל על הנוגדנים המשמשים כאן לסימון מבנים סינפטיים ו- IHCs. השתמש בפיסת סכין גילוח ניתנת לשבירה ובמחזיק להב (כמתואר בשלב 4.2) לחיתוך.
3. בצע את השלבים הבאים (עד שלב 3.2) בצינורות תגובת איטום בטוח של 2 מ"ל. אם חתיכת הרקמה גדולה מכדי להתאים לתוך הצינור, יש לקצץ את הרקמה העודפת במספריים. כדי לשפר את חדירת הנוגדנים, תחילה חלחלו לרקמה ב-1 מ"ל של 1% טריטון (Triton X-100) ב-PBS על ה-2D-shaker (100 סל"ד) בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. שטפו את הרקמה פי 3 עם 1 מ"ל של 0.2% טריטון (טריטון X-100) ב-PBS על ה-2D-shaker (100 סל"ד) בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות כל אחד.
4. כדי לחסום אנטיגנים לא ספציפיים, דגירו את השבלול ב-1 מ"ל של תמיסת חסימה (3% אלבומין בסרום בקר [BSA], 0.2% טריטון, ב-PBS) על ה-2D-shaker (100 סל"ד) בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
   הערה: ניתן להכין את פתרון החסימה מראש, אך לא אמור להיות ארוך מ- ~ 10 ימים.
5. דיללו את הנוגדנים הראשוניים הבאים טריים באותו אליקוט של תמיסת חסימה: אנטי-מיו-ויו-יה (מיוזין VIIa) כדי לתייג IHCs (ארנב פוליקלונלי IgG), מדולל 1:400; אנטי-CtBP2 (חלבון קשירת מסוף C 2) לסימון סרטים קדם-סינפטיים (עכבר חד-שבטי IgG1), מדולל 1:400; ואנטי-GluA2 כדי לתייג מדבקות קולטן פוסט-סינפטיות (IgG2a עכבר חד שבטי), מדולל 1:200. וודאו כי השבלול מכוסה באופן מלא בתמיסת הנוגדנים (בדרך כלל 0.4 מ"ל) ודגרו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
6. לאחר מכן, שטפו את הרקמה פי 5 עם 0.2% טריטון ב-PBS ב-2D-shaker (100 סל"ד) בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות כל אחד. בחר נוגדנים משניים שיתאימו למינים המארחים של עמיתיהם העיקריים ושוב דיללו אותם ב-3% BSA, 0.2% טריטון, ב-PBS: עז נגד עכברים (IgG1)-אלקסה פלואורופור (AF) 488, מדולל 1:1,000; עז נגד עכבר (IgG2a)-AF568, מדולל 1:500; וחמור נגד ארנב-AF647 (IgG), מדולל 1:1,000. עוטפים את הצינור בנייר אלומיניום כדי למנוע הלבנה של הפלואורסצנציה. דגירה של השבלול ב-0.4 מ"ל של תמיסת נוגדנים משניים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
   הערה: ניסויים מוגבלים הצביעו על כך שדגירה של רקמת שבלול בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות עם נוגדנים ראשוניים ומשניים הביאה לשמירה חיסונית בהירה יותר מאשר בעקבות הליך הדגירה הנפוץ יותר עם טמפרטורות נמוכות יותר ומשכי זמן קצרים יותר.
7. שטפו את השבלול 2x עם 1 מ"ל של 0.2% טריטון ב-PBS למשך 5 דקות כל אחד ו-3x עם PBS למשך 5 דקות כל אחד ב-2D-shaker (100 סל"ד) בטמפרטורת החדר.
   הערה: לאחר שלבי כביסה אלה, השבלול יכול להישאר ב- PBS במקרר בטמפרטורה של כ -4 מעלות צלזיוס במשך מספר ימים.

