Sinpses de fita de imunolabeling e contagem em jovens adultos e cócleas de Gerbil Envelhecido

Resumo

Um protocolo para processar a cópula gerbil jovem e envelhecida imunolabelando as estruturas sinápticas e células ciliadas anciavelmente, saciando a autofluorescência no tecido envelhecido, dissecando e estimando o comprimento da cóclea, e quantificando as sinapses em pilhas de imagens obtidas com imagens confocalas.

Resumo

A perda de sinapses de fita que conectam células ciliares internas e fibras nervosas auditivas diferentes é considerada uma das causas da perda auditiva relacionada à idade. O método mais comum para detectar a perda de sinapses de fita é o imunolabeling porque permite a amostragem quantitativa de vários locais tonotópicos em uma cóclea individual. No entanto, as estruturas de interesse estão enterradas no interior da cóclea óssea. Gerbils são usados como modelo animal para perda auditiva relacionada à idade. Aqui, protocolos de rotina para fixação, montagens inteiras de gerbil coclear de imunolabeling, imagens confocal e números e volumes de sinapse de fita quantificando são descritos. Além disso, destacam-se os desafios particulares associados à obtenção de bons materiais de indivíduos valiosos do envelhecimento.

Gerbils são eutanizados e ou perfundidos cardiovascularmente, ou suas bípricas timpânicas são cuidadosamente dissecadas para fora do crânio. A cóclea é aberta no ápice e base e diretamente transferida para o fixador. Independentemente do método inicial, a cóclea é postfixada e posteriormente descalcificada. O tecido é então rotulado com anticorpos primários contra estruturas pré e postiáticas e células ciliadas. Em seguida, a cóclea é incubada com anticorpos com marca de fluorescência secundária que são específicos contra seus respectivos primários. A cóclea de gerbils envelhecidos é então tratada com uma quencher de autofluorescência para reduzir a fluorescência de fundo tipicamente substancial dos tecidos dos animais mais velhos.

Finalmente, a cóclea é dissecada em segmentos 6-11. Todo o comprimento coclear é reconstruído de tal forma que locais cocleares específicos podem ser determinados de forma confiável entre os indivíduos. Pilhas de imagens confocal, adquiridas sequencialmente, ajudam a visualizar células ciliadas e sinapses nos locais escolhidos. As pilhas confocal são desconvolvadas, e as sinapses são contadas manualmente usando ImageJ, ou a quantificação mais extensa de estruturas sinápticas é realizada com procedimentos de análise de imagem escritos sob medida no Matlab.

Introdução

A perda auditiva relacionada à idade é uma das doenças mais prevalentes do mundo que afeta mais de um terço da população mundial com 65 anos ou^{mais de 1 ano}. As causas subjacentes ainda estão em debate e estão sendo investigadas ativamente, mas podem incluir a perda das sinapses especializadas que conectam células ciliadas internas (IHCs) com diferentes fibras nervosas auditivas². Estas sinapses de fita compreendem uma estrutura pré-sináptica que tem vesículas preenchidas com o glutamato neurotransmissor amarrado a ele, bem como receptores de glutamato α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropionic ácido (AMPA)^{receptores de} glutamato ^3,4,5. No gerbil, ~20 fibras nervosas auditivas diferentes entram em contato com um IHC ^6,7,8. As fibras no IHC voltadas para o modiólus se opõem a grandes fitas sinápticas, enquanto as fibras que se conectam no lado do pilar do IHC enfrentam pequenas fitas sinápticas (ou seja, em gatos⁹, gerbils⁷, cobaias¹⁰ e ratos 3,11,12,13,14). Além disso, no gerbil, o tamanho das fitas pré-sinápticas e as manchas de glutamato postsintáptico estão correlacionados positivamente ^7,14. As fibras que se opõem a grandes fitas no lado modiolar do IHC são pequenas de calibre e têm baixas taxas espontâneas e limiares elevados¹⁵. Há evidências de que as fibras de baixa taxa espontânea são mais vulneráveis à exposição ao ruído¹⁰ e drogas ototóxias¹⁶ do que fibras de baixo limiar espontâneos, que estão localizadas no lado pilar dos IHCs¹⁵.

