Genç Yetişkin ve Yaşlı Gerbil Cochleae'de İmmünoetiketleme ve Şerit Sinapslarının Sayılması

Özet

Genç erişkin ve yaşlı gerbil kokleae'lerin afferent sinaptik yapıların ve saç hücrelerinin immüno-etiketlenmesi, yaşlı dokudaki otofloresansın söndürülmesi, kokleae'nin uzunluğunun diseksiyonu ve tahmin edilmesi ve konfokal görüntüleme ile elde edilen görüntü yığınlarındaki sinapsların nicelleştirilmesi için bir protokol sunulmaktadır.

Özet

İç saç hücrelerini ve afferent işitme siniri liflerini birbirine bağlayan şerit sinapsların kaybı, yaşa bağlı işitme kaybının bir nedeni olarak kabul edilir. Şerit sinapslarının kaybını tespit etmek için en yaygın yöntem immünoetiketlemedir, çünkü bireysel bir kokleadaki çeşitli tonotopik konumlardan kantitatif örneklemeye izin verir. Bununla birlikte, ilgilenilen yapılar kemikli kokleanın derinliklerine gömülüdür. Gerbiller, yaşa bağlı işitme kaybı için bir hayvan modeli olarak kullanılır. Burada, fiksasyon, gerbil koklear bütün montajların immüno-etiketlenmesi, konfokal görüntüleme ve şerit sinaps sayılarının ve hacimlerinin ölçülmesi için rutin protokoller açıklanmaktadır. Ayrıca, değerli yaşlanan bireylerden iyi malzeme elde etmekle ilgili özel zorluklar vurgulanmaktadır.

Gerbiller ötenazi yapılır ve ya kardiyovasküler olarak perfüze edilir ya da timpanik bülleri kafatasından dikkatlice diseke edilir. Koklealar tepe ve tabanda açılır ve doğrudan fiksatif bölgeye aktarılır. İlk yöntemden bağımsız olarak, koklealar sonradan sabitlenir ve daha sonra kireçten arındırılır. Doku daha sonra sinaptik öncesi ve sonrası yapılara ve saç hücrelerine karşı birincil antikorlarla etiketlenir. Daha sonra, kokleae, kendi birincil antikorlarına karşı spesifik olan ikincil floresan etiketli antikorlarla inkübe edilir. Yaşlı gerbillerin kokleaları daha sonra yaşlı hayvanların dokularının tipik olarak önemli arka plan floresansını azaltmak için bir otofloresan söndürücü ile muamele edilir.

Son olarak, koklealar 6-11 segmente ayrılır. Tüm koklear uzunluk, belirli koklear konumların bireyler arasında güvenilir bir şekilde belirlenebileceği şekilde yeniden yapılandırılır. Sırayla elde edilen konfokal görüntü yığınları, seçilen konumlardaki saç hücrelerini ve sinapsları görselleştirmeye yardımcı olur. Konfokal yığınlar deconvolved edilir ve sinapslar ya ImageJ kullanılarak manuel olarak sayılır ya da Matlab'da özel olarak yazılmış görüntü analizi prosedürleri ile sinaptik yapıların daha kapsamlı bir şekilde ölçülmesi gerçekleştirilir.

Giriş

Yaşa bağlı işitme kaybı, 65 yaş ve üstü dünya nüfusunun üçte birinden fazlasını etkileyen, dünyanın en yaygın hastalıklarından biridir¹. Altta yatan nedenler hala tartışılmakta ve aktif olarak araştırılmaktadır, ancak iç saç hücrelerini (IHC'ler) afferent işitme siniri lifleri ile bağlayan özel sinapsların kaybını içerebilir². Bu şerit sinapslar, kendisine bağlı nörotransmitter glutamat ile dolu veziküllerin yanı sıra postsinaptik α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolepropiyonik asit (AMPA) glutamat reseptörleri ^3,4,5 olan pres....

Protokol

Tüm protokoller ve prosedürler, AZ 33.19-42502-04-15/1828 ve 33.19-42502-04-15/1990 izin numaralarıyla Almanya'nın Aşağı Saksonya eyaletinin ilgili makamları tarafından onaylanmıştır. Bu protokol her iki cinsiyetten Moğol gerbilleri (M. unguiculatus) içindir. Genç yetişkin 3-12 aylık yaşı ifade ederken, gerbiller 36 ay ve üstü olarak kabul edilir. Aksi belirtilmediğinde, tamponlar ve çözeltiler hazırlanabilir ve buzdolabında birkaç aya kadar (4-8 ° C) saklanabilir. Kullanmadan önce, tamponların ve çözeltilerin çökelmediğinden emin olun.