3. טיפול בקוונצ'ר אוטופלואורסצנטי (אופציונלי)

הערה: שבלולים מהגרבילים בגיל העמידה ובגיל העמידה מראים הצטברות אוטו-פלואורסצנטית נרחבת ברקע. ברקמות בוגרות צעירות, אין צורך בטיפול בקוונצ'ר אוטופלואורסצנטי. ניתן, באופן עקרוני, ליישם את הקוונצ'ר האוטו-פלואורסצנטי לפני הליך השמירה החיסונית, אשר לאחר מכן מונע כל הפחתה בשוגג של הפלואורסצנציה הרצויה של הנוגדן. עם זאת, על פי גיליון הנתונים של היצרן, השימוש בדטרגנטים (כגון Triton X-100 בפרוטוקול הנוכחי) אינו אפשרי עוד מכיוון שהם מסירים את הקוונצ'ר מהרקמה.

1. חותכים את השבלול לשניים מתחת לסטריאומיקרוסקופ, כמתואר בשלב 4.2.
2. מערבבים את ה-autofluorescence quencher עם 70% אתנול כדי לקבל תמיסה של 5% ומדגרים את השבלול בתמיסה זו על השייקר הדו-ממדי בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. יש לשטוף את השבלול 3x עם 1 מ"ל של PBS על ה-2D-shaker בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות כל אחד.
   אזהרה: ה-autofluorescence quencher הוא מסוכן ומזיק. ללבוש כפפות בעת טיפול בחומר זה.

4. דיסקציה עדינה סופית

1. לנתח את השבלול תחת סטריאומיקרוסקופ. ממלאים צלחת פטרי פוליסטירול ומכסה שלה ב-PBS ושומרים בהישג יד על שני מלקחיים עדינים, מספריים קפיציים של Vannas, מחזיק להב ומכוז גילוח שבירה. לשבור חתיכות מן סכין הגילוח כדי לקבל משטח חיתוך של ~ 2-4 מ"מ בהתאם לשלב הנתיחה. הכינו שקופית מיקרוסקופ על ידי הצבת שלוש טיפות של מדיום הרכבה ברצף.
   הערה: משטח החיתוך של סכין הגילוח מתפוגג במהירות. יש להחליף את הלהב לאחר ניתוח הרכבה והרכבה של בערך כל חתיכה שנייה של השבלול.
2. אם עדיין לא נעשה בשלב 3.1, תחילה חתכו את השבלול לשניים לאורך המודיולוס תחת סטריאומיקרוסקופ. לשם כך, מקם חתיכה של סכין גילוח ארוכה יותר מהאורך המפותל של השבלול לתוך מחזיק להב. מניחים את השבלול בצלחת פטרי וחותכים את עודפי הרקמה עם פיסת סכין הגילוח. החזיקו את השבלול במקומו עם מלקחיים עדינים וחתכו לשניים לאורך המודיולוס.
3. התחילו עם מחצית אחת, אבל השאירו גם את החצי השני בצלחת פטרי. בזהירות לקבע את חצי השבלול עם מלקחיים כך שקצה החנית פונה כלפי מעלה. השתמש במספריים קפיציים עדינים כדי לחתוך את עצם השבלול מעל ההליקוטרמה, המכסה את הפסגה.
4. כדי להתחיל את ההפרדה של חתיכות שבלול, לבודד את הפנייה האמצעית על ידי חיתוך עם מספריים דרך modiolus ו עצב השמיעה, מעל (scala vestibuli) ומתחת (scala tympani).