A perda de sinapses de fita é o mais antigo evento degenerativo na perda auditiva relacionada à idade neural coclear, enquanto a perda de células de gânglio espiral e suas diferentes fibras nervosas auditivas fica atrás^{de 17,18}. Correlações eletrofisiológicas incluem gravações de respostas auditivas do tronco^{cerebral 17} e potenciais de ação composta⁸; entretanto, não refletem as sutilezas da perda de sinapse, uma vez que as fibras de baixa taxa espontânea não contribuem para essas medidas¹⁶. Métricas eletrofisiológicas mais promissoras são o índice neural derivado de massa¹⁹ e a resposta ao tempo peristimulus²⁰. No entanto, estes só são confiáveis se o animal não tiver outras patologias cocleares, além da perda auditiva de fibras nervosas, que afetam a atividade das fibras nervosas auditivas restantes⁸. Além disso, os limiares avaliados comportamentalmente no gerbil não foram correlacionados com os números da sinapse²¹. Portanto, a quantificação confiável das sinapses de fita sobreviventes e, assim, o número de fibras nervosas auditivas funcionais só é possível mediante o exame direto do tecido coclear.

O gerbil mongol (Meriones unguiculatus) é um modelo animal adequado para estudar a perda auditiva relacionada à idade. Tem uma vida útil curta, tem audição de baixa frequência semelhante aos humanos, é fácil de manter, e mostra semelhanças com patologias humanas relacionadas à perda auditiva relacionada à idade 2,22,23,24. Os gerbils são considerados idosos quando chegam aos 36 meses de idade, o que está perto do fim de sua média de vida²². É importante ressaltar que uma perda relacionada à idade das sinapses de fita tem sido demonstrada em gerbils criados e envelhecidos em ambientes tranquilos ^8,21.

Aqui, é apresentado um protocolo para imunolabel, dissecar e analisar cócleas de gerbils de diferentes idades, de adultos jovens a idosos. Anticorpos direcionados contra componentes da presinapse (CtBP2), patches de receptor de glutamato postânaptic (GluA2) e IHCs (myoVIIa). Aplica-se um quencher de autofluorescência que reduz o fundo em cóclea envelhecida e deixa o sinal de fluorescência intacto. Além disso, é dada uma descrição de como dissecar a cóclea para examinar tanto o epitélio sensorial quanto a estria vascularis. O comprimento coclear é medido para permitir a seleção de locais cocleares distintos que correspondem às melhores frequências específicas²⁵. A quantificação dos números da sinapse é realizada com o software disponível livremente ImageJ²⁶. A quantificação adicional de volumes e locais de sinapse dentro do HC individual é realizada com software personalizado escrito no Matlab. Este software não é disponibilizado publicamente, pois os autores não têm recursos para fornecer documentação profissional e suporte.

Protocolo

Todos os protocolos e procedimentos foram aprovados pelas autoridades competentes da Baixa Saxônia, Alemanha, com números de licenças AZ 33.19-42502-04-15/1828 e 33.19-42502-04-15/1990. Este protocolo é para gerbils mongóis (M. unguiculatus) de ambos os sexos. O adulto jovem refere-se à idade de 3-12 meses, enquanto os gerbils são considerados com idade aos 36 meses ou mais. Quando não indicado o contrário, buffers e soluções podem ser preparados e armazenados na geladeira por até vários meses (4-8 °C). Antes de usar, certifique-se de que os buffers e soluções não tenham precipitado.

1. Fixação e coleta de órgãos

NOTA: Se apenas a cóclea for necessária, recomenda-se realizar o procedimento um pouco mais simples de fixação por imersão. No entanto, se um cérebro bem preservado também é necessário, então a perfusão transcárvia é a única opção. O fixador em ambos os casos é 4% de paraformaldeído (PFA) em soro fisiológico tamponado por fosfato (PBS). Isso deve ser feito recentemente, mas pode ser armazenado congelado até o uso. Use alíquotas de ~300 mL para uma perfusão transcárvia ou ~50-100 mL por cóclea para fixação por imersão.

ATENÇÃO: A PFA é uma substância perigosa; lidar com isso de acordo com os procedimentos gerais de segurança do laboratório.