1. Fiksasyon ve organ toplama

NOT: Sadece kokleae'ye ....

Sonuçlar

Kokleae, kardiyovasküler perfüzyondan sonra ya tüm hayvanın fiksatif ile hasat edildi ya da hayvanı ötenazi yaptıktan ve daldırma ile sabitlendikten sonra hızla diseke edildi. İkinci yöntemle, IHC'ler diseksiyon sırasında yerinde kalırken, başarısız perfüzyon ve dolayısıyla yetersiz sabit doku durumlarında, duyusal epitel sıklıkla tahrip olmuştur. Yazarların, transkardiyal perfüzyondan sonra kokleaların fiksasyonunun yetersiz olduğu, beynin fiksasyonunun hala yeterli olduğu vakalarla karşıl.......

Tartışmalar

Bu protokolde özetlenen yöntemle, koklealardaki IHC'leri ve sinaptik yapıları genç yetişkin ve yaşlı gerbillerden immüno-etiketlemek, sinaptik öncesi ve sonrası elemanların birlikte lokalizasyonu ile varsayılan fonksiyonel sinapsları tanımlamak, bunları bireysel İHC'lere tahsis etmek ve sayılarını, hacimlerini ve konumlarını ölçmek mümkündür. Bu yaklaşımda kullanılan antikorlar ayrıca dış saç hücrelerini (OHC'ler; myoVIIa) ve presinaptik şeritlerini de etiketledi. Ayrıca, hem IHC'ler.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin Fraction V biotin-free	Carl Roth	0163.2
anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse)	BD Biosciences, Eysins	612044
anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse)	Millipore	MAB39
anti-mouse (IgG1)-AF 488	Molecular Probes Inc.	A21121
anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit)	Proteus Biosciences	25e6790
Blade Holder & Breaker - Flat Jaws	Fine Science Tools	10052-11
Bonn Artery Scissors - Ball Tip	Fine Science Tools	14086-09
Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm	Carl Roth	LH26.1
Disposable Surgical Blade	Henry Schein	0473
donkey anti-rabbit (IgG)-AF647	Life Technologies-Molecular Probes	A-31573
Dumont #5 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Ethanol, absolute 99.8%	Fisher Scientific	12468750
Ethylenediaminetetraacetic acid	Carl Roth	8040.2
Excel	Microsoft Corporation
Feather Double Edge Blade	PLANO	112-9
G19 Cannula	Henry Schein	9003633
goat anti-mouse (IgG2a)-AF568	Invitrogen	A-21134
Heparin	Ratiopharm	N68542.04
Huygens Essentials	Scientific Volume Imaging
ImageJ	Fiji
Immersol, Immersion oil 518F	Carl Zeiss	10539438
Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung)	Braun	4062957E
ISM596D	Ismatec		peristaltic pump
KL 1600 LED	Schott	150.600	light source for stereomicroscope
Leica Application suite X	Leica Microsystem CMS GmbH
Leica TCS SP8 system	Leica Microsystem CMS GmbH
Matlab	The Mathworks Inc.
Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut	Fine Science Tools	14512-17
Mini-100 Orbital-Genie	Scientific Industries	SI-M100	for use in cold environment
Narcoren (pentobarbital)	Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Nikon Eclipse Ni-Ei	Nikon
NIS Elements	Nikon Europe B.V.
Paraformaldehyde	Carl Roth	0335.3
Petri dish without vents	Avantor VWR	390-1375
Phosphate-buffered saline:
Disodium phosphate	AppliChem	A1046
Monopotassium phosphate	Carl Roth	3904.1
Potassium chloride	Carl Roth	6781.1
Sodium chloride	Sigma Aldrich	31434-M
Screw Cap Containers	Sarstedt	75.562.300
Sodium azide	Carl Roth	K305.1
Student Adson Forceps	Fine Science Tools	91106-12
Student Halsted-Mosquito Hemostat	Fine Science Tools	91308-12
Superfrost Adhesion Microscope Slides	Epredia	J1800AMNZ
Triton  X	Carl Roth	3051.2
TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher	Biotium	23007
Vannas Spring Scissors, 3mm	Fine Science Tools	15000-00
Vectashield Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
Vibrax VXR basic	IKA	0002819000
VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic	IKA	953300
Wild TYP 355110 (Stereomicroscope)	Wild Heerbrugg		not available anymore