5. חותכים דרך עצם השבלול המכסה את הסטריה וסקולריס בתוך צינור השבלול. בצעו שני חתכים משני צידי עצם השבלול מעל איברו של קורטי ולאורך הסטריה וסקולריס והשתמשו בסכין הגילוח כדי להפריד בסופו של דבר את חלקי השבלול.
   הערה: הסטריה וסקולריס נראית בקלות כפס כהה. חיתוך לאורך stria vascularis משאיר את האיבר של קורטי שלם.
6. אופציונלי: כדי לאסוף את stria vascularis, לחתוך בזהירות בין האיבר של קורטי לבין stria vascularis כדי להפריד בין השניים. השאירו את הסטריה וסקולריס מחוברת לרצועה הספירלית (המחוברת לעצם המכסה את המשטח החיצוני של השבלול) והסירו את העצם הדקולרית באמצעות מלקחיים. מניחים את היצירה עם הצד הסטריאלי למעלה על שקופית המיקרוסקופ בטיפה של מדיום הרכבה.
   הערה: אם היצירה שנאספה מעוקלת חזק מדי, ייתכן שיהיה צורך לחלק אותה לחתיכות קטנות יותר כדי שהיא תהיה שטוחה מספיק להרכבה על המגלשה.
7. מעבירים את חלקי השבלול למכסה מלא PBS של צלחת הפוליסטירול פטרי, ומבטיחים כי תושבות השבלול השלמות נמצאות שטוחות ככל האפשר על המגלשה. הסר רקמות עודפות, כגון חלקים של הרצועה הספירלית בצד האבניורלי וחלקים של הלימבוס הספירלי בצד העצבי. בזהירות להסיר את קרום tectorial עם מלקחיים עדינים במיוחד.
8. מניחים את חלקי השבלול על המגלשה לתוך טיפה של מדיום הרכבה. הניחו את התושבות השלמות של השבלול כאשר האיבר של קורטי פונה כלפי מעלה על המגלשה כדי למנוע טשטוש של מעגלים משולבים בנתיב האופטי להדמיה. חפשו את האינווגינציה של הלימבוס הספירלי בסמיכות ל-IHCs, הנראית לעין על ידי הסטת החלק השבלולי לתוך המישור הסגיטלי כדי לזהות את הצד לפנים כלפי מעלה.
   הערה: כדי לשחזר באופן דיגיטלי את השבלול השלם מהחלקים הבודדים שלו במהלך עיבוד נוסף, מומלץ מאוד לתעד רישומים של היצירות ולציין ציוני דרך. יתר על כן, החלקים צריכים להיות מסודרים באופן אידיאלי בסדר הנכון על השקופית.
9. חזור על שלבים 4.3 עד 4.8 עד שכל השבלול מועבר לשקופית המיקרוסקופ. במידת הצורך, יש להוסיף עוד מדיום הרכבה, לכסות את המגלשה ולאטום את הכיסוי במקומו עם לק שחור הצבוע סביב הקצוות. תן לו להתייבש בחושך בטמפרטורת החדר ולאחר מכן אחסן את המגלשה בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   הערה: גם אם חלקים מהאפיתל החושי עצמו הולכים לאיבוד בטעות, חשוב בכל זאת להרכיב את מה שנותר מחתיכת השבלול לצורך הערכת אורך נכונה.