1. Fixação por perfusão transcárvia
   1. Lave a configuração de perfusão até que a tubulação esteja livre de bolhas de ar. Encha a tubulação de perfusão com PBS contendo heparina (0,2 mL em 100 mL de PBS) para evitar a coagulação sanguínea. Pare o fluxo quando a tubulação estiver cheia de PBS e o frasco de armazenamento de fluidos tiver acabado de esvaziar; despeje 200 mL de PFA descongelado nele.
      NOTA: A configuração está agora pronta para o animal. O PBS restante na tubulação é suficiente para limpar o sangue e será automaticamente seguido pelo fixador assim que o fluxo for retomado.
   2. Certifique-se de que um sistema de coleta de lixo esteja em vigor para o fluxo de PFA. Use uma cânula fresca (19 G) e tenha uma tesoura grande, fórceps (com ponta achatada), hemostats, bisturi ou cânula afiada, e um tapete de borracha com pinos à mão.
   3. Eutanize o gerbil com uma overdose intraperitoneal de pentobarbital (160 mg/mL, 0,3 mL por animal, faixa de peso corporal: 50-120 g). Coloque o animal de volta em sua gaiola. Quando a parada respiratória se fixa em tal forma que a respiração se torne irregular com intervalos de 30 s ou mais, coloque o gerbil nas costas no tapete de borracha e fixe tanto patas dianteiras quanto uma pata traseira com pinos (deixe uma pata traseira livre para se mover para melhor julgamento do sucesso da perfusão; veja nota após o passo 1.1.7).
   4. Para abrir a cavidade torácica, levante a pele acima do esterno com fórceps e corte a pele aproximadamente 0,5 cm abaixo do esterno com uma tesoura até que o processo de cor branca xiphoideus seja visível. Segure o esterno no processo xiphoideus com fórceps e corte ao longo do diafragma para obter uma boa visão da cavidade torácica. Corte as costelas lateralmente em ambos os lados até que haja um bom acesso ao coração. Certifique-se de que o ângulo da tesoura seja paralelo e plano em relação ao corpo do gerbil para evitar danos aos órgãos e, assim, garantir um sistema circulatório fechado.
   5. Fixar um hemostata no esterno, levantar a caixa torácica e colocar o hemostata sobre o ombro do gerbil sem descansar o hemostato em qualquer parte do corpo para evitar bloquear o fluxo sanguíneo.
   6. Abra o fluxo de fluido ligeiramente até que uma gota de PBS flua para fora da cânula (19 G) aproximadamente a cada 2 s. Segure o coração com fórceps e gire-o um pouco para a esquerda de tal forma que o ventrículo esquerdo possa ser claramente visto. Insira a cânula no ventrículo esquerdo em um ângulo que evite penetrar o septo. Segure a agulha no lugar, à mão ou com outro hemostata.
      NOTA: Os ventrículos esquerdo e direito podem ser diferenciados por suas diferentes tonalidades de cor; o ventrículo esquerdo aparece de cor mais clara do que o resto do tecido cardíaco.
   7. Aumente lentamente a pressão do fluxo de fluidos e abra o átrio direito com uma tesoura fina, um bisturi ou outra cânula. Abra ainda mais o fluxo de fluido até que aproximadamente 2-3 gotas/s sejam observadas na câmara de gotejamento, ou defina um fluxo de 4 mL/min para a bomba. Uma vez que a fixação do coração se instale, certifique-se de que a cânula de perfusão permaneça no lugar sem ser realizada mais adiante.
      NOTA: Os sinais de perfusão bem sucedida são contrações musculares lentas, endurecimento do pescoço e extremidades, o fígado ficando pálido, e pulmões rosados. O sinal de perfusão mal sucedida é o clareamento dos pulmões, o que indica que a circulação pulmonar está perfusada devido à punção do septo.
   8. Em caso de perfusão mal sucedida, tente mover a cânula mais para cima, para a aorta, e fixá-la no lugar com um hemostat.
   9. Decapitar o gerbil. Remova o bullae e corte e quebre seu osso conforme descrito na etapa 1.2.2.
      NOTA: Se o tecido não estiver suficientemente fixo, o epitélio sensorial se desalojará do órgão de Corti durante a dissecção.
   10. Se a perfusão não mostrar sinais de fixação dentro de 5-10 minutos, aborte-a e siga imediatamente o procedimento abaixo para fixação por imersão. Para isso, trate a cóclea como na etapa 1.2.2 e poste o tecido em aproximadamente 50-80 mL de 4% pfa em recipientes de tampa de parafuso por 1-2 dias em um shaker 2D a 8 °C.
       NOTA: Uma vez que pode ser difícil avaliar a qualidade da fixação durante a perfusão, recomenda-se postar rotineiramente a cóclea como descrito.
2. Fixação por imersão tecidual
   1. Eutanize os gerbils com uma overdose intraperitoneal de pentobarbital (160 mg/mL, 0,3 mL por animal, faixa de peso corporal: 50-120 g). Quando o gerbil parar de respirar, decapite o animal.
   2. Remova o bullae e corte e quebre seu osso com tesouras e fórceps, respectivamente, para alcançar a cóclea. Remova os canais maellus, incus e semicircular. Faça pequenos orifícios no ápice e na curva basal coçando cuidadosamente sobre o osso coclear com fórceps. Transfira imediatamente o bullae em excesso de fixação a frio (pelo menos 50 mL) e fixe o tecido no frio (4-8 °C) sob agitação suave (2D-shaker [100 rpm]) por 2 dias.
      NOTA: Após a fixação do tecido, a cóclea pode ser processada imediatamente ou armazenada em PBS com azida de sódio de 0,05%. ATENÇÃO: O azida de sódio é tóxico. Observe que o comprimento do armazenamento pode influenciar negativamente a qualidade da coloração. Estudos limitados sugerem que a imunostaining parecia mais fraca após 2 anos armazenando o tecido em azida de sódio.

2. Preparação e imunolabelamento de tecidos

1. Dissolver o ácido etilenodiaminatotraacético (EDTA) em pó de PBS para produzir uma solução de 0,5 M em pH 8. Para isso, coloque um béquer em um agitador magnético, preencha-o com aproximadamente metade da quantidade total do PBS e adicione a quantidade apropriada de pó EDTA, resultando em uma suspensão ácida. Adicione cuidadosamente a solução concentrada de hidróxido de sódio (NaOH) enquanto monitora o pH com um medidor de pH. Encha com PBS até o volume final desejado e filtre a solução para evitar contaminação microbiana.
   NOTA: O pó EDTA só se dissolverá completamente quando a suspensão atingir um valor de pH neutro.
2. Para descalcificação, transfira a cóclea para 80 mL de 0,5 M EDTA na PBS. Incubar o tecido no frio (4-8 °C) sob agitação suave no shaker 2D (100 rpm) por 2 dias.
   NOTA: Após a etapa de descalcificação, o tecido pode ser armazenado em PBS por vários dias até 3 semanas antes de continuar com as etapas restantes de processamento. Para anticorpos que rotulam a estria vascularis, é aconselhável cortar a cóclea ao meio ao longo do eixo modiolar neste ponto (ou seja, antes da imunostaining) para garantir o acesso uniforme de anticorpos aos seus respectivos alvos. Isso é dependente de anticorpos e não se aplica aos anticorpos aqui utilizados para rotular estruturas sinápticas e IHCs. Use um pedaço de lâmina de barbear quebrável e um suporte de lâmina (conforme descrito na etapa 4.2) para o corte.
3. Realize as seguintes etapas (até o passo 3.2) em tubos de reação de vedação segura de 2 mL. Se a peça de tecido for muito grande para caber dentro do tubo, corte o excesso de tecido com uma tesoura. Para melhorar a penetração dos anticorpos, primeiro permeabilize o tecido em 1 mL de triton de 1% (Triton X-100) em PBS no shaker 2D (100 rpm) à temperatura ambiente por 1 h. Lave o tecido 3x com 1 mL de triton de 0,2% (Triton X-100) em PBS no shaker 2D (100 rpm) à temperatura ambiente por 5 min cada.
4. Para bloquear antígenos não específicos, incubar a cóclea em 1 mL de solução de bloqueio (3% de albumina de soro bovino [BSA], 0,2% triton, em PBS) no shaker 2D (100 rpm) à temperatura ambiente por 1h.
   NOTA: A solução de bloqueio pode ser preparada com antecedência, mas não deve ser maior que ~10 dias.
5. Diluir os seguintes anticorpos primários recentemente na mesma alíquota da solução de bloqueio: anti-myoVIIa (myosin VIIa) para rotular IHCs (coelhinho policlonal IgG), diluído 1:400; anti-CtBP2 (proteína de ligação terminal C 2) para rotular fitas pré-sinápticas (camundongo monoclonal IgG1), diluído 1:400; e anti-GluA2 para rotular patches de receptores postinápticos (mouse monoclonal IgG2a), diluídos 1:200. Certifique-se de que a cóclea está totalmente coberta com a solução de anticorpos (tipicamente 0,4 mL) e incuba-as a 37 °C por 24 h.
6. Em seguida, lave o tecido 5x com triton de 0,2% no PBS no shaker 2D (100 rpm) em temperatura ambiente por 5 min cada. Escolha anticorpos secundários para combinar com as espécies hospedeiras de suas contrapartes primárias e novamente diluí-los recentemente em 3% BSA, 0,2% triton, em PBS: anti-rato de cabra (IgG1)-Alexa fluorophore (AF) 488, diluído 1:1.000; anti-rato de cabra (IgG2a)-AF568, diluído 1:500; e burro anti-coelho-AF647 (IgG), diluído 1:1.000. Enrole o tubo em papel alumínio para evitar branqueamento da fluorescência. Incubar a cóclea em 0,4 mL de solução de anticorpos secundários a 37 °C por 24 h.
   NOTA: Estudos limitados indicaram que a incubação de tecido coclear a 37 °C por 24 h com anticorpos primários e secundários resultou em imunostaining mais brilhante do que seguir o procedimento de incubação mais comum com temperaturas mais baixas e durações mais curtas.
7. Lave a cóclea 2x com 1 mL de 0,2% de triton em PBS por 5 min cada e 3x com PBS por 5 min cada no shaker 2D (100 rpm) à temperatura ambiente.
   NOTA: Após estas etapas de lavagem, a cóclea pode permanecer em PBS na geladeira a ~4 °C por vários dias.