5. מדידת אורך שבלול

1. מדוד את אורך השבלול מתמונות שדה בהיר של חלקיו באמצעות מערכת מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנטית ותוכנה נלווית. חסוך תמונות בהגדלה נמוכה (עדשת 4x) מכל פיסת שבלול והשתמש בכלי מדידת הלאסו של תוכנת המיקרוסקופ כדי לצייר קו לאורך שורת המעגלים המשולבים בכל אחת מהתמונות. חשב את האורך הכולל על-ידי הוספת האורכים של כל החלקים.
   הערה: כאשר חלקים של האפיתל החושי חסרים בתוך חתיכת שבלול, לבצע אינטרפולציה של הקו.
2. כדי להגדיר את מיקומי השבלול שיש לנתח בשבלול בודד, חישבו את המרחקים המקבילים שלהם מהפסגה באמצעות המשוואה שניתנה על ידי מולר²⁵. סמן את המיקומים האלה, למשל, על תדפיס של חתיכות השבלול.

6. רכישת תמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי

1. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי עם מטרה של טבילת שמן 40x (מפתח צמצם מספרי 1.3) והשמן המתאים להדמיה ברזולוציה גבוהה.
   הערה: אם למיקרוסקופ הקונפוקלי יש נתיב אור הפוך, יש למקם את המגלשה במהופך. במקרה זה, תנו לדגימה כ-30 דקות לשקוע ולנוח ביציבות על הכיסוי לפני תחילת הסריקה הסופית. לחלופין, השתמש בתווך הרכבה שהוא זורם לאורך כל משך הנתיחה אך מתמצק מאוחר יותר ומשמר בו זמנית את הפלואורסצנציה.
2. הפעל את הלייזרים המתאימים: שני לייזרים מוליכים למחצה שאובים אופטית עם אורכי גל של λ = 488 ננומטר ו- λ = 522 ננומטר, ולייזר דיודה עם אורך גל של λ = 638 ננומטר משמשים בפרוטוקול זה. בחר את טווח הפליטה של תגי הפלואורסצנציה (AF488: 499-542 ננומטר, AF568: 582-621 ננומטר, AF647: 666-776 ננומטר). כאשר גלאי היברידי סופר את הפוטונים המשוחררים, מקם את קו הלייזר במרחק של לפחות 10 ננומטר מעקומת הפליטה.
   הערה: חשוב לבצע בדיקות ראשוניות עם רקמה בעלת תווית אחת כדי לוודא שרוחבי הפס של הגלאי שנבחרו מפרידים בצורה נקייה בין ערוצי הצבע (כלומר, אינם מובילים להצלבת ערוצים). גלי רדיו מפריעים לגלאי ההיברידי, וכתוצאה מכך ספירת הפוטונים המרבית, ובכך גורמים לפסים אמנותיים בערימה. לכן, הימנע משימוש בטלפון נייד ליד המיקרוסקופ.
3. הגדל את הרקמה עד שהתמונה משתרעת על פני 10 IHCs. בחר את הרזולוציה של התמונה בהתאם לדגימת Nyquist, שהיא בדרך כלל ~ 40-60 ננומטר / פיקסל. הגדר את גודל הצעד בכיוון z ל- 0.3 מיקרומטר ואת מהירות ההדמיה ל- 400-700 הרץ.
   הערה: שתי ההגדרות הללו (גודל צעד ומהירות הדמיה) הן פשרות בין שימוש בפרמטרים אופטימליים של הדמיה לבין חיסכון בזמן הסריקה.
4. בצע דגימה דו-כיוונית כדי לקצר את זמן ההדמיה. לצבור את המסגרת עבור ערוץ 488 ננומטר ו- 638 ננומטר 3x ועבור ערוץ 522 ננומטר 6x; בנוסף, ממוצע הקווים 3x עבור כל ערוץ. בחר את ההתחלה והסוף של הערימה בממד z.
5. הגדר את הרווח ל- 100 בעת שימוש בגלאי ההיברידי (מצב ספירה) כדי למנוע ירידה ביחס האות לרעש. הגדר את עוצמת הלייזר כך שאף פיקסל לא יהיה רווי באזור העניין, אך המבנים מכסים בעיקר את טווח 8 הסיביות המלא. התחילו בהספק לייזר נמוך של 0.5% והגדילו אותו עד שמבנים נראים לעין.
   הערה: צביעה טובה זקוקה בדרך כלל לעוצמת לייזר בין 0.1% ל-5%.
6. השתמש בתוכנת deconvolution לעיבוד פוסט-הוק של ערימות התמונות כדי להסיר את ההילה המטשטשת סביב מבנים פלואורסצנטיים קטנים באמצעות פונקציית התפשטות נקודתית תיאורטית. השתמש באותן הגדרות עבור כל מחסנית בתוך ניסוי. שמור את התמונות המדולדלות כ.tif או .ics.
   הערה: תווית myoVIIa (IHCs) אינה נהנית מפירוק וניתן להשמיט אותה כדי לחסוך זמן. התוכנה משתמשת במטא-נתונים של קבצי התמונה; עם זאת, יש לציין מספר פרמטרים כגון נתיב האור, מדיום ההטבעה או מדיום הטבילה.