3. Tratamento com quencher de autofluorescência (opcional)

NOTA: Cóclea de gerbils de meia-idade e idade apresentam extensa autofluorescência de fundo. No tecido adulto jovem, o tratamento com uma quencher de autofluorescência não é necessário. É, em princípio, possível aplicar a quencher de autofluorescência antes do procedimento de imunossuagem, o que evita qualquer redução inadvertida da fluorescência de anticorpos desejada. No entanto, de acordo com a folha de dados do fabricante, o uso de detergentes (como Triton X-100 no protocolo atual) não é mais possível, pois eles removem a saciador do tecido.

1. Corte a cóclea ao meio sob um estereoscópio, conforme descrito na etapa 4.2.
2. Misture a saciador de autofluorescência com 70% de etanol para obter uma solução de 5% e incubar a cóclea nesta solução no shaker 2D à temperatura ambiente por 1 min. Lave a cóclea 3x com 1 mL de PBS no shaker 2D à temperatura ambiente por 5 minutos cada.
   ATENÇÃO: A saciador de autofluorescência é perigosa e prejudicial. Use luvas ao manusear esta substância.

4. Dissecção final da multa

1. Disseque a cóclea sob um estereótipo. Encha uma placa de Petri de polistyrole e sua tampa com PBS e mantenha dois fórceps finos, tesoura de mola Vannas, um porta-lâminas, e um lâmina de barbear útil. Quebre peças da lâmina de barbear para obter uma superfície de corte de ~2-4 mm dependendo da etapa de dissecção. Prepare um slide de microscópio colocando três gotas de meio de montagem em uma fileira.
   NOTA: A superfície de corte da lâmina de barbear passa rapidamente. A lâmina deve ser trocada após dissecar e montar aproximadamente cada segundo pedaço da cóclea.
2. Se ainda não foi feito na etapa 3.1, primeiro corte a cóclea ao meio ao longo do modiósoco sob um estereómico. Para isso, posicione um pedaço de um razorblade por mais tempo do que o comprimento enrolado da cóclea em um suporte de lâmina. Coloque a cóclea na placa de Petri e corte o excesso de tecido com o pedaço de lâmina de barbear. Segure a cóclea no lugar com fórceps finos e corte ao meio ao longo do modiolo.
3. Comece com metade, mas deixe a outra metade na placa de Petri também. Fixar cuidadosamente a metade coclear com fórceps de tal forma que a borda de corte esteja voltada para cima. Use uma tesoura de mola fina para cortar o osso da cóclea acima do helicotrema, cobrindo o ápice.
4. Para iniciar a separação das peças cocleares, isole a curva média cortando com tesouras através do míquilo e nervo auditivo, acima (scala vestibuli) e abaixo (scala tympani).
5. Corte através do osso coclear cobrindo a estria vascularis dentro do duto coclear. Faça dois cortes em ambos os lados do osso coclear acima do órgão de Corti e ao longo da estria vascularis e use o razorblade para eventualmente separar as peças cocleares.
   NOTA: A estria vascularis é facilmente visível como uma listra escura. Cortar ao longo da estria vascularis deixa o órgão de Corti intacto.
6. Opcional: Para coletar a estria vascularis, corte cuidadosamente entre o órgão de Corti e a estria vascularis para separar os dois. Deixe a estria vasculare conectada ao ligamento espiral (presa ao osso que cobre a superfície externa da cóclea) e remova o osso decalcificado usando fórceps. Coloque a peça com o lado estria para cima no deslizamento do microscópio em uma gota de meio de montagem.
   NOTA: Se a peça coletada for curvada com muita força, pode ser necessário dividi-la em pedaços menores para que ela seja plana o suficiente para a montagem no slide.
7. Transfira as peças cocleares para a tampa cheia de PBS da placa petri de poliestireno, garantindo que as montagens inteiras cocleares deitem o mais plano possível no escorregador. Remova o excesso de tecido, como partes do ligamento espiral no lado abneural e partes do limbus espiral no lado neural. Remova cuidadosamente a membrana tectorial com fórceps super finos.
8. Coloque as peças cocleares sobre o slide em uma gota de meio de montagem. Coloque as montagens inteiras cocleares com o órgão de Corti voltado para cima no slide para evitar ocultar os IHCs no caminho óptico para imagem. Procure a invaginação do limbus espiral nas proximidades dos IHCs, que é visível deslocando a peça coclear para o plano sagital para identificar o lado a olhar para cima.
   NOTA: Para reconstruir digitalmente a cóclea completa de suas peças individuais durante o processamento posterior, é fortemente recomendável documentar esboços das peças e observar marcos. Além disso, as peças devem ser organizadas na ordem correta no slide.
9. Repita as etapas 4.3 a 4.8 até que toda a cóclea seja transferida para o slide do microscópio. Se necessário, adicione mais meio de montagem, cubra o slide e sele o deslizamento no lugar com esmalte preto pintado ao redor das bordas. Deixe-o secar no escuro à temperatura ambiente e, em seguida, armazene o slide no escuro a 4 °C.
   NOTA: Mesmo que partes do epitélio sensorial em si sejam acidentalmente perdidas, é importante, no entanto, montar o que sobrou da peça coclear para a estimativa correta do comprimento.

5. Medição do comprimento coclear

1. Meça o comprimento da cóclea a partir de imagens de brightfield de suas peças usando um sistema de microscópio epi-fluorescência e software associado. Salve imagens de baixa ampliação (lente 4x) de cada peça coclear e use a ferramenta de medição de laços do software de microscópio para desenhar uma linha ao longo da linha de IHCs em cada uma das imagens. Calcule o comprimento total adicionando os comprimentos de todas as peças.
   NOTA: Quando partes do epitélio sensorial estão faltando dentro de uma peça coclear, interpolar a linha.
2. Para definir os locais cocleares que devem ser analisados em uma cóclea individual, calcule suas distâncias correspondentes do ápice usando a equação dada por Müller²⁵. Marque esses locais, por exemplo, em uma impressão das peças cocleares.

6. Aquisição de imagem com microscópio confocal

1. Use um microscópio confocal com um objetivo de imersão a óleo de 40x (abertura numérica 1.3) e o óleo apropriado para imagens de alta resolução.
   NOTA: Se o microscópio confocal tiver um caminho de luz invertida, o slide deve ser posicionado de cabeça para baixo. Neste caso, dê ao espécime aproximadamente 30 minutos para afundar e descansar firmemente na tampa antes de iniciar a varredura final. Alternativamente, use um meio de montagem que seja fluido durante toda a duração da dissecção, mas solidifica posteriormente e simultaneamente conserva a fluorescência.
2. Ative os lasers apropriados: dois lasers semicondutores bombeados opticamente com comprimentos de onda de λ = 488 nm e λ = 522 nm, e um laser de diodo com comprimento de onda de λ = 638 nm são usados neste protocolo. Escolha a faixa de emissão das tags de fluorescência (AF488: 499-542 nm, AF568: 582-621 nm, AF647: 666-776 nm). Como um detector híbrido conta os fótons liberados, coloque a linha laser a pelo menos 10 nm de distância da curva de emissão.
   NOTA: É importante realizar verificações preliminares com tecido de etiqueta única para garantir que as larguras de banda do detector escolhidos separem limpamente os canais de cores (ou seja, não levam ao crosstalk do canal). Ondas de rádio interferem com o detector híbrido, resultando em contagem máxima de fótons, e assim causam listras artefatos na pilha. Portanto, evite usar um celular perto do microscópio.
3. Amplie o tecido até que a imagem se estecie em 10 IHCs. Escolha a resolução da imagem de acordo com a amostragem de Nyquist, que normalmente é ~40-60 nm/pixel. Defina o tamanho da etapa na direção z para 0,3 μm e a velocidade de imagem para 400-700 Hz.
   NOTA: Ambas as configurações (tamanho da etapa e velocidade de imagem) são comprometidas entre o uso de parâmetros de imagem ideais e a economia de tempo de varredura.
4. Realize amostragem bidirecional para encurtar o tempo de imagem. Acumule o quadro para o canal 3x de 488 nm e 638 nm e para o canal 6x de 522 nm; adicionalmente, média das linhas 3x para cada canal. Escolha o início e o fim da pilha na dimensão z.
5. Ajuste o ganho para 100 ao usar o detector híbrido (modo de contagem) para evitar a diminuição da relação sinal-ruído. Defina a potência do laser para que nenhum pixel esteja saturado na região de interesse, mas as estruturas cobrem principalmente toda a gama de 8 bits. Comece com uma baixa potência laser de 0,5% e aumente-a até que as estruturas sejam visíveis.
   NOTA: Uma boa coloração normalmente precisa de uma potência laser entre 0,1% e 5%.
6. Use software de desconvolução para processamento pós-hoc das pilhas de imagens para remover o halo de desfoque em torno de pequenas estruturas fluorescentes usando uma função teórica de propagação de pontos. Use as mesmas configurações para cada pilha dentro de um experimento. Salve as imagens desconvolvadas como .tif ou .ics.
   NOTA: O rótulo myoVIIa (IHCs) não se beneficia da desconvolução e pode ser omitido para economizar tempo. O software usa meta-dados dos arquivos de imagem; no entanto, vários parâmetros como o caminho da luz, o meio de incorporação ou o meio de imersão precisam ser especificados.