7. כימות סינפסה

1. פתח עותק של הערימות המפורקות בתוכנה הנגישה באופן חופשי ImageJ עם תוסף Biovoxxel הנוסף, הזמין גם באתר האינטרנט שלהם.
2. התאמת הצבעים של ערוצים בודדים על-ידי פיצול הערוצים (תמונה | | צבע ערוצים מפוצלים) ומיזוג (תמונה | | צבע מיזוג ערוצים) אותם שוב, הקצאת צבעים שונים. המרת התמונה למחסנית RGB (תמונה | | צבע ערימה ל-RGB) והתאמת הבהירות והניגודיות (תמונה | התאמת | בהירות/ניגודיות | או אוטומטי או מחוון לגבי המקסימום), במידת הצורך, כך שהמבנים שלפני ואחרי הסינפטיים ותווית ה- IHC נבדלים באופן נעים מהרקע.
3. בחר חמישה מעגלים משולבים ותייג אותם בכלי הטקסט (IHC1-IHC5) על-ידי לחיצה על המיקום הרצוי בתוך הערימה. פתח את מנהל ההחזר על ההשקעה (נתח | כלים | מנהל החזר ההשקעה); הפעל את תיבת הסימון תוויות כדי לתייג את הנקודות במספר. התקרבו ל-IHC המעניין.
4. השתמש בכלי נקודה/ריבוי נקודות במצב ריבוי נקודות (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הכלי כדי לבחור בין מצב נקודה או ריבוי נקודות). לחץ על סינפסת סרט פונקציונלית (כלומר, סרט קדם-סינפטי בהתאמה קרובה לתיקון גלוטמט פוסט-סינפטי) תוך כדי גלילה בממד z.
   הערה: בהתאם לכמות החפיפה שלהם ולצבע שנבחר עבור כל ערוץ, הפיקסלים המשותפים מופיעים בצבעים מעורבים. בדרך כלל, ההבחנה בין סינפסות פונקציונליות בודדות היא פשוטה מכיוון שהן רחוקות מספיק זו מזו.
5. כאשר כל המבנים המעניינים מסומנים, לחץ על הוסף את ממשק המשתמש הגרפי של מנהל ההחזר על ההשקעה. לחץ על השם השרירותי ובחר שנה שם.
   הערה: תוויות הנקודה עדיין נשארות בכל המישורים של הערימה כאשר תיבת הסימון הצג את כל הפריטים נבחרת בתפריט אפשרויות כלי הנקודות (לחץ פעמיים על סמל הכלי נקודה ), מה שעוזר להימנע מספירת אותה סינפסת רצועת כלים מספר פעמים.
6. בעת בחירת ה- IHC הבא לספירה, הימנע מהוספה לא מכוונת של ספירות על-ידי התאמת התמונה להצגה מלאה של ה- IHC הבא באמצעות כלי היד. שנה מכלי מרובה נקודות לכלי הצבעה כדי להימנע מהוספת פונקטה נוספת לנתונים שאוחסנו בעבר. לחץ על מבנה עניין בתוך ה- IHC הבא ושנה בחזרה לכלי ריבוי נקודות. חזור על שלבים 7.4 עד 7.5 עד שכל ה- IHCs המעניינים מוערכים.
7. כדי לשמור נתונים, לחץ על ערכת נתונים במנהל ההחזר על ההשקעה ולאחר מכן על מדידה. המתן עד שיופיע חלון חדש המפרט את נקודות הנתונים שנמדדו. שמור רשימה זו כקובץ גיליון אלקטרוני (קובץ | שמור כ). שמור את התמונה על-ידי הפעלת 'הצג הכל ' במנהל ההחזר על ההשקעה. לחץ על Flatten כדי להוסיף לצמיתות את תוויות הנקודה לערימה. בעת סגירת ערימת התמונות, הסכימו לשמור את השינויים.

8. ניתוח נפח סינפסה ומיקום על תא השיער

הערה: המחברים השתמשו בהליך מתוכנת מותאם אישית המבוסס על Matlab. מכיוון שהוא אינו זמין לציבור, הוא מתואר כאן רק במונחים רחבים (ראו גם⁷). אנא צרו קשר עם המחבר המתאים אם אתם מעוניינים להשתמש בו. ההליך מצפה לערימת תמונות עם תווית משולשת (IHCs, טרום ופוסט-סינפטי) בפורמט TIFF כקלט, מנחה את המשתמש בשלבי הניתוח השונים באמצעות ממשק גרפי, ומספק פלט נרחב של התוצאות בפורמט גיליון אלקטרוני.

1. נרמלו את מיקומם של המבנים הסינפטיים למערכת קואורדינטות תלת-ממדית המוגדרת על ידי היקף ה-IHC הבודד על ציר העמוד-טודיולר והציר האפיקלי-בזלתי השבלולי והציר העליון (לוחית קוטיקולרית) של ה-IHC עד התחתון (הקוטב הסינפטי).
   הערה: הנפחים של אלמנטים סינפטיים (הן טרום-סינפטיים והן פוסט-סינפטיים, והנפח המשולב של סינפסות פונקציונליות) מסופקים ב- μm³ ומנורמלים לערך החציוני המתאים³.