7. Quantificação sinapse

1. Abra uma cópia das pilhas desconvolved no software de acesso livre ImageJ com o biovoxxel-plugin adicional, que também está disponível em seu site.
2. Ajuste as cores dos canais individuais dividindo os canais (Imagem | | de cor Canais Divididos) e fusão (| de imagem | de cor Mesclar canais) novamente, atribuindo cores diferentes. Converta a imagem em uma pilha de RGB (| de imagem | de cor Empilhe para RGB) e ajuste o brilho e o contraste (imagem | Ajuste | brilho/contraste | Tanto auto quanto slider em relação ao Máximo), se necessário, de modo que as estruturas pré e postsinápticas e o rótulo IHC sejam agradavelmente distintos do plano de fundo.
3. Escolha cinco IHCs e rotule-os com a ferramenta de texto (IHC1-IHC5) clicando no local desejado dentro da pilha. Abra o gerente do ROI (Analisar | Ferramentas | Gerente de ROI); ativar as etiquetas da caixa de marcação para rotular os pontos com um número. Amplie o IHC de interesse.
4. Use a ferramenta ponto/vários pontos no modo multiponto (clique com o botão direito do mouse na ferramenta para escolher entre o modo ponto ou multiponto). Clique em uma sinapse de fita funcional (ou seja, uma fita pré-sináptica em justaposição próxima a um patch de glutamato postsynáptico) enquanto percorre a dimensão z.
   NOTA: Dependendo da quantidade de sobreposição e da cor escolhida para cada canal, os pixels compartilhados aparecem em cores mistas. Geralmente, a distinção entre sinapses funcionais individuais é simples porque elas são suficientemente distantes umas das outras.
5. Quando todas as estruturas de interesse estiverem marcadas, clique em Adicionar na interface gráfica do usuário do gerenciador de ROI. Clique no nome arbitrário e escolha Renomear.
   NOTA: Os rótulos de ponto ainda permanecem em todos os planos da pilha quando a caixa de seleção Mostrar todas são selecionadas no menu de opções de ferramentas de ponto (clique duas vezes no ícone da ferramenta point ), o que ajuda a evitar contar a mesma sinapse de fita várias vezes.
6. Ao escolher o próximo IHC para contar, evite adicionar inadvertidamente contagens ajustando a imagem para exibir totalmente o próximo IHC com a ferramenta manual. Mude de ferramenta de vários pontos para ferramenta de ponto para evitar adicionar mais puncta aos dados armazenados anteriormente. Clique em uma estrutura de interesse dentro do próximo IHC e mude de volta para a ferramenta multiponto. Repetição de passos de 7,4 a 7,5 até que todos os IHCs de interesse sejam avaliados.
7. Para salvar dados, clique em um conjunto de dados no gerenciador de ROI e, em seguida, em medida. Aguarde que uma nova janela apareça, listando os pontos de dados medidos. Salve esta lista como um arquivo de planilha (Arquivo | Salve como). Salve a imagem ativando o Show All no gerenciador de ROI. Clique em Achatar para adicionar permanentemente os rótulos de ponto à pilha. Ao fechar a pilha de imagens, concorde em salvar as alterações.

8. Análise do volume e posição da sinapse na célula ciliar

NOTA: Os autores utilizaram um procedimento programado sob medida baseado no Matlab. Uma vez que não está disponível publicamente, é descrito aqui apenas em termos gerais (veja também⁷). Entre em contato com o autor correspondente, se tiver interesse em usá-lo. O procedimento espera uma pilha de imagens de três rótulos (IHCs, pré e postsynaptic) no formato TIFF como entrada, orienta o usuário através das várias etapas de análise através de uma interface gráfica e fornece uma saída extensiva dos resultados em formato de planilha.