תוצאות

שבלולים נקטפו לאחר זלוף קרדיווסקולרי עם קיבוע של החיה כולה או נותחו במהירות לאחר המתת החסד של החיה וטבילה קבועה. בשיטה השנייה, ה-IHCs נשארו במקומם במהלך הנתיחה, בעוד שבמקרים של זלוף לא מוצלח ולכן רקמה לא קבועה מספיק, האפיתל החושי הושמד לעתים קרובות. שימו לב שהמחברים נתקלו במקרים שבהם קיבוע הש...

Discussion

בעזרת השיטה המתוארת בפרוטוקול זה, ניתן לאימונולציה של IHCs ומבנים סינפטיים בשבלול מגרבילים צעירים ומבוגרים, לזהות סינפסות פונקציונליות משוערות על ידי לוקליזציה משותפת של אלמנטים טרום-סינפטיים ופוסט-סינפטיים, להקצות אותם ל-IHCs בודדים ולכמת את מספרם, נפחם ומיקומם. הנוגדנים המשמשים בגישה זו ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin Fraction V biotin-free	Carl Roth	0163.2
anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse)	BD Biosciences, Eysins	612044
anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse)	Millipore	MAB39
anti-mouse (IgG1)-AF 488	Molecular Probes Inc.	A21121
anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit)	Proteus Biosciences	25e6790
Blade Holder & Breaker - Flat Jaws	Fine Science Tools	10052-11
Bonn Artery Scissors - Ball Tip	Fine Science Tools	14086-09
Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm	Carl Roth	LH26.1
Disposable Surgical Blade	Henry Schein	0473
donkey anti-rabbit (IgG)-AF647	Life Technologies-Molecular Probes	A-31573
Dumont #5 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Ethanol, absolute 99.8%	Fisher Scientific	12468750
Ethylenediaminetetraacetic acid	Carl Roth	8040.2
Excel	Microsoft Corporation
Feather Double Edge Blade	PLANO	112-9
G19 Cannula	Henry Schein	9003633
goat anti-mouse (IgG2a)-AF568	Invitrogen	A-21134
Heparin	Ratiopharm	N68542.04
Huygens Essentials	Scientific Volume Imaging
ImageJ	Fiji
Immersol, Immersion oil 518F	Carl Zeiss	10539438
Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung)	Braun	4062957E
ISM596D	Ismatec		peristaltic pump
KL 1600 LED	Schott	150.600	light source for stereomicroscope
Leica Application suite X	Leica Microsystem CMS GmbH
Leica TCS SP8 system	Leica Microsystem CMS GmbH
Matlab	The Mathworks Inc.
Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut	Fine Science Tools	14512-17
Mini-100 Orbital-Genie	Scientific Industries	SI-M100	for use in cold environment
Narcoren (pentobarbital)	Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Nikon Eclipse Ni-Ei	Nikon
NIS Elements	Nikon Europe B.V.
Paraformaldehyde	Carl Roth	0335.3
Petri dish without vents	Avantor VWR	390-1375
Phosphate-buffered saline:
Disodium phosphate	AppliChem	A1046
Monopotassium phosphate	Carl Roth	3904.1
Potassium chloride	Carl Roth	6781.1
Sodium chloride	Sigma Aldrich	31434-M
Screw Cap Containers	Sarstedt	75.562.300
Sodium azide	Carl Roth	K305.1
Student Adson Forceps	Fine Science Tools	91106-12
Student Halsted-Mosquito Hemostat	Fine Science Tools	91308-12
Superfrost Adhesion Microscope Slides	Epredia	J1800AMNZ
Triton  X	Carl Roth	3051.2
TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher	Biotium	23007
Vannas Spring Scissors, 3mm	Fine Science Tools	15000-00
Vectashield Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
Vibrax VXR basic	IKA	0002819000
VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic	IKA	953300
Wild TYP 355110 (Stereomicroscope)	Wild Heerbrugg		not available anymore