1. Normalize a posição das estruturas sinápticas para um sistema de coordenadas 3D definido pela extensão individual do IHC no eixo pilar-modificador e eixo aclássico-basal coclear e o eixo topo (placa cuticular) do IHC para o eixo inferior (polo sináptico).
   NOTA: Os volumes de elementos sinápticos (pré e postssynaptic, e o volume combinado de sinapses funcionais) são fornecidos em μm³ e normalizados ao respectivo valor mediano³.

Resultados

A cóclea foi colhida após perfusão cardiovascular com fixação de todo o animal ou rapidamente dissecada após eutanásia do animal e imersão fixada. Com este último método, os IHCs permaneceram no lugar durante a dissecção, enquanto, em casos de perfusão mal sucedida e, portanto, tecido insuficientemente fixo, o epitélio sensorial foi muitas vezes destruído. Note-se que os autores encontraram casos em que a fixação da cóclea após a perfusão transcárlica foi insuficiente enquanto a fixação do cérebro...

Discussão

Com o método descrito neste protocolo, é possível imunolabel IHCs e estruturas sinápticas em cócleas de gerbils jovens adultos e idosos, identificar supostas sinapses funcionais por co-localização de elementos pré e post-sinápticos, alocá-los para IHCs individuais e quantificar seu número, volume e localização. Os anticorpos utilizados nesta abordagem também rotularam células ciliadas externas (OHCs; myoVIIa) e suas fitas pré-sinápticas. Além disso, uma alternativa viável para a imunolabelagem de ambo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin Fraction V biotin-free	Carl Roth	0163.2
anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse)	BD Biosciences, Eysins	612044
anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse)	Millipore	MAB39
anti-mouse (IgG1)-AF 488	Molecular Probes Inc.	A21121
anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit)	Proteus Biosciences	25e6790
Blade Holder & Breaker - Flat Jaws	Fine Science Tools	10052-11
Bonn Artery Scissors - Ball Tip	Fine Science Tools	14086-09
Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm	Carl Roth	LH26.1
Disposable Surgical Blade	Henry Schein	0473
donkey anti-rabbit (IgG)-AF647	Life Technologies-Molecular Probes	A-31573
Dumont #5 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Ethanol, absolute 99.8%	Fisher Scientific	12468750
Ethylenediaminetetraacetic acid	Carl Roth	8040.2
Excel	Microsoft Corporation
Feather Double Edge Blade	PLANO	112-9
G19 Cannula	Henry Schein	9003633
goat anti-mouse (IgG2a)-AF568	Invitrogen	A-21134
Heparin	Ratiopharm	N68542.04
Huygens Essentials	Scientific Volume Imaging
ImageJ	Fiji
Immersol, Immersion oil 518F	Carl Zeiss	10539438
Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung)	Braun	4062957E
ISM596D	Ismatec		peristaltic pump
KL 1600 LED	Schott	150.600	light source for stereomicroscope
Leica Application suite X	Leica Microsystem CMS GmbH
Leica TCS SP8 system	Leica Microsystem CMS GmbH
Matlab	The Mathworks Inc.
Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut	Fine Science Tools	14512-17
Mini-100 Orbital-Genie	Scientific Industries	SI-M100	for use in cold environment
Narcoren (pentobarbital)	Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Nikon Eclipse Ni-Ei	Nikon
NIS Elements	Nikon Europe B.V.
Paraformaldehyde	Carl Roth	0335.3
Petri dish without vents	Avantor VWR	390-1375
Phosphate-buffered saline:
Disodium phosphate	AppliChem	A1046
Monopotassium phosphate	Carl Roth	3904.1
Potassium chloride	Carl Roth	6781.1
Sodium chloride	Sigma Aldrich	31434-M
Screw Cap Containers	Sarstedt	75.562.300
Sodium azide	Carl Roth	K305.1
Student Adson Forceps	Fine Science Tools	91106-12
Student Halsted-Mosquito Hemostat	Fine Science Tools	91308-12
Superfrost Adhesion Microscope Slides	Epredia	J1800AMNZ
Triton  X	Carl Roth	3051.2
TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher	Biotium	23007
Vannas Spring Scissors, 3mm	Fine Science Tools	15000-00
Vectashield Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
Vibrax VXR basic	IKA	0002819000
VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic	IKA	953300
Wild TYP 355110 (Stereomicroscope)	Wild Heerbrugg		not available anymore